抗菌肽的研究进展及展望

抗菌肽的研究进展 王亮 赵协 常维山 山东农业大学动物科技学院 摘要：具有广谱高效杀菌活性的小分子多肽类物质———抗菌肽,是机体非特异性免疫系统的重要组成部分。在动植物体内分布广泛, 是天然免疫防御系统的一部分。据研究表明,抗菌肽对细菌、部分真菌、原虫、病毒、肿瘤细胞都具有杀伤作用。从目前国内外在抗菌肽研究热点着手,分析阐述了抗菌肽的分类、作用机理、抗菌肽基因工程,及抗菌肽在农业、畜牧业中的应用,并对微生物针对杭菌肤的耐药性进行了简单讨论。

关键词：抗菌肽;基因工程;耐受性；作用机理；阳离子抗菌肽。 抗菌肽(Antibacterial pep tide)是生物细胞特定基因编码、经特定外界条件诱导产生的一类多肽,具有相对分子质量小、热稳定、杀菌范围广、作用机制独特等特点,不仅对细菌、真菌、病毒、支原体、衣原体、螺旋体及一些活性细胞有杀伤活性, 还在免疫调节、激素调节及刺激伤口愈合等方面有重要作用。随着抗生素的大量使用，耐药性的问题越来越严重，寻找合适的活性物质来替代抗生素是解决这一问题最有效的途径。抗菌肽具有水溶性好、热稳定、广谱抗菌及不易引起病原产生耐药性等优点,是理想的抗生素替代品。笔者就目前国内外对抗菌肽的研究及抗菌肽在农业中的应用综述如下。 1 发展历程 1975年瑞典科学家G.Boman等人[2]等从惜古比天蚕(Hyatophoracecropia)蛹中诱导分离得到一种杀菌肽,并将其命名为cecropin。此后,许多抗菌肽相继被分离、纯化。一些抗菌肽的氨基酸一级结构和基因序列得到确定。80年代,有关抗菌肽的研究主要集中在大型的经济昆虫。90年代以来,在继续对大型经济昆虫进行研究的同时,又扩展到一些小型昆虫和其它无脊椎及脊椎动物,抗菌肽已成为免疫学和分子生物学研究的热点。2007年3月,中国科学院昆明动物研究所在动物来源的抗菌肽研究方面取得重要进展。研究小组在单个两栖动物个体中发现了107种新型的抗菌肽类似多肽，占全世界已知抗菌肽总数的10%左右,并克隆了372条抗菌肽基因，分属于30个不同的多肽家族,是目前世界上发现的最丰富的抗菌肽资源。抗菌肽是一类很难导致微生物耐药性的新型抗感染药物多肽，目前世界上已知的抗菌肽共有1200多种。 2 抗菌肽的分类 根据抗菌肽的结构，可将其分为5类：(1)单链无半胱氨酸残基的α-螺旋，或由无规卷曲连接的两段α-螺旋组成的肽；(2)富含某些氨基酸残基但不含半胱氨酸残基的抗菌肽；(3)含1个二硫键的抗菌多肽；(4)有2个或2个以上二硫键、具有β-折叠结构的抗菌肽；(5)由其它已知功能的较大的多肽衍生而来的具有抗菌活性的肽。其中最早分离到的Cecropins和从非洲爪蟾中分离到的Magainins等属于第一类抗菌肽，通常也将其称为Cecropin类抗菌肽，目前对此类抗菌肽的研究也较深入。 3 抗菌肽的作用及机理 抗菌肽作用机理的研究主要集中在抗菌肽与质膜的相互作用的问题上。抗菌肽与细胞膜的作用大致分为两类:破坏膜结构的作用和非破坏膜结构的作用。其中,阳离子性抗菌肽与革兰氏阴性菌细胞膜的作用过程研究的较为透彻。研究表明,抗菌肽与革兰氏阴性菌细胞膜的相互作用始于抗菌肽与LPS 结合并引起细菌外膜结构改变,进而与内膜结合形成通道,改变膜的通透性并引起呼吸相关的质子运动力的下降和新陈代谢的丧失,最终影响生物大分子的合成[12 ] 。由于抗菌肽对细菌细胞壁的透过能力不同,因而,不同抗菌肽及同一抗菌肽对不同细菌的最小致死浓度也有很大不同。 3.1 胞膜攻击作用 首先,抗菌肽分子通过静电作用结合于细胞膜带负电荷的磷脂双层，使磷脂双层局部变薄；然后在细胞膜电势的作用下，抗菌肽分子的疏水部分插入细胞膜，而其两性分子α - 螺旋插入膜内，多个抗菌肽分子共同形成离子通道，使膜通透化；最终改变细胞膜的通透性及细胞能量状态，导致细胞膜去极化，呼吸作用受到抑制以及细胞A T P 含量严重下降，导致靶细胞死亡。 