第十三章生化药物制造工艺酶类药物

• 2、消炎酶类
•3、与纤维蛋白溶解作用有关的酶类
•4、抗肿瘤的酶
•5、其它药用酶
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第十三章生化药物制造工艺酶类药物
•1、胃蛋白酶（Pepsin，EC3.4.4.1）
• 胃蛋白酶广泛存在于哺乳类动物的胃液中，药用 胃蛋白酶系从猪、牛、羊等家畜的胃粘膜中提取。
•（1）组成（结构）、性质
• 结晶时采用的盐有硫酸铵、柠檬酸钠、乙酸钠、 硫酸镁和甲酸钠等。
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第十三章生化药物制造工艺酶类药物
• ②有机溶剂法。
• 酶液中滴加有机溶剂，有时也能使酶形成结晶。
• 结晶用的有机溶剂有：乙醇、丙醇、丁醇、乙腈、 异丙醇、二恶烷、二甲亚砜、二氧杂环己烷等。用有 机溶剂法易引起酶失活。
• 喷雾干燥用于菌体干燥，而药用酶常用冷冻干燥。
• 除上述方法外，工业上提取酶制剂的方法还有丹 宁沉淀法、白土活性氧化铝吸附法、pH或加热沉淀 法、蛋白质表面变性法等。
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第十三章生化药物制造工艺酶类药物
•（四）酶的纯化
• 酶的纯化。评价主要看二个指标，一是酶比活， 二是总活力回收。
• 本节重点讨论酶在纯化过程中遇到的一些技术难 点。
• 利用蛋白质表面变性性质的差别，也可除去杂蛋 白。例如：加入三氯甲烷和乙醇进行震荡，可以除去 杂蛋白。
•（3）选择性变性法
• 利用蛋白质稳定性的不同，除去杂蛋白。甚至可 用2．5％三氯乙酸处理，这时其他杂蛋白都变性而沉 淀。
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第十三章生化药物制造工艺酶类药物
•（4）核酸沉淀剂法
• 在用微生物制备酶时，常含有较多的核酸，为此， 可用核酸酶，将核酸降解成核苷酸。
• 组织经丙酮迅速脱水干燥制成丙酮粉，不仅可减 少酶的变性，同时因细胞结构成分的破碎使蛋白质与 脂质结合的某些化学键打开，促使某些结合酶释放到 溶液中，真空干燥即得丙酮粉。
• 丙酮粉在低温下可保存数年。
•2、微生物的预处理
• 要是酶是胞外酶，则可除去菌体后再直接从发酵 液中吸附提取酶。但对胞内酶则需将菌体细胞破壁， 制成无细胞的悬液后再行提取。
• 还要研究酶的分离提纯技术和制备工艺，这些条 件的综合结果将决定酶生产本身的经济效益。
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第十三章生化药物制造工艺酶类药物
•二、酶类药物的提取和纯化
•（一）生物材料的预处理
• 一般应避免剧烈处理，但如是结合酶，则必须进 行剧烈处理。
•1、动物材料的预处理
•（1）机械处理
• 用绞肉机绞，一般细胞并不破碎，而有的酶必须 细胞破碎后才能有效地提取，因此须采用特殊的匀浆 才行。
第十三章生化药物制造工艺酶类药物
• ④ 时间。
• 结晶形成的时间长短不一，从数小时到几个月都 有，有的甚至需要1年或更长时间。
• ⑤ pH。除沉淀剂的浓度外，在结晶条件方面最重 要的因素是pH。结晶溶液pH一般选择在被结晶酶的 等电点附近。
• ⑥金属离子。许多金属离子能引起或有助于酶的结 晶，在二价金属离子存在情况下，有促进结晶长大作 用。
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•3、表面活性剂法
• 表面活性剂分子具有亲水性的或疏水性的原子基 团。表面活性剂能与蛋白质结合而分散在溶液中，故 可用于提取结合酶，但此法用得较少。
•（三）酶制剂的工业提取法
• 工业生产的酶有二种剂型——液体制剂和粉剂
•1、发酵液的预处理及过滤
• 现在处理方法是，在发酵液中加絮凝剂或凝固剂。
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第十三章生化药物制造工艺酶类药物
