菌种价值对比图
土木香内生真菌YIGZ-3抗菌活性及菌种鉴定
土木香内生真菌YIGZ-3抗菌活性及菌种鉴定阿塞木古丽·热音拜克;吾鲁木汗·那孜尔别克;恩特马克·布拉提白【摘要】采用组织分离法从药用植物土木香根、茎和叶片中分离出32株内生真菌,通过纸片扩散法测定20株土木香内生真菌,筛选出1株具有较强抑菌活性的菌株,命名为YIGZ-3.用薄层层析法(TLC)法和高效液相色谱法(HPLC)法检测其发酵液中的土木香内脂,通过形态学特征观察和rRNA基因内转录间隔区(ITS)序列分析对菌株进行鉴定.结果显示:菌株YIGZ-3对大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌和白色念球菌均有较强的抑菌活性,其发酵液中检测到与土木香内脂相似的化合物,根据真菌形态特征和ITS序列同源性鉴定表明菌株YIGZ-3为塔宾曲霉菌(Aspergillus tubingensis).【期刊名称】《吉首大学学报（自然科学版）》【年(卷),期】2017(038)005【总页数】6页(P71-76)【关键词】土木香;内生真菌;抑菌活性;土木香内酯;鉴定【作者】阿塞木古丽·热音拜克;吾鲁木汗·那孜尔别克;恩特马克·布拉提白【作者单位】吉首大学生物资源与环境科学学院,湖南吉首416000;伊犁师范学院生物与地理科学学院,新疆伊宁835000;伊犁师范学院生物与地理科学学院,新疆伊宁835000【正文语种】中文【中图分类】R285.5植物内生真菌(Endophyte fungus)是指在植物宿主中度过部分或全部生活周期而不使宿主植物表现明显病理症状的一类真菌.[1]根据Strobel提出的“内共生理论”，内生真菌除了可产生与宿主植物次生代谢产物相同或者相似的物质外，还可以产生其他的活性物质，它们对宿主植物生长发育、对外界环境的应激耐受性、有效活性成分的产生与积累等方面有重要影响[2].1993年Stierle等[3]从短叶红豆杉的韧皮部分离得到一株产紫杉醇的内生真菌安德氏紫衫霉(Taxomyces andreanae)后，国内外学者从多种药用植物中陆续分离得到产活性物质的内生真菌[4-5].因此，药用植物内生真菌已成为活性天然产物的重要资源.土木香(Inula helenium L.)属于菊科旋覆花属的多年生草本植物，主要分布于河南、河北、浙江、四川、山西、陕西、甘肃及新疆等地.土木香具有健脾和胃、调气解郁、止痛安胎的功能，临床常用于治疗脘腹胀痛、呕吐泻痢、胸胁挫伤、岔气作痛、胎动不安等症状.[6]土木香中主要的化学成分是倍半萜内酯类，包括土木香内酯、异土木香内酯、土木香醇、土木香酸、二氢土木香内酯等，其中含量较高的为土木香内酯和异土木香内酯[7-8].研究结果证实土木香内酯和异土木香内酯具有抑制肿瘤、驱虫、抗菌、抑制平滑肌、降血糖和利胆等作用[9-11]，土木香的乙醇提取物还具有镇痛作用[12].按照“内共生理论”推测土木香内生真菌也可能产生具有类似活性的次生代谢产物.为此，本课题组深入挖掘了土木香内生真菌资源，发现了具有较强抑菌活性的菌株YIGZ-3.本试验对菌株YIGZ-3发酵液的抑菌活性进行评价，检测其代谢产物并对菌株进行鉴定，旨在筛选出能产生土木香内酯的内生真菌，为发酵生产土木香内酯及土木香的综合开发奠定基础.1.1 材料1.1.1 菌株内生真菌YIGZ-3分离自新疆伊犁尼勒克县唐布拉草原野生土木香根部，15%甘油管置于-80 ℃冰箱保存.大肠杆菌CGMCC1.1103、枯草芽胞杆菌CGMCC1.769、金黄色葡萄球菌CGMCC1.8721和白色念球菌ATCC10123均由伊犁师范学院微生物资源保护与开发利用重点实验室保存.1.1.2 试剂与培养基薄层层析硅胶(青岛海洋化工厂)；乙晴(天津市福晨化学试剂厂)；土木香内酯对照品(上海原叶生物科技有限公司)；真菌基因组提取试剂盒、PCR试剂和DNA marker(大连宝生物工程公司).PCR引物由上海生工生物工程股份有限公司合成；牛肉膏蛋白胨培养基用于指示菌的培养；马铃薯葡萄糖琼脂(PDA)培养基和马铃薯葡萄糖液体(PDB)培养基用于真菌的活化和培养.1.1.3 仪器设备 UltiMate3000高效液相色谱仪(赛默飞世尔科技有限公司)；IKA-RV10旋转蒸发仪(德国IKA集团/艾卡广州仪器设备有限公司)；KQ5200DE超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)；AG22351梯度PCR仪(德国Eppendorf公司)；NIKON801荧光正置显微镜(日本三洋科研医疗设备厂)；GelDoc-It TS2凝胶成像分析系统(北京赛百奥科技有限公司).1.2 方法1.2.1 真菌发酵液的制备将菌株YIGZ-3接种于PDA固体液体培养基中28 ℃活化6 d后，转接至50 mL的PDB液体培养基中28 ℃、180 r/min摇床培养7 d.发酵液经9 000 r/min离心15 min，取上清备用.1.2.2 指示菌制备将大肠杆菌，枯草芽胞杆菌和金黄色葡萄球菌分别接种于牛肉膏蛋白胨液体培养基中37 ℃恒温箱培养24 h，将白色念球菌接种于PDB液体培养基28 ℃培养48 h，经离心收集菌体后，将菌体悬浮于5 mL的生理盐水制备菌悬液.1.2.3 抑菌活性测定采用纸片扩散法测定土木香内生真菌YIGZ-3发酵液的抑菌活性.