3.2 线粒体攻击作用 当抗菌肽MUC7 作用于细菌时，在其超微结构中发现线粒体出现肿胀、空泡化、嵴脱落、内容物溢出等现象，因此认为MUC7 等抗菌肽的作用机制可能与抑制细胞呼吸有关。 3.3 对染色体的破坏作用 此类抗菌肽并不破坏膜结构，而是穿过细胞膜或核膜使肿瘤细胞的DNA 发生断裂从而引起细胞死亡。 3.4 癌细胞骨架的断裂作用 肿瘤细胞的细胞骨架系统发育不完善，抗菌肽可以插入到细胞质膜，使细胞的双分子层发生溶解、微管崩解, 破坏肿瘤细胞骨架的完整性。而真核生物细胞膜富含膜蛋白和胆固醇，特别是胆固醇的存在维持了细胞膜的稳定性，因此对哺乳动物正常的细胞破坏作用不明显。另外，哺乳动物细胞中微丝、微管和质膜内层存在许多结合位点，这种高度发达的细胞骨架结构抵抗抗菌肽的破坏作用。 3.5 其他作用机制 通过荧光免疫法和Western 印迹杂交法研究发现，抗菌肽可以促进凋亡相关蛋白及其配体的表达，通过诱导细胞凋亡杀死肿瘤细胞。在抗菌肽抑制病毒的繁殖与扩散的研究中发现，抗菌肽可以从核酸的复制、转录、翻译病毒颗粒包装等全过程抑制细胞内病毒的复制。另外某些酶也是抗菌肽的作用靶标。 4 抗菌肽的基因工程 4.1 天然抗菌肽基因的克隆及表达 迄今为止,多种抗菌肽基因已经被克隆并成功表达。如抗菌肽Magainin 在酵母中成功表达,重组抗菌肽sacotoxin IA 在大肠杆菌细胞中获得表达,天蚕抗菌肽A 在昆虫系统中得到表达。另外,朱嘉明等将天蚕抗菌肽A 与蜂毒肽杂合肽基因转入大肠杆菌中进行了表达。国内外众多研究者在天然抗菌肽基因的克隆及表达方面硕果累累。 4.2 抗菌肽基因的设计及人工合成 生物技术的发展及对抗菌肽抗菌理化性质和抗菌机制研究的不断深入,使人工设计并合成具有高效抗菌活性的抗菌肽基因成为可能。人工设计合成的抗菌肽应具有两亲结构和正电荷。Antonio 等人通过对抗菌肽aprotinin 的第18～39位氨基酸残基的序列进行重新设计,得到了一系列具有不同特性的新型抗菌肽 ; Thennarasu 等人合成的防御素类抗菌肽也表现出较强的抗菌活性 ; 郑青等将人工合成的杂合抗菌肽AD 基因克隆到大肠杆菌- 酵母穿梭质粒pCLWA上,转化酵母宿主菌AB103 ,活性蛋白PAGE 和琼脂孔穴扩散法测定活性,结果表明AD 基因在酵母中得到了表达。人工设计并合成抗菌肽基因已经成为目前筛选新型抗菌肽的主要手段 5 抗菌肽的应用前景 5.1 抗菌肽在农业中的应用 5.1.1 作物品种的改良 植物病害多达数百种,几乎所有作物在生长期内都会遭到不同程度的危害,培育抗病新品种是防治植物病害的根本途径。（1）抗菌肽基因在模式植物烟草和马铃薯中的表达。（2）转抗菌肽基因水稻植株的获得。（3）转有抗菌肽基因的其他植物。 5.2 用于动物育种及饲料的开发 5.2.1 转基因动物的研究。转基因动物研究方面主要集中在提高动物的抗病能力和传染病防治。 5.2.2 抗菌肽在饲料工业中的应用。高等动物肠道内的抗菌肽能抑制外源性病原菌,而对动物肠道存在的正常菌群和动物细胞无杀伤作用。虽然肠源抗菌肽有选择性杀伤病原菌的优点,但其在动物体内的表达分泌量却十分有限。应用基因工程手段大量生产动物专一性抗菌肽,并将其用作饲料添加剂,可以使饲养动物对外源病原菌入侵具有更好的抵抗能力。 5.2.3 阳离子抗菌肽阳离子抗菌肽是一类带正电荷的抗菌肽,存在于多种生物体中,在宿主天然免疫中有重要作用。动物受到大量病原物攻击时,特异性免疫系统需要在细胞系的扩增和免疫反应中区分自我与非我,且反应速度较慢,不足以及时保护机体免受病原物的侵染。而抗菌肽诱导反应的结果是广谱抗微生物反应,无自我和非我之区分,甚至数分钟内即可发生。动物的抗菌肽较容易在直接与环境病原物接触的部分发现,它们参与构成反应迅速的第一道防线。此外，阳离子抗菌肽与传统抗生素有协同效应。观察到多价阳离子抗菌肽magainin Ⅱ与beta-内酰胺类抗生素的协同作用、Pleurocidin 与D-环丝氨酸存在着协同作用。Scott 等发现抗菌活性强的抗菌肽与传统抗生素的协同性较弱,抗菌活性弱的抗菌肽与传统抗生素的协同性较强。单个动物可以同时表达序列和结构不同的多种阳离子抗菌肽,这些不同结构的抗菌肽之间也可能存在协同效应。