•2、有机溶剂法 • 某些结合酶如微粒体和线粒体膜的酶，由于和脂 质牢固结合，用水溶液很难提取，为此必须除去结合 的脂质，且不能使酶变性。
• 最常用的有机溶剂是丁醇。 • 丁醇具有下述性能： • ① 亲脂性强，特别是亲磷脂的能力； • ② 兼具亲水性，在0℃在水中的溶解度为10.5％； • ③ 在脂与水分子间能起类似去垢剂的桥梁作用。
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•（1）干燥法
• 干燥方法很多，常见有空气干燥、真空干燥和冷 冻干燥三种。
•（2）机械法
• 常用的方法有研磨法，组织匀浆法，超声波法， 高压匀浆法等。
•（3）酶法处理
• 用得最多的是溶菌酶，也有用脱氧核糖核酸酶处 理，操作与溶菌酶同。
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第十三章生化药物制造工艺酶类药物
•（三）微生物酶制剂生产的发酵技术
• 有了优良的生产菌株，只是酶生产的先决条件， 要有效地进行生产还必须探索菌株产酶的最适培养条 件。首先要合理选择培养方法、培养基、培养温度、 pH和通气量等。
• 在工业生产中还要摸索一系列工程和工艺条件， 如培养基的灭菌方式、种子培养条件、发酵罐的型式、 通气条件、搅拌速度、温度和pH调节控制等。
•（2）结晶条件的选择
• 在进行酶的结晶时，要选择一定条件与相应的结晶 方法配合。这不仅为了能够得到结晶，也是为了保证 不引起酶活力丧失。
• 影响酶结晶因素很多，下列几个条件尤为重要：
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第十三章生化药物制造工艺酶类药物
• ① 酶的纯度。
• 总的来说酶的纯度越高，结晶越容易，长成大的 单晶可能性也越大。
• 盐析法的优点是在常温下不会造成酶的失活，若 分级沉淀应用得当，杂蛋白杂质也较少，适用于多种 酶沉淀。
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•4、有机溶剂法
• 用有机溶剂沉淀蛋白质及用分级沉淀法纯化蛋白 质。工业上通常采用乙醇作为沉淀剂。
•5、喷雾干燥直接制各粉末酶制剂
• 喷雾干燥有很大局限性，尤其药用酶制剂都很难 过温度这一关。
• 药用胃蛋白酶是胃液中多种蛋白水解酶的混合物， 含有胃蛋白酶、组织蛋白酶、胶原酶等，为粗制的酶 制剂。
• 水溶液呈酸性，难溶于乙醇、氯仿等有机溶剂。
• pI为pH1.0，最适pH1.5～2.0。可溶于70％乙醇和 pH4的20％乙醇中。
• 胃蛋白酶能水解大多数天然蛋白质底物。
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• 微生物发酵液的分离，过滤，常采用的设备是转 鼓式真空吸滤机、离心沉降分离机和板框压滤机。
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•2、酶液的脱色
• 工业上廉价的脱色剂是活性炭，用量通常为0．1 ％～1．5％。
• 目前工业上大规模使用脱色树脂国内生产的几种 脱色树脂，效果都较好。
•3、盐析法
• ② 酶的浓度。
• 结晶母液通常应保持尽可能高的浓度。酶的浓度 越高越有利于溶液中溶质分子间的相互碰撞聚合，形 成结晶的机会也越大，对大多数酶来说，蛋白质浓度 为5～10mg／ml为好。
• ③温度。
• 结晶的温度通常在4℃下或室温25℃下，低温条 件下酶不仅ຫໍສະໝຸດ Baidu解度低，而且不易变性。
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第十三章生化药物制造工艺酶类药物
•（1）酶的结晶方法
• 酶的结晶方法主要是缓慢地改变酶蛋白的溶解度， 使其略处于过饱和状态。
• 改变酶溶解度的方法很多，一般新样品往往要使 用几种方法才能得到结晶。
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第十三章生化药物制造工艺酶类药物
• ①盐析法。