用生理盐水分别对各指示菌菌悬液进行梯度稀释，稀释至约1 × 106 CFU/mL.取100 μL指示菌菌液接种涂抹于PDA固体培养基上，用无菌玻璃环充分涂布后，在适当位置贴上已灭菌的滤纸片(φ=5 mm)，然后吸取发酵上清液20 μL点在滤纸片上，同时以发酵培养基作阴性对照.将带有白色念球菌的平板置28 ℃恒温培养箱培养24 h，其余带菌平板置37 ℃恒温培养箱培养24 h.平行试验重复3次，十字交叉法测量抑菌圈直径.1.2.4 标准对照品的制备精密称取1 mg土木香内酯标准品，加甲醇溶剂定容至10 mL，摇匀，得土木香内酯质量浓度为100 mg/L的标准对照品溶液.1.2.5 土木香内酯的提取将菌株YIGZ-3接种于PDB液体培养基中，28 ℃，180r/min摇床培养7 d后过滤.取过滤后的发酵液50 mL用旋转蒸发仪浓缩挥干，加甲醇少量，再移入10 mL容量瓶中，甲醇定容，摇匀，超声波处理45 min，9 000 r/min离心15 min，收集上清，用0.45 μm的过滤器过滤，作供试品溶液.同时将菌株YIGZ-3菌丝体在60℃干燥箱中烘干至恒重，研磨成粉末.称取菌丝体粉末2.0 g，加甲醇溶剂定容至50 mL，超声处理45 min，9 000 r/min离心15 min，收集上清，用0.45 μm过滤器过滤，作供试品溶液.1.2.6 土木香内酯的TLC检测吸取上述供试品溶液、标准品溶液分别点样于薄层硅胶板上，石油醚-苯-乙酸乙酯(15∶2∶2)为展开剂展开，置层析缸内，待溶剂前沿到达距薄层板上端1～2 cm时取出，然后迅速晾干，把薄层硅胶板放入5%硫酸-乙醇显色液中，110℃显色.比较供试品与标准对照品斑点的颜色、位置及其Rf 值，可初步筛选出产土木香内酯的菌株.1.2.7 土木香内酯的HPLC检测色谱柱Hypersil GoldTMRP18 4.6 nm×150 nm，5 μm保护柱；流动相乙腈和0.1%磷酸水溶液(体积比60∶40)；流动相流速1.0 mL/min；检测波长194 nm；柱温30 ℃；进样体积20 μL.通过高效液相色谱检测可确定菌株YIGZ-3能否产土木香内酯.1.2.8 真菌形态学观察采用真菌插片培养法对菌株YIGZ-3的菌落、菌丝体和孢子等特征进行显微镜观察，参照文献[13]和文献[14]进行鉴定.1.2.9 rRNA基因ITS序列测定及分析用真菌基因组DNA提取试剂盒提取菌株YIGZ-3的基因组DNA.用通用引物ITS5(5′-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3′)和ITS4(5′-TCCTCCGCTT ATTGATATGC-3′)经PCR从菌株YIGZ-3基因组DNA中扩增出ITS序列.PCR反应体积50 μL.PCR反应条件：94 ℃预变性3 min；94 ℃变性30 s，55 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，35个循环；72 ℃延伸10 min.PCR产物经1.0%琼脂糖凝胶电泳检测后，由上海生工生物工程有限公司完成测序.依据测序结果，在NCBI数据库中用Blast软件进行菌株rRNA基因ITS序列对比.选取相似性较高菌株序列，用ClastalX和MEGA4.0软件包采用邻接法(Neighbor-Joining method)进行聚类分析系统进化树构建，拓扑结构分析采用1 000次重复取样.2.1 菌株YIGZ-3抑菌活性抑菌试验结果显示，菌株YIGZ-3发酵液对大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌和白色念球菌的抑菌圈直径分别为18.3，6.32，7.21，19.4 mm(图1).表明菌株YIGZ-3发酵液对大肠杆菌和白色念球菌有较强的抑菌活性，但对枯草芽孢杆菌和金黄色葡萄球菌的抑菌活性较弱.2.2 菌株YIGZ-3次生代谢产物的TLC检测TLC检测结果显示，用硫酸-乙醇显色液显色后，在菌株YIGZ-3发酵液、菌丝体甲醇提取液中出现与土木香内酯标准品颜色和Rf值相同的蓝色斑点(图2)，初步确定菌株YIGZ-3可能产生土木香内酯，而菌株YIGZ-3菌丝体甲醇提取液中还出现2～3个未知的化合物(斑点).2.3 菌株YIGZ-3次生代谢产物的HPLC检测HPLC检测显示，土木香内酯标准品在11.6 min出现峰值.菌株YIGZ-3发酵液和菌丝体提取液以及土木香根提取液与标准品在相同的时间处出现相同的吸收峰(图3).结合TLC检测结果，可确定菌株YIGZ-3的发酵液和菌丝体提取液中均含有土木香内酯.2.4 菌株YIGZ-3的形态学学鉴定菌落特征：菌株YIGZ-3菌落在28 ℃培养基上7天后，其菌落的直径可达到40～45 mm，菌落颜色从起初的黄色随着时间渐渐变为黑白圈状(图4)，而菌落反面呈黄色(图4).显微镜观察结果显示，菌株YIGZ-3的气生菌丝较分散，菌丝分枝，长稍弯曲，有些像树枝，分生孢子呈球状.菌株YIGZ-3菌落、菌丝体和分生孢子的形态特征相似于曲霉菌属.2.5 菌株YIGZ-3的分子生物学鉴定琼脂糖凝胶电泳结果显示，通过PCR从菌株YIGZ-3基因组DNA中扩增出大小约为550 bp的DNA条带(图5)，与预期值相符.DNA测序结果表明，菌株YIGZ-3的ITS序列大小为577 bp，其GenBank登录号为KY552623.