第六章固定化酶和固定化活性细胞资料
第六讲 酶与细胞的固定化技术
2、固定化酶的特点
★优点：
①在大多数情况下，酶的稳定性提高，使用寿命延长 ②酶可以再生利用，利用效率提高，产物得率提高，成本低 ③实现连续化、自动化生产操作 ④反应过程可以严格在线控制，以实现最优化控制 ⑤得到的产品高纯度、高产量
★缺点
①在进行酶固定化时，酶活力有一定的损失且工厂初始投资大 ②只能用于可溶性小分子底物，而对大分子底物不适宜 ③与完整细胞比较，不适于多酶反应
③二级乳化法
• 酶溶液先在高聚物(乙基纤维素、聚苯乙烯等)有 机相中乳化分散，乳化液再在水相中分散形成次 级乳化液，当有机高聚物溶液固化后，每个固体 球内包含着多滴酶液。
★特点：
制备比较容易，但膜比较厚，会影响底物扩散。
④脂质体包埋法
• 采用双层脂质体形成的极细球粒包埋酶。
将卵磷脂、胆甾醇和二鲸蜡磷酸酯(7：2：1)溶 于三氯甲烷中，加入酶液，混合物在旋转蒸发器 中，于氮气下32℃转动乳化，然后在室温下放置 2h，再在氮气流中4℃处理10s，室温下静置2h， 过Sepharose 68柱，可分离得到含有酶的微胶囊。
★缺点：
只适合作用于小分子底物和产物的酶 在发生化学聚合反应时包埋酶易失活，必须巧妙设计反应条件 扩散阻力会导致固定化酶动力学行为改变而降低酶活力
• 根据载体材料和方法的不同可分为网格型和微囊型。
(1)网格型包埋法
• 将酶或微生物菌体包埋在高分子凝胶细网格中称 为网格型包埋法。 ★载体材料有两类：
②界面聚合法
• 利用亲水性单体和疏水性单体在界面发生聚合形 成半透膜，将酶包埋于半透膜微囊中。
★在包埋过程中由于发生化学反应会引起酶失活。
例如，将含血红蛋白的酶溶液与1，6一己二胺水溶液混 合，立即在氯仿一环己烷中分散乳化，加入溶于有机相 的癸二酰氯后，便在油一水界面上发生聚合反应，形成 尼龙膜，将酶包埋。除尼龙膜外还有聚酰胺、聚脲等形 成的微囊。此法制备的微囊大小可以随乳化剂浓度和乳 化时的搅拌速度而自由控制，制备过程所需时间非常短。
固定化酶和固定化细胞的制作方法
固定化酶的制作方法固定化酶的方法主要有吸附法、包埋法、共价结合法、共价交联法、结晶法(一)、吸附法吸附法是通过载体表面和酶分子表面间的次级键相互作用而达到固定目的的方法。
只需将酶液与具有活泼表面的吸附剂接触，再经洗涤除去未吸附的酶便能制得固定化酶。
是最简单的固定化技术，在经济上也最具有吸引力.物理吸附法(physical adsorption)是通过氢键、疏水键等作用力将酶吸附于不溶性载体的方法。
常用的载体有：高岭土、皂土、硅胶、氧化铝、磷酸钙胶、微空玻璃等无机吸附剂，纤维素、胶原以及火棉胶等有机吸附剂。
离子结合法(ion binding)是指在适宜的pH和离子强度条件下，利用酶的侧链解离基团和离子交换基间的相互作用而达到酶固定化的方法（离子键）。
最常用的交换剂有CM-纤维素、DEAE-纤维素、DEAE-葡聚糖凝胶等；其他离子交换剂还有各种合成的树脂如Amberlite XE-97、Dowe X-50等。
离子交换剂的吸附容量一般大于物理吸附剂。
影响酶蛋白在载体上吸附程度的因素:1. pH：影响载体和酶的电荷变化,从而影响酶吸附。
2. 离子强度：多方面的影响，一般认为盐阻止吸附。
3. 蛋白质浓度：若吸附剂的量固定，随蛋白质浓度增加，吸附量也增加，直至饱和。
4. 温度：蛋白质往往是随温度上升而减少吸附。
5. 吸附速度：蛋白质在固体载体上的吸附速度要比小分子慢得多。
6. 载体：对于非多孔性载体，则颗粒越小吸附力越强。
多孔性载体，要考虑吸附对象的大小和总吸附面积的大小。
吸附法的优点：操作简单，可供选择的载体类型多，吸附过程可同时达到纯化和固定化的目的，所得到的固定化酶使用失活后可以重新活化和再生。
吸附法的缺点：酶和载体的结合力不强，会导致催化活力的丧失和沾污反应产物；经验性强。
（二）、包埋法包埋法是将酶物理包埋在高聚物网格内的固定化方法。
(如将聚合物的单体和酶溶液混合后，再借助聚合促进剂的作用进行聚合，将酶包埋于聚合物中以达到固定化的目的）。
固定化酶与固定化细胞技术
固定化酶与固定化细胞技术酶是具有生物催化功能的生物大分子(蛋白质或RNA)，但通常指的是由氨基酸组成的酶，本章也仅探讨此类酶。
作为一种生物催化剂，参与生物体内各种代谢反应，而且反应后其数量和性质不发生变化。
由于酶的高级结构对环境十分敏感，各种因素(包括物理因素、化学因素和生物因素)均有可能使酶丧失活力。
