金属硫蛋白检测方法研究进展

金属硫蛋白检测方法研究进展梁 鹏，吴晓萍，廖爱琳（广东海洋大学食品科技学院，湛江 524025）

作者：梁鹏（1985～ ），硕士研究生，研究方向：食品质量与安全。通讯作者：吴晓萍

摘 要：金属硫蛋白是一种富含金属和半胱氨酸的低分子蛋白质，主要包括Ag、Au、Bi、Cd、Hg、Zn等硫蛋

白，具有在体内可被金属和其他因素诱导合成的生物学特性。本文综述了目前7种常用的金属硫蛋白检测方法。关键词：金属硫蛋白；金属结合法；电化学法

金属硫蛋白(Metallothionein,简称MT)是一类广泛存在于生物体内的低分子量（约6500Da）金属结合蛋白，富含半胱氨酸，又叫金属硫氨酸甲基内盐，能被金属诱导。主要存在于动物的肝脏、肾脏、胰腺和小肠中。近年来，很多实验表明，金属硫蛋白参与体内微量元素的储存、转运和代谢，具有拮抗电离辐射、清除自由基以及对重金属解毒的作用，还与机体生长发育、延缓衰老及某些疾病有关。到目前有几种方法已用于生物组织和体液中MT的定量，但尚无标准方法。本文重点综述7种方法，介绍其特点，有助于在进行有关研究时选择和建立适宜的检测方法。1 金属结合法金属结合法(Metal binding)主要基于MT对金属的高亲合力、且不同金属的亲合力具有差异性及其热稳定性而建立。主要通过测定MT结合金属—竞争性替换金属含量来检测MT中金属含量的增高，从而计算出MT的含量。1973年，Piotrowski等首先建立了金属结合法(203Hg-TCA法)用于测定组织中的MT。由于Hg2+在酸性环境下不仅可与MT结合而且还可置换其他金属离子(如pH=2.1时，分别有98％的Hg2+和1％的Cd2+与MT结合)。因此，本法适用于在利用酸沉淀其他蛋白而将MT分离出来时的测定[1]。但此法的203Hg的加入量极其重要，如加入量过小，反应体系中尚有未与203Hg结合的MT，而导致测定结果偏低；相反，加入量过大, 则203Hg呈游离状态或与不被TCA所沉淀的低分子量组分相结合，又可使测定结果偏高。张保林等[2]运用银饱和分析法结合原子吸收光谱(AAS)检测了兔肝Zn-MT，具体方法为：向含MT的溶液中加入过量的Ag+，待反应完全后，再逐次加入血红蛋白，以结合剩余的Ag+，加热使血红蛋白沉淀，与MT结合的Ag+则完全存在于上清液中，通过AAS测定其中Ag+含量，便可计算出MT的浓度。该方法与其他方法比较，不需要去除样品中共存的其它蛋白质和含SH基剂，可直接计算出MT含量，且不需特殊的仪器设备，操作简便，具有很高的重复性和准确性，该法检测的最低限为1μg/ml。金属结合法具有一定的缺陷，如Hg饱和法中Hg+除与MT结合外, 还与其他一些小分子量化合物结合；Ag+不能置换已与MT结合的Hg，且由于利用金属含量间接推算MT含量，特异性较差。

2 电化学法电化学方法(Electrochemical)是利用巯基（-SH）在汞滴电极表面产生氧化还原反应出现的电位变化建立的，通过测定巯基以计算MT的含量。运用检测MT的电化学方法有：示差脉冲极谱法(DPP)、微分脉冲极谱法、示差脉冲阳极溶出伏安法(DPASV) 和循环伏安法(CV)等。1979年Olafson等建立了示差脉冲极谱法[3]测定MT，检出限为10-8M，且不受分子中金属含量的影响。因此, 此法或许更能特异地反映MT而不是金属的量。1992年，Bebianno等人应用差分微分脉冲极谱法测定了贻贝组织中MT的浓度[4]；后来Bordin等通过改变体系的pH值，利用DDP方便的检出了多种形式的MT，并快速分析出还原型的MT；Bebiann应用微分脉