将测定的核苷酸序列与GenBank中的已知序列进行Blast比对分析，结果显示，菌株YIGZ-3与Aspergillus tubingensis strain GX1-5E(登录号GU595290)ITS序列的相似性为99%.由菌株YIGZ-3的ITS序列与其他种属菌种的相应序列构建系统进化树(图6)，结果显示菌株YIGZ-3与Aspergillus是同一个属.结合形态学分类结果，将菌株YIGZ-3鉴定为曲霉菌属有效发表种Aspergillus tubingensis的一个菌株.土木香是我国传统的中药，其主要成分土木香内酯和异土木香内酯是常用抗菌药物，并具有抑制肿瘤、驱虫、抗菌、抑制平滑肌、降血糖、利胆和镇痛等药理作用，在临床上用量很大.但土木香生长周期长、产量低，因盲目开采，导致大部分野生土木香处于濒危或渐危状态，人们试图通过其他途径获得土木香的有效成分土木香内酯和异土木香内酯，但目前有关土木香内生真菌的研究国内外尚未见报道.为此，本课题组采用组织分离法从药用植物土木香根部分离得到32株菌落形态特征有差异的内生真菌，其中菌株YIGZ-3具有较强抑菌活性.本研究采用纸片扩散法测定菌株YIGZ-3发酵液对4种指示菌的抑菌活性，运用TLC和HPLC检测菌株YIGZ-3次生代谢产物中的土木香内酯，并对其进行形态学和分子生物学鉴定.抑菌试验结果显示，菌株YIGZ-3发酵液对大肠杆菌和白色念球菌有较好的抑菌作用，但对枯草芽孢杆菌和金黄色葡萄球菌的抑菌作用较弱，表明菌株YIGZ-3发酵液对革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌抑菌活性可能有一定的差异.通过TLC和HPLC从菌株YIGZ-3发酵液和菌丝体提取液中检测到类似于土木香内酯的次生代谢物，表明该菌株可能合成与宿主植物土木香相似的土木香内酯.采用形态学和分子生物学相结合的方法将菌株YIGZ-3鉴定为塔宾曲霉菌(Aspergillus tubingensis).本研究结果为发酵生产土木香内酯及土木香的综合利用提供了科学依据，同时也为药用植物内生菌的研究提供了新资料.此外，本研究是定向筛选能产生土木香内酯的真菌，此过程容易导致其他重要的有效成分，如异土木香内酯、土木香醇和土木香酸等成分不能被发现，因此，还需要研究来探索土木香内生真菌是否还产生其他有益的活性成分.【相关文献】[1] STURZ A V,NOWAK J.Endophytic Communities of Rhizobacteria and the Strategies Required to Create Yield Enhancing Associations with Corps[J].Applied SoilEcology,2000,15(2):183-190.[2] STROBEL G A.Rainforest Endophytes and Bioactive Products[J].Critical Reviews in Biotechnology,2002,22(4):315-333.[3] STIERLE A,STROBEL G,STIERLE D.Taxol and Taxane Production by Taxomyces Andreanae,An Endophytic Fungus of Pacific Yew[J].Science,1993,260(5 105):214-216. [4] YANG Kai,LIANG Jie,LI Qinfan,et al.Cladosporium Cladosporioides XJ-AC03,an Aconitine-Producing Endophytic Fungus Isolated from Aconitum Leucostomum[J].World Journal Microbiology Biotechnology,2013,29(5):933-938.[5] 厉秀秀,方玉鹏,赖毕,等.黄连产小檗碱内生真菌的分离鉴定[J].草地学报,2013,21(5):1 005-1 011.[6] 国家药典委员会.中华人民共和国药典，一部[S].北京：中国医药科技出版社，2015：253.[7] HUO Y,SHI H,LI W,et al.HPLC Determination and NMR Structural Elucidation of Sesquiterpene Lactones in Inula Helenium[J].Journal of Pharmaceutical & Biomedical Analysis,2010,51(4):942-946.[8] 张嫚丽,霍长虹,刘丽,等.土木香药材HPLC指纹图谱研究及土木香内脂和异土木香内酯测定[J].中草药,2010,41(9):15-39.[9] DORN D C,ALEXENIZER M,HENGSTLER J G,et al.Tumor Cell Specific Toxicity of Inula Helenium Extracts[J].Phytotherapy Research,2006,20(11):970-980.