《生物化学实验》(精)
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５、注意实验室卫生、整洁。废弃液体应倒 入水槽，放水冲走，实验用过的和棉花、废纸、 沉淀废渣及其他废弃物品等均应放入指定容器， 不得随意乱扔或丢进水槽。实验结束后应将实验 台整理好。并清扫、整理实验室。关好水、电、 门、窗，经老师 检查同意后，方可离开实验室。
实验须知
１、实验前应作好预习，认真阅读实验指导。明确学习目标， 能简述实验内容及主要的操作步骤。 ２、实验过程中，应根据实验指导及老师的要求，认真操作， 细心观察，如实记录。严禁捏造实验数据，提倡实事求是的 科学态度，实验做错应要求重做，反对弄虚作假。 ３、实验结束后，要认真书写实验报告，及时交老师批阅。 实验报告包括如下内容：①实验项目、②实验原理、③主要 操作步骤、④实验结果、⑤分析与讨论等。
实验室规则
３、取用试剂时，应仔细辨明标签，以免 取错。取完试剂后，应及时将瓶盖盖好，放回 原处，切忌乱拿乱放，“张冠李戴”。 ４、注意安全，用吸量管吸取试剂时应使 用吸球，严禁用嘴吸取。对于有毒、腐蚀的试 剂更应注意，应避免其直接接触人体及衣物。 乙醚、丙酮等易燃试剂应远离火源，以免发生 意外。
实验室规则
以A550（取两组测定的平均值）为纵坐标，蛋白质浓度为横坐标，绘制 标准曲线。
0 0
0.33 0.023
0.67 0.043
1 0.065
1.33 0.082
1.67 0.11
0.12 0.1 0.08
y = 0.0641x + 0.0004 R 2 = 0.9972
A550
0.06 0.04 0.02 0 0 0.5 1 1.5 蛋白质浓度（mg/mL） 2
三、结果计算
测得蛋白质的毫克数
蛋白质含量（%）= 鲜样重
×
100
1000
思考题
1、干扰本实验的因素有哪些？ 2、简述蛋白质的呈色反应？ 3、试比较凯氏定氮法和比色法的优缺点？
实验2: 维生素C的测定
2,6—二氯酚靛酚滴定法
一、实验原理：
维生素C（抗坏血酸）具有很强的还原性。 还原型抗坏血酸能将染料2.6-二氯酚靛酚还原成无色的 2.6-二氯酚靛酚，本身则氧化为脱氢抗坏血酸。 在中性或碱性溶液中，氧化型2.6-二氯酚靛酚呈蓝色；在 酸性溶液中呈红色，被还原后变无色，因此，当用2.6-二 氯酚靛酚滴定样品中还原型抗坏血酸时，在抗坏血酸尚未 全部被氧化时，滴下的2.6-二氯酚靛酚立即被还原成无色。 当抗坏血酸全部被氧化后，则滴下的染料立即使溶液呈淡 红色，即为终点。
《生物化学实验》
周小慧
实验室规则
１、自觉遵守学习纪律，保持实验室肃静， 不得喧哗吵闹、迟到早退，更不得缺席。 ２、爱护仪器，厉行节约。试剂、药品、 蒸馏水等应节约使用，不得浪费。如不慎损坏 仪器，应及时报告老师，说明原因，经老师同 意后，方可换领。并应按规定赔偿或处理。贵 重、精密仪器，应先熟悉使用方法，在老师的 指导下，严格按操作规程操作，发现故障，应 立即报告老师，不得擅自处理。
Cl |
O=
实验原理
O =C
| HO— C ‖ HO— C | H— C | HO— CH | CH2OH
| Cl Cl |
=N
—
—
O-
氧化型2.6-二氯酚靛酚（蓝色） H+ OH-
O
还原型 抗坏血酸
O=
百度文库| Cl Cl |
=N
—
—
OH
氧化型2.6-二氯酚靛酚 （红色）
O =C
脱氢 抗坏血酸
| O=C | O=C | H— C | HO— CH | CH2OH
实验报告
实验报告包括如下内容： １、实验项目 ２、实验原理 ３、主要操作步骤 4、实验结果 5、分析与讨论等
实验项目
实验1:改良双缩脲试剂测定种子蛋白质含量 实验2:维生素C的测定 实验3:鞣质含量的测定(络合滴定法) 实验4:植物组织中过氧化物酶活性的测定 实验5:淀粉的分离制备与净化 实验6:总淀粉量的测定 实验7:糖苷的提取、分离、精制与检识 实验8: Cytc的制备及测定
实验1: 改良双缩脲试剂测定种子蛋白质含量