2010年第09期No.09，2010中国食物与营养Food and Nutrition in China冲极谱法测定了贻贝整个软件组织中的Cd-MT浓度。铁峰[5]报道用电化学分析仪单扫极谱法测定-SH基含量，李明春[6]采用组织化学方法，用简化的巯基试剂(DTNB)测定-SH含量。3 免疫法免疫法具有灵敏、特异的优点，所以近年来许多学者们建立了放射免疫分析法(RIA)和酶联免疫吸附分析法(ELISA)用于MT的检测。Mallie等人于1979年首先应用RIA检测大鼠血清中的MT。此方法的检测范围在0.1～100ng/ml之间，但此方法要用到放射性同位素，另外需时过长(3d),给常规检测带来不便。1986年Thomas等首先建立了ELISA，测定速度快、无需接触放射性同位素，与RIA无显著差异，灵敏度可达100pg/ml，与RIA相似，但ELISA的测定相对迅速，且无需昂贵的仪器设备和接触放射性同位素。郑军恒[7]等于1999年用ELISA法测定人血液中的MT，直接型ELISA检测范围为1～10ng，竞争性ELISA[8]检测范围为50～500ng。随后Anderse等人采用二抗改进Western Blotting法检测MT，检测限可达1ng。任宏伟[9]等用ELISA测定鱼类体内的MT，结果表明比金属Cd血红素饱和法具有更高的特异性，检测范围为10～40ng/ml；黄波[10]等用竞争型ELISA法测定人尿中的MT，检测限为20ng/ml。对免疫检测方法，有学者[11]认为MT具有较多的二硫键易被氧化，从而使共免疫性发生改变，进而影响免疫法的测定结果。4 色谱分析法对MT中不同亚型的检测，色谱分析法(Law chromatography)较为适合, 应用的色谱分析法主要有HPLC、RPHPLC、HPLC-ICP-MS、HPLC-AAS。Hunziker等[12]使用RPHPLC从兔组织样品中分离出7种亚型, 通过AAS来检测样品的金属含量，对MT定量测定。鉴于常规色谱层析法分辨力差, 洗脱费时，Suzuki使用凝胶渗透柱的HPLC将Cd诱导大鼠的肝组织样品的MT分离出来，经直接联于AAS来检测样品的金属含量，对MT定量测定。本法可在1h内检出浓度小于1μg/ml的1ml上柱样品中的MT含量，而且，可分别测定不同型的MT。Jin等[13]利用HPLC分离MT，然后根据样品对250nm紫外吸收特性来直接对MT定量。该法的灵敏度小于1μg/ml。5 蛋白质印迹分析法1986年，Aoki等利用蛋白质印迹分析法(Western Blotting Analysis)检测MT，检测限为0.6ng, 不仅可检

测MT，而且可检测其它与镉结合的蛋白质。随后，A ndersen等建立了以兔抗鼠MT抗体为一抗，过氧化物酶联羊抗兔IgG为二抗，4-氯-萘酚作显色剂的蛋白质印迹技术用于检测MT，其检测限可达1ng[14]。本法主要用于MT同分异构体的特性以及MT与各种金属离子相互作用的研究[15]。

6 巯基显色法巯基显色法(SH Color Code)适合于检测MT含量较高的样品，对含量较低的样品灵敏度较差。李立丽等[16]用ZnSO4诱导猪肝产生MT，然后将MT粗提液加入巯基试剂(1:1)，在分光光度计420nm处读取吸光度A值。用自制的MT纯品制作标准曲线，根据A值可在标准曲线上读出MT浓度。诱导后的猪肝中因MT含量较高采用其它方法均不能灵敏地进行检测，相对而言更适合采用巯基显色进行检测，并且巯基显色法操作简单、特异性较好，又可以避免放射性接触。

7 偶联技术金属饱和分析对单一MT亚型缺乏选择性：免疫学分析不能定量混合物中单一MT亚型，不能给出原始金属组成，根据UU信号或染色定量灵敏度相对较低, 不能测定非诱导MTs。若将高效分离技术和灵敏特异的选择性检测器联合起来， 将是一种理想的MTs检测策略。最近发展的电喷离子化MS、碰撞诱导分离(CID)MS和离子喷射源加强片段分别根据分子量、氨基酸序列、金属含量给出MT的详细特征。偶联技术(coupled techniques)是快速灵敏、全面定性定量生物标本中MT