[10] LI Y,NI Z Y,ZHU M C,et al.Antitumour Activities of Sesquiterpene Lactones From Inula Helenium and Inula Japonica[J].Zeit schrift Für Naturforschung C,2012,67(7/8):375-380. [11] HUP Y,SHI H M,WANG M Y,et al.Chemical Constituents and Pharmacological Properties of Radix Inulae[J].Cheminform,2008,63(10):699-703.[12] 王良言.土木香乙醇提取物的镇痛作用[J].国外医药:植物药分册,2004,19(6):261.[13] 魏景超.真菌鉴定手册[M].上海:上海科技出版社,1979：305.[14] 吴绍熙.现代医学真菌检验手册[M].北京:北京医科大学/中国协和医科大学联合出版社,1998：285.。
菌种鉴定方法及手段真菌细菌检测
菌种鉴定⽅法及⼿段真菌细菌检测菌种鉴定⽅法及⼿段真菌检测/细菌检测菌种鉴定⼀般就只要提取基因组DNA，然后PCR扩增16srDNA⽚段，上GeneBank 或者Eztaxon对⽐即可。
⼀般序列相似度在97%以上就可以认为是同种细菌。
常规鉴定常规鉴定内容有形态特征和理化特性。
形态特征包括显微形态和培养特征；理化特性包括营养类型、碳氮源利⽤能⼒、各种代谢反应、酶反应和⾎清学反应等。
⾃动鉴定BIOLOG鉴定系统以微⽣物对不同碳源的利⽤情况为基础，检测微⽣物的特征指纹图谱，建⽴与微⽣物种类相对应的数据库。
通过软件将待测微⽣物与数据库参⽐，得出鉴定结果。
该系统已获美国FDA认可，已逐步应⽤于⾷品和饮品企业、环保、海洋⽣物/⽔产品、制药、农业微⽣物、⽣物治理、化妆品、临床等领域的微⽣物鉴定试验中。
拥有国内最全的BIOLOG数据库，涉及⾰兰⽒阴性菌、⾰兰⽒阳性菌、厌氧菌、酵母、丝状真菌在内近2000种微⽣物。
分⼦⽣物学鉴定应⽤分⼦⽣物学⽅法从遗传进化⾓度阐明微⽣物种群之间的分类学关系，是微⽣物分类学研究普遍采⽤的鉴定⽅法。
科标⽣物检测中⼼拥有微⽣物菌种分类鉴定的分⼦⽣物学实验室，配有PCR仪、⾼速冷冻离⼼机、电泳仪、HPLC、凝胶成像系统、紫外控温分析系统等先进仪器设备，以及DNAMAN、BIOEDIT、CLUSTALX、TREEVIEW等序列分析软件。
可采⽤核酸序列分析法分析细菌16S rDNA/16S-23S rDNA区间序列、酵母18S rDNA/26S rDNA（D1/D2）序列及丝状真菌的18S rDNA/ITS1-5.8S-ITS2序列，提供科学的鉴定结果。
API细菌鉴定API鉴定系统涵盖15个鉴定系列，约有1000种⽣化反应，已可鉴定超过600种的细菌。
鉴定过程中，可根据细菌所属类群选择适当的⽣理⽣化鉴定系列，通过软件将待测细菌与数据库参⽐，得出鉴定结果。
可应⽤API50CH系列、API20E系列、API Staph系列对乳酸杆菌（Lactobacillus sp.）和相关细菌、芽孢杆菌（Bacillus sp.）、葡萄球菌属（Staphylococcus sp.）、微球菌属（Micrococcus sp.）和库克菌属（Locuria sp.）进⾏鉴定。
5种乳酸菌及其灭活态体外抗氧化能力的比较研究
5种乳酸菌及其灭活态体外抗氧化能力的比较研究陈漪汶;方若楠;朱剑锋;庞旭;徐健;胡文锋【摘要】以总抗氧化活性(T-AOC)、总超氧化物歧化酶(T-SOD)活力、羟自由基清除率(OH-·)、超氧阴离子清除率(O2-·)、还原活性为测定指标,对5株乳酸菌灭活前后发酵上清液、完整细胞悬液、胞内提取物的抗氧化能力进行比较研究,并筛出抗氧化能力相对较强的3株乳酸菌进行复配.结果表明:5种乳酸菌灭活前后的发酵上清液、完整细胞悬液、胞内提取物具有不同的抗氧化能力,其中嗜酸乳杆菌灭活前和灭活后的发酵上清液的总抗氧化活性最好,分别为45.9、35.0 U/mL.菊糖芽孢乳杆菌未灭活的发酵上清液的超氧阴离子自由基清除率较强为21.03％.嗜热链球菌的灭活胞内提取物的总超氧化物歧化酶活力最强为456.7 U/mL,其未灭活的胞内提取物的羟自由基清除率最强为79.26％.唾液乳杆菌的灭活发酵上清液的还原活性最强.复配结果表明,灭活完整细胞悬液的超氧阴离子清除率(O2-·)较单一菌株强;菊糖芽孢乳杆菌和嗜酸乳杆菌复配后灭活完整细胞悬液的羟自由基清除率(OH-·)最强,为82.40％;而菌株复配后的总抗氧化活性(T-AOC)、总超氧化物歧化酶(T-SOD)活力与单菌差异不显著.不同乳酸菌菌株的抗氧化能力存在差异,且其发挥抗氧化作用的活性物质存在的部位也因菌株不同而具有较大的差异性.【期刊名称】《食品工业科技》【年(卷),期】2019(040)011【总页数】7页(P85-90,97)【关键词】乳酸菌;抗氧化能力;发酵上清液;完整细胞悬液;胞内提取物【作者】陈漪汶;方若楠;朱剑锋;庞旭;徐健;胡文锋【作者单位】华南农业大学食品学院,广东广州510642;华南农业大学食品学院,广东广州510642;生物源生物技术(深圳)股份有限公司,广东深圳518118;广州无两生物科技有限公司,广东广州510640;广州柏芳生物科技有限公司,广东广州510640;华南农业大学食品学院,广东广州510642【正文语种】中文【中图分类】TS201.1氧化应激是机体细胞内促氧化成分(如超氧化物、过氧化氢等)与抗氧化成分(超氧化物歧化酶、过氧化氢酶、谷胱甘肽等)之间平衡失调,体内氧自由基生成过多无法被清除,引起机体过度氧化,造成机体组织功能损害的一系列适应性的反应[1-2]。