6 研究展望及存在问题 抗菌肽是哺乳动物防御系统的一个重要组成部分,具有热稳定、水溶性好、广谱杀菌甚至有的能杀真菌、原虫等优点,而且许多抗菌肽在100℃加热10min条件下仍能保持一定活力,且对较大的离子强度和较低或较高的ｐＨ都有较强的抗性,而对真核细胞几乎无作用,仅作用于原核细胞和发生病变的真核细胞,并且与抗生素通过阻断大分子生物合成的作用机制完全不同,病源菌不易对其产生耐药性,由此显示了它具有独特的研究和应用价值。近20年来,人们对昆虫抗菌肽已进行了比较系统的理论和应用研究,但有关畜禽抗菌肽基因工程应用研究方面的报道较少。从哺乳动物抗菌肽特有的性质,显示了它具有以下几个方面在畜牧生产上的研究和应用前景。研究展望及存在问题 6.1药用前景 随着传统抗生素的广泛及长期的应用,许多病源菌对它们产生了耐药性,而具有广谱抗菌且有独特的抗菌机制的抗菌肽显然在这方面的应用研究中具明显优势。随着对抗菌肽结构与活性的关系、抗菌肽作用机制及其基因表达调控机制认识的不断深化,设计一种高效的、有利于人类健康的抗菌肽作抗生素替代品是完全可行的。若想将抗菌肽最终开发为具有实用价值的抗菌药物,其抗菌活性的提高以及对于哺乳动物细胞的毒性的降低是首先需要解决的问题。已有的对于抗菌肽作用机制的研究为此提供了强大的理论支持。由于抗菌肽的亲水侧面要始终与磷脂膜的带负电的酸性头部相结合,它们应该具有如下特点:1) 在整条肽链上分布大量正电荷;2) 与双亲性细胞膜应该呈现很微弱的结合能力或者根本不与之结合,从而不会溶血。因此对抗菌肽进行结构改造而得到哺乳动物细胞毒性降低的结构形式所依据的主要是这一机制。现在已经有大量的研究机构开展了对抗菌肽进行结构改造的工作,这些工作主要是从改变抗菌肽的α- 螺旋性质、带电荷水平以及疏水性方面着手,并取得了很好的结果,这些结果反过来又促进了对其作用机制的研究。 6.2转基因研究及应用 仔猪腹泻、奶牛乳房炎及各种病毒性疾病如猪瘟、鸡新城疫等一直是棘手的疾病,不利于畜牧业的发展。借鉴已成功的昆虫抗菌肽转基因工程,如转基因蚊子、转基因马铃薯、转基因水稻等,把特异的抗菌肽基因转入畜禽特定细胞让其表达,从而产生抗病新品种,不失为一条发展畜牧生产的新思路,前景深远。 6.3抗菌肽基因表达调控及抗菌肽添加剂研究 研究表明,抗生素添加剂的使用严重破坏了动物肠道的微生物平衡,并易在动物体内残留,严重影响了畜产品的品质和人类的健康。用基因工程方法生产环保型抗菌肽添加剂,或者,通过日粮因素调控抗菌肽基因的表达而达到畜产品无抗素化值得进一步研究。 然而,由于抗菌肽分子小,分离提纯存在一定的困难,故天然资源有限。化学合成和基因工程法获得抗菌肽是主要手段,但化学合成抗菌肽成本高,而通过基因工程在微生物中直接表达抗菌肽基因,则可能对宿主有害而不能获取表达产物。所以,对抗菌肽的结构、构效关系及作用机理还需进一步研究。 天然抗菌肽来源有限，提取工艺复杂，成本昂贵, 化学合成也存在成本高、批量生产困难等问题，通过基因工程获得的抗菌肽抗菌活性、生产困难等问题。某些抗菌肽抗菌谱广、杀伤力强,但其对哺乳动物细胞也有一定的细胞毒性，如何在保持其结构与活性的同时降低其细胞毒性也是需要解决的问题。 7 展望 过去, 在一种抗生素因为耐受性的产生而失去作用时, 人们通常通过对其分子进行修饰来寻找新的抗生素, 但不久之后微生物的耐受性依然会出现。临床和实验所进行的研究证实了抗菌肤所引起的微生物耐受性, 与传统的抗生素相比, 微乎其微, 这为解决在临床上日益棘手的细菌对传统抗生素产生耐药性问题