但在常温常压条件下能高效地进行反应，且具有很高的专一性，副反应少，许多难以进行的有机化学反应在酶的作用下都能顺利进行。
由于酶的这些特点，大大促进了酶的应用和酶技术的研究。
酶被人们广泛应用于酿造、食品、医药等领域，特别是近几年来，随着分子生物学的发展，酶的应用更加活跃。
由于酶反应随着时间的延长，反应速度会逐渐降低，反应后酶不能回收，这就限制了酶的应用范围。
如果能将酶固定在惰性支持物上制成固定化酶，仍具有催化作用，还能回收反复使用，并且生产可以连续化、自动化。
从20世纪60年代固定化酶技术发展以来，不仅在酶学理论研究中发挥独特作用，在实际应用中也显示出强大的威力。
随着技术的不断发展，广义的固定化酶发展到固定化辅酶、固定化细胞及固定化细胞器等，固定化酶在食品、医药、化工和生物传感器制造上都有成功的应用实例。
对一个特定的目的和过程来说，是采用细胞，还是采用分离后的酶作催化剂，要根据过程本身来决定。
一般来说，对于一步或两步的转化过程用固定化酶较合适；对多步转换，采用固定化细胞显然有利。
第一节固定化酶固定化酶(immobilized enzyme)是指在一定空间内呈闭锁状态存在的酶，能连续地进行反应，反应后的酶可以回收重复使用。
酶的固定化是将酶与水不溶性载体结合，制备固定化酶的过程。
固定化酶的形状依不同用途有颗粒、线条、薄膜和酶管等，颗粒状占绝大多数；颗粒和线条主要用于工业发酵生产；薄膜主要用于酶电极；酶管机械强度较大，主要用于化学工业生产。
目前，由于固定化酶的性质比游离酶及其相关技术优越，人们对其极感兴趣，因此固定化酶的应用也与日俱增。
酶工程 第六章
第二节 酶和菌体固定化
用离子键结合法制备的固定化酶，活力损失较少。但 由于通过离子键结合，结合力较弱，酶与载体的结合不牢 固，在pH值和离子强度等条件改变时，酶容易脱落。所以 用离子结合法制备的固定化酶，在使用时一定要严格控制 好pH值、离子强度和温度等操作条件。 (2)共价健结合法：通过共价键将酶与载体结合的固定化 方法称为共价键结合法。 共价键结合法所采用的载体主要有：纤维素、琼脂糖 凝胶、葡聚糖凝胶、甲壳质、氨基酸共聚物、甲基丙烯醇 共聚物等。 酶分子中可以形成共价键的基团主要有：氨基、羧基、 巯基．羟基、酚基和咪唑基等。
第二节 酶和菌体固定化
此外迭氮基团还可以与酶分子中的羟基、巯基等反应， 而制成固定化酶
第二节 酶和菌体固定化
③溴化氰法：含有羟基的载体，如纤维素、琼脂糖凝 胶、葡聚糖凝胶等，可用溴化氰活化生成亚氨基碳酸衍生 物：
活化载体上的亚氨碳酸基团在微碱性的条件下，可与 酶分子上的氨基反应，制成固定化酶。
第二节 酶和菌体固定化
第二节 酶和菌体固定化
亚硝酸可由亚硝酸钠和盐酸反应生成
第二节 酶和菌体固定化
载体活化后，活泼的重氮基团可与酶分子中的酚基或 咪唑基发生偶联反应而制得固定化酶。
第二节 酶和菌体固定化
②迭氮法：含有酞肼基团的载体可用亚硝酸活化，生 成迭氮化合物。例如：羧甲基纤维素的酰肼衍生物可与亚 硝酸反应生成羧甲基纤维素的迭氮衍生物。其反应式如下：
酶工程
第六章 酶与细胞固定化
第一节 酶固定化
随着酶学研究的不断深入和酶工程的发展，工业化生 产的酶越来越多，酶的应用越来越广泛。现在酶在食品、 轻工、医药、化工、分析检测、环境保护和科学研究等方 面的应用均已取得了显著的成效。然而在使用酶的过程中， 人们也注意到酶的一些不足之处。例如： (1) 酶的稳定性较差，在温度、pH值和无机离子等外 界因素的影响下，容易变性失活。 (2) 酶一般都是在水溶液中与底物反应，这样酶在反 应系统中，与底物和产物混在一起，反应结束后，即使酶 仍有较高的活力，也难于回收利用。这种一次性使用酶的 方式，不仅使成本较高，而且难于连续化胶、角叉菜胶、 明胶等天然凝胶以及聚丙烯酰胺凝胶、光交联树脂等合成 凝胶。天然凝胶在包埋时条件温和，操作简便，对酶活性 影响甚少，但强度较差。而合成凝胶的强度高，对温度、 pH值变化的耐受性强，但需要在一定的条件下进行聚合反 应，才能把酶包埋起来。在聚合反应过程中往往会引起部 分酶的变性失活，应严格控制好包埋条件。 酶分子的直径一般只有几十埃，为防止包埋固定化后 酶从疑胶中泄漏出来，凝胶的孔径应控制在小于酶分子直 径的范围内，这样对于大分子底物的进入和大分子产物的 扩散出去都是不利的。所以凝胶包埋法不适用于那些底物 或产物分子很大的酶类的固定化。而在细胞固定化中，凝 胶包理法是应用最广的方法。各种凝胶由于特性不同，它 们的具体包理方法和包埋条件也不一样，有关内客将在本 章第二节中阐述。