全国食用菌品种试验管理办法与认定办法-全国农技推广网
附件1：全国食用菌品种试验管理办法一、总则第一条为了鉴定各地新育成的主要食用菌品种在不同生态条件下的产量、品质、抗性及适宜范围，为全国品种认定提供科学依据，客观评价品种的生产利用价值，特制定本办法。
第二条本办法是组织开展全国食用菌品种区域试验和生产试验（以下简称“区试”）的指导性文件，是制定全国食用菌品种区试技术操作规程、年度试验计划、试验实施方案等的基本依据。
二、组织体系第三条依据《食用菌菌种管理办法》，全国农业技术推广服务中心(以下简称“全国农技中心”)负责组织管理全国食用菌品种区试，并根据食用菌种植布局和产业发展需要，委托有关单位主持（以下简称“区试主持单位”）实施不同品种的区试工作，安排相关单位承担区试任务（以下简称“区试承担单位”）。
第四条区试主持单位职责：(l)贯彻全国农技中心的试验指导意见；(2)协助全国农技中心或在其授权下起草试验实施方案、制定试验操作规程、组织实地考察；（3）负责试验资料汇总、总结，并对参试品种提出评价意见；(4)试验完成后，及时向全国农技中心提供试验报告；(5)处理试验日常工作。
第五条区试承担单位条件职责：(l)有较好的生态、生产代表性，具备完善试验设施和较强技术力量的企事业单位，有专人负责，能保证试验的顺利实施；(2)遵守职业操守，对试验资料、材料保密，不扩散和随意利用，以保证试验的科学、严谨、公正；(3)严格执行试验实施方案和技术操作规程，完成各项任务，提交试验总结。
第六条各省(区、市)农业行政主管部门的食用菌品种管理部门应协助全国农技中心做好本行政区域内区试的组织管理、检查督促及品种推荐、示范等工作，并对区试工作提出合理建议。
三、试验设置第七条区试承担单位应选择安排在相应食用菌种类的主产区域，既考虑生态类型和生产方式的代表性，又兼顾行政区划，科学、合理布局。
第八条区试承担单位由全国食用菌品种认定委员会推荐，全国农技中心核准；区试承担单位应保持相对稳定，如确需调整，由主持单位按程序提出意见，全国农技中心核准。
不同栽培方式下冬荪农艺性状及产量比较
第58卷 第2期 广 东 蚕 业 V ol.58,No.02 2024年2月GUANGDONG CANYE Feb . 2024DOI ：10.3969/j .issn .2095-1205.2024.02.07不同栽培方式下冬荪农艺性状及产量比较翟晓岚1 谢龙安1 谢鹏程2 刘洪明1 熊 威3（1.毕节职业技术学院 贵州毕节 551700；2.毕节市恒蔬无疆数字农业有限公司 贵州毕节 551700；3.毕节市七星关区农业农村局 贵州毕节 551700）摘 要 为了研究不同栽培方式对冬荪农艺性状和产量的影响，给冬荪高效栽培提供参考依据，文章以高秆肉质型冬荪三级菌种为试材，实施不同水平下单位面积菌种播种量、菌材规格及铺材方式、菌种覆盖料处理的栽培试验，测算不同栽培处理对冬荪农艺性状和产量的影响。
结果表明：菌种播种量对冬荪农艺性状基本没有影响，对冬荪出菇量和产量有较大影响，出菇量和产量随菌种投入量的增加而增加；菌材规格及铺材方式对冬荪农艺性状指标影响较小，采用长度10 cm 、径粗5 cm 规格的菌材，冬荪出菇量和产量最高；菌种覆盖竹碎料3 kg /m 2，冬荪出菇量和产量最高，菌种覆盖木叶3 kg /m 2，冬荪出菇量和产量最低。
因此，菌种播种量、菌材规格及铺材方式和菌种覆盖料对冬荪农艺性状影响不大，而会直接影响冬荪出菇量和产量。
关键词 栽培方式；冬荪；农艺性状；产量 中图分类号:S567.3文献标识码:A文章编号:2095-1205(2024)02-21-04Research on the Comparison of Agronomic Traits and Yield of Phallus impudicus under Different Cultivation MethodsZhai Xiaolan 1 Xie Long ’an 1 Xie Pengcheng 2 Liu Hongming 1 Xiong Wei 3（1. Bijie vocational and technical college, Bijie, Guizhou, 551700; 2. Bijie HengShuWuJiang Digital Agriculture Co, LTD., Bijie,Guizhou, 551700; 3. Agriculture and Rural Bureau of Qixingguan District, Bijie City, Bijie, Guizhou, 551700）Abstract ：In order to provide reference for efficient cultivation of Phallus impudicus, it ’s necessary to study the effects of different cultivation methods on its agronomic traits and yield. Thus, the thesis conducted experiments on seedling quantity per unit