亚型的一种最具吸引力的工具，未来能有效代替金属饱合分析、免疫分析而进入生化和临床实验室[17]。高效的分离技术与灵敏的检测技术“杂交”形成的偶联技术，恰能克服以前各种方法的缺点，快速、有效测定MT。因此，偶联技术的应用与发展，必将成为未来MT检测方法的发展方向。综上所述，灵敏性（即最小检出量）是选择检测MT方法的一个重要指标。因而测定组织器官中的MT的含量，首推HPLC-AAS法，测定体液(如血液、尿液等)中的MT含量，选用RIA和ELISA法为佳。每种检测方法其结果

57梁鹏等：金属硫蛋白检测方法研究进展都可能会受到某些因素的影响：（1）样品的处理方法；（2）MT结合金属的种类；（3）MT同形体的多态性；（4）大量MT蛋白和非MT蛋白中MT的高比例等。金属结合法适于测定MT含量较高的样品；HPLC适于分离和检测MT的同分异构体，此外，电化学法和蛋白印迹分析还可用于研究MT的构型变化及其与金属离子相互作用的关系；免疫法则适于检测MT含量较低的样品；MT检测方法需要标准化，对所测得的结果作出适当的解释，如所测得的MT是总量还是其中的一种类型或亚型，或者是氧化状态还是还原状态，有待进一步探讨。◇参考文献［1］Patierno SR，Pellis NR，Evans RM ，et al.Application of modified 203Hg binding assay for metallo thionein. Life Sciences，1983，32：1629-1636.［2］张保林，盛湘溶，刘兴军，等. 金属硫蛋白测定方法—银饱和分析法. 药物生物技术，1996 ，3 (1)：31-33.［3］Olafson R W，Sim R G. An electrochemical approach to quantitation and characterization of metallothioneins. Analytical Biochemistry，1979，100：343-351.［4］Bebianno MJ ，Langston WJ . Cadmium induction of metallothionein synthesis in Mytilus galloprovincialis. Comp Biochem Physiol ，1992 ，103：79-85.［5］铁峰，茹刚，李令媛，等.金属螯合亲和层析纯化金属硫蛋白. 生物化学与生物物理进展，1994，21(5) ：447-450.［6］李明春，李登文，胡国武，等.酵母菌类金属硫蛋白的分离、纯化及性质鉴定. 菌物系统，2001，20(2)，214-221.［7］郑军恒，茹刚.人肝金属硫蛋白的分离纯化及酶联免疫吸附检测. 北京大学学报(自然科学版)，1999，35(2)： 225-229.［8］Apostolova M，Nachev C，Kloeva Metal. New competitive enzyme-linked immunosorbent assay for determination of metallothionein in tissue and sera. Talanta，1998，46：325-333［9］林，任宏伟，茹炳根.鱼体内金属硫蛋白与水环境关系的研究. 北京大学学报（自然科学版），2001，37(6)：779-784.［10］黄波，金泰翼.ELISA竞争法测定人尿金属硫蛋白的初步应用. 劳动医学，2000，17(3)：151-153.［11］Klein D ，Sato S，Sunner K H. Quantification of oxidized metal lothionein in biological material by a Cd saturation method. Analytical Biochemisty，1994，221：405-409.［12］Hunziker P E ，Kaur P ，Wan Metal. Primary structure of seven MTs from rabbit tissue. Biochenistry J，1995，306：265-270.［13］Jin N，Kimura M，Yokoik，et al.A gel filtration high-perform anceliquid chromatographic method for determination of hepatic and renal MT of rat and in comparison with the Cd-sarutation method. Boil Trace Eelen Res，1993，36(2)：183-190.［14］Andersen RA ，Daae HL. Preparation of metal lothionein from rat liver and studies of its properties with respect to use as astandard in gel permeation chromato graphy，polyacrylamide gel systems. Comp Biochem Physiol，1988，90(1)：59-67.［15］Whitacre CM. Application of western blotting to the identification of metal lothionein binding protein. Anal Biochem，1996，234：99-102.［16］李丽立，张彬，印遇龙，等.猪肝金属硫蛋白的诱导效果. 广西农业生物科学，2004 ，23(4) ：270-273.［17］Lobinski R，Chassaigne H，et al. Analysis for metallothioneins using coup led techniques. Talanta，1998; 46： 271-289.