一、实验原理：
具有两个或两个以上肽键的化合物皆有双缩脲 反应，因此蛋白质在碱性溶液中，也能与Cu2+ 形成紫红色络合物，颜色深浅与蛋白质浓度成 正比，故可用来测定蛋白质的浓度。 加热 紫红色
蛋白质或多肽
稀碱溶液 CuSO4
二、操作步骤
1、
1、制作标准曲线：取 12支干试管，编号，按下表平行操
二、操作步骤
2.滴定
① 2.6-二氯酚靛酚的标定
准确吸取标准抗坏血酸溶液1.0mg（含0.1mg抗坏血酸） 置100ML三角瓶中，加9ML1%草酸微量滴定管以0.02% 2.6-二氯酚靛酚滴定至淡红色，并保存15秒钟即为终点， 这样便可算出1ml染料相当于抗坏血酸的mg数（T）。
每ml标准液抗坏血酸的mg数×所取ml数
O
HO —
| Cl
—
N
—
—
| H 还原型2.6-二氯酚靛酚
（无色）
OH
二、操作步骤
1.提取： 洗净待测材料,吸干表面水分，然后称取0.5g，加2%草 酸200ML（抑制抗坏血酸氧化酶），在高速组织捣碎机 中打成匀浆。称取浆状物5.0g，放入小烧杯中，然后转 入50ML容量瓶中，以2%草酸洗净烧杯，并定容至刻度， 充分摇动，然后静置10分钟，过滤于50ML三角瓶中（最 初数毫升滤液弃去）滤液保留备用（如浆状物泡沫很多 可以加数滴辛醇或丁醇）。
0 1 2 3 4 5
作。
标准蛋白液 /mL 蒸馏水 /mL 双缩脲试剂 /mL
0 0.4 0.8 1.2 1.6 2.0 2.0 1.6 1.2 0.8 0.4 0 10.0 10.0 10.0 10.0 10.0 10.0 摇匀，置40℃水浴中保温15min，然后以0号试管为空白对照，在550nm处 比色 A550 蛋白质浓度mg/ mL
二、操作步骤
1、 样品测定
将板栗剥壳去皮，剪碎→称0.3g两份研成浆状→加2ml AUC溶液，反复研磨抽提10分钟→转入试管中，并用10ml 双缩脲洗研钵，一并转入试管摇匀→置40℃水浴中保温 15分钟→棉花过滤→去渣，滤液澄清透明（V滤液 = ），测A550→从标准曲线上求得测定样品蛋白质 的浓度，计算测定样品中蛋白质的毫克数。
实验须知
１、实验前应作好预习，认真阅读实验指导。明确学习目标， 能简述实验内容及主要的操作步骤。 ２、实验过程中，应根据实验指导及老师的要求，认真操作， 细心观察，如实记录。严禁捏造实验数据，提倡实事求是的 科学态度，实验做错应要求重做，反对弄虚作假。 ３、实验结束后，要认真书写实验报告，及时交老师批阅。 实验报告包括如下内容：①实验项目、②实验原理、③主要 操作步骤、④实验结果、⑤分析与讨论等。
实验室规则
３、取用试剂时，应仔细辨明标签，以免 取错。取完试剂后，应及时将瓶盖盖好，放回 原处，切忌乱拿乱放，“张冠李戴”。 ４、注意安全，用吸量管吸取试剂时应使 用吸球，严禁用嘴吸取。对于有毒、腐蚀的试 剂更应注意，应避免其直接接触人体及衣物。 乙醚、丙酮等易燃试剂应远离火源，以免发生 意外。
实验室规则
以A550（取两组测定的平均值）为纵坐标，蛋白质浓度为横坐标，绘制 标准曲线。
0 0
0.33 0.023
0.67 0.043
1 0.065
1.33 0.082
1.67 0.11
0.12 0.1 0.08
y = 0.0641x + 0.0004 R 2 = 0.9972
A550
0.06 0.04 0.02 0 0 0.5 1 1.5 蛋白质浓度（mg/mL） 2
三、结果计算
测得蛋白质的毫克数
蛋白质含量（%）= 鲜样重
×
100
1000
思考题
1、干扰本实验的因素有哪些？ 2、简述蛋白质的呈色反应？ 3、试比较凯氏定氮法和比色法的优缺点？
实验2: 维生素C的测定
2,6—二氯酚靛酚滴定法
一、实验原理：
维生素C（抗坏血酸）具有很强的还原性。 还原型抗坏血酸能将染料2.6-二氯酚靛酚还原成无色的 2.6-二氯酚靛酚，本身则氧化为脱氢抗坏血酸。 在中性或碱性溶液中，氧化型2.6-二氯酚靛酚呈蓝色；在 酸性溶液中呈红色，被还原后变无色，因此，当用2.6-二 氯酚靛酚滴定样品中还原型抗坏血酸时，在抗坏血酸尚未 全部被氧化时，滴下的2.6-二氯酚靛酚立即被还原成无色。 当抗坏血酸全部被氧化后，则滴下的染料立即使溶液呈淡 红色，即为终点。