area, specification of seedlings, material laying method and treatment of seedling covering materials at different levels, using the high-stemmed flesh three-stage seedlings as samples. The results suggests that the three factors all exerted no obvious effect on agronomic traits, but seedling quantity has a great influence on the output and yield of Phallus impudicus, and the yield increase with the increase of seed input; the yield is the highest when the seedlings’ length and diameter reach 10cm and 5cm respectively, and when the seedlings were covered with 3kg/m2 of bamboo leaves. The yield is lowest when seedlings were covered with 3kg/m2 of wood leaves. Therefore, it can be said that the three factors exert little influence on the agronomic traits of Phallus impudicus, but they will directly affect its yield.Key words ：Cultivation methods; Phallus impudicus; Agronomic traits; Yield冬荪，学名白鬼笔（Phallus impudicus L .），隶属鬼笔科鬼笔属，在我国主要分布在贵州、云南、广东、河南、山西、湖北等地[1-3]，富含多种氨基酸和微量元素，有较高的营养价值[4-5]。
生物强化技术
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全新的废水生物处理技术
SKBS 工作间 SKBS微生物强化技术
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SKBS工作间 SKYCLEAN生物强化装置安放于SKBS工作间中，起到防雨、防尘、延长设备 使用寿命，提供舒适的工作环境，美化厂区环境的作用。
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全新的废水生物处理技术
案 例 SKBS微生物强化技术
50
200
40
进水 去除率
处理水
150
30
100
20
50
10
0 6/2 6/4 6/6 6/8 6/10 6/12 6/14 6/16 6/18 6/20
0 6/22
日期
LG LCD生产废水波动大，难降解有机物浓度高，曝气池中微生物活性低，不能稳定达
标排放。采用生物强化工艺后，通过提高优势微生物的数量和活性，处理效率明显提 升，实现稳定达标。
项目概况
行业：石化 水量：250m3/h(实际运行） 运行情况： - 生物处理系统为缺氧-好氧组合工艺，A、B 两个廊道并联运行。 - 曝气池进水COD为500-600mg/L，出水COD基本在100mg/L左右。 存在的问题： - 随加氢裂化装置开工及新建聚丙烯装置投产，系统处理负荷增加。 - 系统抗冲击能力有待加强，在停工检修或装置故障时系统易受到冲击。冲击 后系统恢复时间较长，恢复期间出水指标无法满足要求。
2.5 ppm
4台
CODMn : 1350ppm ( 970ppm - 2200ppm )
CODMn : 80 ppm 36 ppm
20小时
4.5 X 106 2.7 X 108
4500 ppm 7900 ppm
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适于香菇菌棒生产接种的液体菌种培养基配方筛选
适于香菇菌棒生产接种的液体菌种培养基配方筛选作者：张振宇王继磊吕凯苏建昌韩建东刘晓杜兴程朱肖艳姚强来源：《山东农业科学》2014年第12期摘要：选取6种常用的香菇液体菌种培养基，通过对菌丝生物量、菌棒培养状况和出菇状况的比较，筛选适合香菇菌棒的最佳液体菌种培养基配方。
结果表明，配方③（玉米粉2%、马铃薯淀粉2%、酵母膏0.2%、麸皮1%、磷酸二氢钾0.1%、硫酸镁0.1%）适于香菇菌棒的直接接种，其上接种的香菇菌棒整个生长周期仅为205天。
关键词：香菇；液体菌种培养基；出菇；生长周期中图分类号：S646.1+2文献标识号：A文章编号：1001-4942（2014）12-0051-03近年来，我国香菇市场增长稳定，生产发展迅速，随着香菇产业的发展，对香菇生产工艺、产量及品质提出了更高的要求。
传统的香菇制种技术经过较为繁琐的母种、原种、栽培种三级培育，最后才能扩大到栽培袋的生产。