固定化酶ppt课件
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酶固定化方法选择依据：
（1） 酶的性质 （2） 载体的性质 （3） 制备方法的选择
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四、辅酶固定化
原因
有机辅因子中具有某些特殊的化学基团，参与酶的催化 反应
有机辅因子在使用过程中要流失，并且不能自行再生 有机辅因子价格昂贵
——工业上应用全酶的关键是有机辅因子的保留和再生
•可以形成共价键的基团： 游离氨基， 游 离羧基， 巯基， 咪唑基， 酚基， 羟基， 甲硫基， 吲哚基，二硫键
•常用载体：天然高分子、人工合成的高聚 物、无机载体
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共价键结合法制备固定化酶的“通式”
1. 载体上引进活泼基团 2. 活化该活泼基团 3. 此活泼基团再与酶分子上某一基团形
成共价键
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优点： 固定化时酶分子的构象很少
或基本不发生变化。
缺点： 结合力弱，易解吸附。
载体： 纤维素、琼脂糖、活性炭、
沸石及硅胶等。
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II 离子结合法
酶分子与含有离子交换基团的固相载 体相结合
第一个离子结合法固定化酶： DEAE — Cellulose 固定化过氧化氢酶
第一个工业化的固定化酶： DEAE-Sephadex A-50 固定化氨基酰化酶
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
=6*106IU
2.酶比活定义（游离）：每毫克酶蛋白或酶RNA（DNA)所具有的 酶活力单位
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固定化酶的指标：
1. 固定化酶的比活：每（克）干固定化酶所具有的
酶活力单位。 或：单位面积（cm2）的酶活力单位表示（酶膜、酶管、
酶板）。
2. 操作半衰期：衡量稳定性的指标。
连续测活条件下固定化酶活力下降为最初活力一半所需 要的时间（t1/2）
第六讲固定化酶技术
OH R OH
CNBr
OC N R OH
R
OCONH2 R OH
O C=NH O 亚氨碳 酸酯衍生物
氨基 甲酸衍生物
NH O R C NH E O R O 亚氨碳 酸酯衍生物 C=N E R O
O C NH E
OH 异脲型 衍生物
OH 氨基 甲酸酯衍生 物
溴化氰法
对于纤维素载体等多糖
直接在糖环上固定酶可能导致固定和传质阻力大； 直接在糖环上固定酶可能导致固定和传质阻力大； 在碱性条件下可接枝一个柔性手臂进行改善； 在碱性条件下可接枝一个柔性手臂进行改善； 与β-硫酸酯乙砜基苯胺(SESA)反应，生成对氨基苯磺 硫酸酯乙砜基苯胺(SESA)反应， (SESA)反应 酰乙基纤维素（ABSE-纤维素），再重氮化偶联。 酰乙基纤维素（ABSE-纤维素），再重氮化偶联。 ），再重氮化偶联 接枝氨基酸的交联壳聚糖微球与酶反应， 接枝氨基酸的交联壳聚糖微球与酶反应，接入亲水柔 性手臂。 性手臂。
第六讲
固定化酶技术
酶催化具有效率高、专一性强、速度快等优点。 酶催化具有效率高、专一性强、速度快等优点。 但是，酶是蛋白质，分离纯化过程复杂、稳定性差， 但是，酶是蛋白质，分离纯化过程复杂、稳定性差，不 能反复使用，价格较昂贵。 能反复使用，价格较昂贵。 目前，酶主要在医药、 目前，酶主要在医药、食品及高附加值化工产品上广泛 应用，其它领域则相对较少。 应用，其它领域则相对较少。 为扩大酶的应用范围并降低成本， 为扩大酶的应用范围并降低成本，有效的途径是实现酶 的多次使用或直接使用细胞； 的多次使用或直接使用细胞；固定化酶技术就是在这种 思路下发展起来的。 思路下发展起来的。
⑶共价结合法
利用酶与载体形成共价键固定酶 此法载体与酶结合牢固、半衰期长。 此法载体与酶结合牢固、半衰期长。 形成共价键的反应剧烈，常常引起酶蛋白高级 形成共价键的反应剧烈， 结构发生变化，因此酶活力回收一般较低。 结构发生变化，因此酶活力回收一般较低。