《生物化学实验》
周小慧
实验室规则
１、自觉遵守学习纪律，保持实验室肃静， 不得喧哗吵闹、迟到早退，更不得缺席。 ２、爱护仪器，厉行节约。试剂、药品、 蒸馏水等应节约使用，不得浪费。如不慎损坏 仪器，应及时报告老师，说明原因，经老师同 意后，方可换领。并应按规定赔偿或处理。贵 重、精密仪器，应先熟悉使用方法，在老师的 指导下，严格按操作规程操作，发现故障，应 立即报告老师，不得擅自处理。
Cl |
O=
实验原理
O =C
| HO— C ‖ HO— C | H— C | HO— CH | CH2OH
| Cl Cl |
=N
—
—
O-
氧化型2.6-二氯酚靛酚（蓝色） H+ OH-
O
还原型 抗坏血酸
O=
百度文库| Cl Cl |
=N
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—
OH
氧化型2.6-二氯酚靛酚 （红色）
O =C
脱氢 抗坏血酸
| O=C | O=C | H— C | HO— CH | CH2OH
实验报告
实验报告包括如下内容： １、实验项目 ２、实验原理 ３、主要操作步骤 4、实验结果 5、分析与讨论等
实验项目
实验1:改良双缩脲试剂测定种子蛋白质含量 实验2:维生素C的测定 实验3:鞣质含量的测定(络合滴定法) 实验4:植物组织中过氧化物酶活性的测定 实验5:淀粉的分离制备与净化 实验6:总淀粉量的测定 实验7:糖苷的提取、分离、精制与检识 实验8: Cytc的制备及测定
实验1: 改良双缩脲试剂测定种子蛋白质含量
一、实验原理：
具有两个或两个以上肽键的化合物皆有双缩脲 反应，因此蛋白质在碱性溶液中，也能与Cu2+ 形成紫红色络合物，颜色深浅与蛋白质浓度成 正比，故可用来测定蛋白质的浓度。 加热 紫红色
蛋白质或多肽
稀碱溶液 CuSO4
二、操作步骤
1、
1、制作标准曲线：取 12支干试管，编号，按下表平行操
二、操作步骤
2.滴定
① 2.6-二氯酚靛酚的标定
准确吸取标准抗坏血酸溶液1.0mg（含0.1mg抗坏血酸） 置100ML三角瓶中，加9ML1%草酸微量滴定管以0.02% 2.6-二氯酚靛酚滴定至淡红色，并保存15秒钟即为终点， 这样便可算出1ml染料相当于抗坏血酸的mg数（T）。
每ml标准液抗坏血酸的mg数×所取ml数
O
HO —
| Cl
—
N
—
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| H 还原型2.6-二氯酚靛酚
（无色）
OH
二、操作步骤
1.提取： 洗净待测材料,吸干表面水分，然后称取0.5g，加2%草 酸200ML（抑制抗坏血酸氧化酶），在高速组织捣碎机 中打成匀浆。称取浆状物5.0g，放入小烧杯中，然后转 入50ML容量瓶中，以2%草酸洗净烧杯，并定容至刻度， 充分摇动，然后静置10分钟，过滤于50ML三角瓶中（最 初数毫升滤液弃去）滤液保留备用（如浆状物泡沫很多 可以加数滴辛醇或丁醇）。
0 1 2 3 4 5
作。
标准蛋白液 /mL 蒸馏水 /mL 双缩脲试剂 /mL
0 0.4 0.8 1.2 1.6 2.0 2.0 1.6 1.2 0.8 0.4 0 10.0 10.0 10.0 10.0 10.0 10.0 摇匀，置40℃水浴中保温15min，然后以0号试管为空白对照，在550nm处 比色 A550 蛋白质浓度mg/ mL
二、操作步骤
1、 样品测定
将板栗剥壳去皮，剪碎→称0.3g两份研成浆状→加2ml AUC溶液，反复研磨抽提10分钟→转入试管中，并用10ml 双缩脲洗研钵，一并转入试管摇匀→置40℃水浴中保温 15分钟→棉花过滤→去渣，滤液澄清透明（V滤液 = ），测A550→从标准曲线上求得测定样品蛋白质 的浓度，计算测定样品中蛋白质的毫克数。