劳动强度大、工艺繁琐、污染率高、生长周期长、接种操作要求高等都大大制约了香菇的发展[1]。
液体菌种技术的出现有效解决了以上难题，但由于种种原因，当前液体菌种在香菇栽培中的应用颇为有限。
为此，本研究对香菇液体菌种培养基做了初步筛选，以期为香菇液体菌种的推广应用提供理论依据。
1材料与方法1.1供试菌株七河6号，由山东七河生物科技股份有限公司保藏。
1.2培养基配方液体培养基配方共设6组：①玉米粉2%，豆粉2%，磷酸二氢钾0.1%，硫酸镁0.1%[2]；②葡萄糖2%，黄豆粉4%，木屑4%[3]；③玉米粉2%，马铃薯淀粉2%，酵母膏0.2%，麸皮1%，磷酸二氢钾0.1%，硫酸镁0.1%；④麸皮10%，蔗糖1%，磷酸二氢钾0.2%，硫酸镁0.15%；⑤玉米粉2%，蔗糖2%，蛋白胨0.5%；⑥麸皮100%、麦芽糖3%、硫酸镁0.15%、磷酸二氢钾0.1%[4]。
栽培培养基配方：木屑79%，麸皮20%，石膏1%，含水量55%～60%。
1.3液体菌种培养方法将活化的七河6号母种接入斜面培养基，25℃培养13 d，待菌丝长满斜面后再分别转入液体培养基摇瓶内，每瓶接种5块，每块菌丝0.5 cm2，每个处理（配方）重复10瓶。
微生物污染菌种库的建立
应用：
1
对实验室洁净环境、各种检品进行监控，构建环 境微生物分布图，提高检测结果公信力
建立实验室环境微生物信息库、动态监控环境微 生物的变化、建立环境微生物污染趋势分析图， 预测微生物污染方向，从被动的排查污染措施上 升到主动的预防、预警。
应用：
2
增强药品中微生物检验能力，做到数据可信，国际 认可，为执法、仲裁提供依据
常见革兰氏菌污染来源
• 革兰氏阴性螺旋菌 • 在制药用水系统或洁净室环境很少发现。 • 这些细菌与排泄物污染有关,包括被污染的水源。 • 当检测到该类菌时，应该全面调查找到它的潜在来源。
细菌的鉴定流程图
样品接收
分离纯化得到单菌落
菌落形态检验
DNA提取
革兰氏染色
通用引物扩增细菌16S rDNA 序列
1.斜面低温法 斜面菌种置4~6℃冰箱中（3~6个月）
特点
简便 保藏时间短 易污染及退化
2.矿油保藏法
矿油 处理
灭菌：152kpa、30min 去水：40~50℃烘至无色透明
特点
无菌检验 ？
方法简便的优点 适用于不宜冷冻干燥的微生物（如 产孢能力低的丝状菌）的保存。 某些细菌不宜采用此法进行保存。
可引起烧伤病人皮肤感染或真菌性 肺部感染
曲
青
霉
霉
青霉：分生孢子梗 分生孢子梗
曲霉：分生孢子头
足细胞
根霉：孢子囊、匍匐枝和假根
犁头霉：接合孢子
酵母菌：出芽
酵母菌是单细胞构造，个体形态多为卵圆形、圆柱形，但有 时某些酵母菌可形成假菌丝。酵母菌无性繁殖以出芽方式生殖。
白色念珠菌 （假丝酵母）
酿酒酵母
• 真菌孢子易于在空气中飘散，难以杀灭，对实验室环境 和检验人员安全具有潜在污染风险。
不同浓度杀菌剂对平菇菌丝体生长的影响
教学单位孝感学院生命科学技术学院学生学号071414103本科毕业论文（设计）题目不同杀菌剂对平菇菌丝生长的影响学生姓名范高韬专业名称生物科学指导教师李国元2010年5月11日不同杀菌剂对平菇菌丝生长的影响摘要：主要选用多菌灵，咪鲜胺，甲基硫菌灵三种常用的杀菌剂，在PDA培养基的基础上加入三种杀菌剂，通过实验观察平菇菌种在三种杀菌剂的生长情况；在稀释浓度相同情况下，杀菌效果好的被筛选出来进行精确稀释浓度的测试。
之后在PDA培养基上对筛选出的杀菌剂以呈梯度上升的形式进行测试，旨在筛选出其中既能有效地控制霉菌污染，又不影响平菇菌丝生长的杀菌剂及其具体适用浓度范围和最佳浓度，供生产使用，为生产实践提供合理建议。
关键词：杀菌剂；多菌灵；平菇菌丝Different microbicides hypha growth influence to mushroomAbstract：Main test carbendazim， prochloraz, and thiophanate methyl 3 fungicides on mushroom bacteria mycelial growth inhibition effect, to filter out the appropriate fungicide. PDA medium first preliminary screening of three fungicides in the dilution of the same circumstances,Through the experimental observation mushroom spawn in the growth of three fungicides，a good bactericidal effect was screened for accurate dilution of the test. PDA medium after the screening of fungicides on the gradient was increased to test the form, designed to filter out the pollution can effectively control the mold, without affecting the growth of mushroom mycelium concentration of fungicide and its specific application and the optimal concentration range for the production and use, to provide reasonable recommendations for the production of practice.Key words： fungicides; carbendazim; pleurotus ostreatus目录文献综述 (5)1.1平菇的基本特征及其相关研究 (5)1.1.1平菇的基本特征 (5)1. 1.2平菇的营养价值 (5)1. 1.3国内外对平菇栽培的研究现状 (6)1.2平菇生产中杀菌剂的选取 (7)1前言 (7)2 材料与方法 (8)2.1实验材料 (8)2.2实验药品及仪器 (8)2.2.1多菌灵 (8)2.2.2咪鲜胺 (9)2.2.3甲基硫菌灵 (10)2.2.4三种药品的使用信息 (11)2.2.5实验器材 (11)2.3实验方法 (12)3结果与分析 (12)3.1三种杀菌剂对平菇菌丝的影响分析 (12)3.1.1多菌灵对平菇菌丝生长的效果 (13)3.1.2咪酰胺对平菇菌丝生长的效果 (13)3.1.3甲基硫菌灵对平菇菌丝生长的效果 (14)3. 1.4关于三种杀菌剂的使用效果分析 (14)3.2使用三种杀菌剂后菌落的直径及数据分析 (14)3.3不同浓度杀菌剂对平菇菌丝生长的影响 (15)3.3.15种浓度的咪鲜胺培养基中菌落的观察结果 (15)3.3.25种浓度咪鲜胺培养基中菌落的直径数据 (18)3.4实验总结 (19)4参考文献 (21)5谢辞 (23)文献综述1.1平菇的基本特征及相关研究现状1.1.1平菇的基本特征平菇( P l e u r o t u s o s t r e a t u s ) 在真菌分类上属于担子菌纲，伞目，侧耳科，侧耳属，是我国目前栽培最多的4种主要的食用菌( 蘑菇、香菇、草菇、平菇) 之一【1】。
氨基酸菌种筛选方案
氨基酸菌种筛选步骤一.准备出发菌株（预计用时：48h）1.将活化的原始菌株（冰箱中）转接到新鲜的培养基上。
2.纯化，得到单个菌落。
方案一：稀释平板法。
a.原理将待测样品制成均匀的系列稀释液，尽量使样品中的微生物细胞分散开，使成单个细胞存在（否则一个菌落就不只是代表一个细胞），再取一定稀释度、一定量的稀释液接种到平板中，使其均匀分布于平板中的培养基内。
经培养后，由单个细胞生长繁殖形成菌落。
b.方法步骤先将待分离的材料用无菌水作一系列的稀释（如 1 ∶10 、1 ∶100 、1 ∶1000 、1 ∶10000 …），然后分别取不同稀释液少许，与已溶化并冷却至45 ℃左右的琼脂培养基混合，摇匀后，倾入灭过菌的培养皿中，待琼脂凝固后，制成可能含菌的琼脂平板，保温培养一定时间即可出出菌落。
如果稀释得当，在平板表面或琼脂培养基中就可出现分散的单个菌落，这个菌落可能就是由一个细菌细胞繁殖形成的。
随后挑取该单个菌落，或重复以上操作数次，便可得到纯培养。
方案二：划线法。
a.原理划线法是将菌落或液体培养基划线在平板上，第一次划线是挑去菌落或菌液，滑1条（Z型划线）或3条（三线）线，烧灼接种环后再划下1条（3条），第二次划线的起始点和第一次划线上开始；然后依次划线4次或更多。
每划线一次就意味着一次稀释。
由接种环以菌操作沾取少许待分离的材料，在无菌平板表面进行平行划线、扇形划线或其他形式的连续划线，微生物细胞数量将随着划线次数的增加而减少，并逐步分散开来，如果划线适宜的话，微生物能一一分散，经培养后，可在平板表面得到单菌落。
b.方法步骤用接种环沾取少量菌样，在相应培养基平板中划线分离。
划线完毕后盖上培养皿盖，培养24h。
方案三：涂布稀释法。
a. 原理涂平板是将培养液涂布在固体培养基平板上，使得在平板上长出不连续的菌落，每个菌落都可以认为是一个培养物，但为避免可能存在的菌落重叠，一般需要进一步划线分离。
c.方法步骤1.样品稀释液的制备。
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号称进口菌种，属于外来菌 种，无生态安全评估报告。 需持续添加菌种来保证系统的 稳定性，长期运行成本高。
菌种品牌 对比项
菌落数（cfu/g）
德丰生物 污水处理菌种
5.9x1010cfu/g（590亿） 复合菌群、硝化与反硝化菌 群，适应性强，能适应个行业 废水，稳定性好。 约3个小时繁殖一代
菌
群
繁殖周期
达标时间
只需3-7天即可达到国家一级A 排放标准。 约150-1000ppm，根据不同 行业废水、处理工艺、污染程 度等决定使用量，灵活性高、 成本低。 经销商价区区间：120-160元 /kg 市场零售价仅：200-220元/kg 取之大自然，用之大自然，经 专家实地实验检测，对环境无 任何污染和影响。 调试系统稳定运行后，无需再 添加菌种，长久达标。经实地 项目实施证明有效期至少一年 以上。
用
量
价格安全性持来自性其他品牌 污水处理菌种
10-100亿cfu/g≤ 硝化细菌、反硝化细菌，单一 菌群、适应性弱，无法适应复 杂的污水容易死亡。 约一周或者几个月
需要30-90天左右未必能达到 国家要求排放标准。 1立方水用1kg，固定性使用 量，无灵活性，成本高。
市场零售价500元/kg-700元/kg