• 在适当的pH、温度等条件下，保持酶的稳定， 慢慢改变盐浓度进行结晶。
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第十三章生化药物制造工艺酶类药物
• ⑦ 晶种。不易结晶的蛋白质和酶，有的需加入微 量的晶种才能结晶。生长大的单晶时，也可引入晶种。
• ⑧ 结晶器皿处理。结晶用的器皿要充分清洗、烘 干。使用前用结晶母液再冲洗一次，也可用压缩空气 或惰性气体吹去灰尘。
• 用于长结晶的玻璃器皿，可用硅涂料进行表面处理， 以使表面光滑且不润湿。这样可减少晶核数目，有助 于形成大的单晶。
• 1、杂质的除去
• 酶提取液中，除所需酶外，还含有大量的杂蛋白、 多糖、脂类和核酸等。
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第十三章生化药物制造工艺酶类药物
•（1）pH和加热沉淀法
• 利用蛋白质酸碱变性性质的差别可以通过调pH和 等电点除去某些杂蛋白，也可利用不同蛋白质对热稳 定的差异，使杂蛋白变性而沉淀。
•（2）蛋白质表面变性法
其他蛋白变性剂接触。如要用有机溶剂处理酶液，操 作尽可能在低温下，短时间内进行。
•（2）防止辅因子的流失 有些酶除酶蛋白外，还含有
辅酶、辅基和金属等辅因子。在进行超滤、透析等操
作时，要防止这些辅因子的流失。
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第十三章生化药物制造工艺酶类药物
•（3）防止酶被蛋白水解酶降解 在提取液尤其微生物 培养液中，常常同时存在一些蛋白水解酶，要及时采 取有效措施将它们除去。
第十三章生化药物制造工艺酶类药物
•（二）酶的提取
• 一般在提取前，应通过调查研究，文献检索，详 细了解欲提取酶的性质。
• 提取方法主要有水溶液法，有机溶剂法和表面活 性剂法三种。
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第十三章生化药物制造工艺酶类药物
•1、水溶液法 • 常用稀盐溶液或缓冲液提取。为了防止提取过程 中酶活力降低，一般在低温下操作。
•（2）生产工艺 • 1）工艺路线： • 胃蛋白酶原盐酸催化激活成胃蛋白酶。 • 常用的脱脂剂有乙醚、氯仿、四氯化碳。
第十三章生化药物制造 工艺酶类药物
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2020/11/28
第十三章生化药物制造工艺酶类药物
•（3）从原料来源是否丰富考虑；
•（4）从简化提纯步骤着手。
•（5）如用动物组织作原料，则此动物宰杀后应立即 取材。
• 从动物或植物中提取酶受到原料的限制。
• 用微生物发酵法生产药用酶，不受季节、气候和 地域的限制，生产周期短，产量高，成本低，能大规 模生产。
• 也可用一些核酸沉淀剂如二甲基十六烷基溴化铵、 硫酸链霉素、聚乙烯亚胺、鱼精蛋白和二氯化锰等：
•（5）将酶与底物结合，
• 酶和底物结合或竞争性抑制剂结合后，稳定性大 大提高，这样就可用加热法除去杂蛋白。
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第十三章生化药物制造工艺酶类药物
•2、脱盐和浓缩
•（1）脱盐 酶的提纯以及酶的性质研究中，常常需要 脱盐。最常用的脱盐方法是透析和凝胶过滤。
• ③复合结晶法。
• 有时可以利用某些酶与有机化合物或金属离子形 成复合物或盐的性质来结晶。
• ④透析平衡法。
• 对一定的盐溶液或有机溶剂进行透析平衡，这时 酶液可缓慢地达到过饱和而析出结晶。
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第十三章生化药物制造工艺酶类药物
• ⑤等电点法。
• 一般地说，在等电点附近酶的溶解度很小，这一特 征为酶的结晶条件提供了理论根据。
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第十三章生化药物制造工艺酶类药物
• 在实验室常用的是玻璃匀浆器和组织捣碎器。
• 工业上可用高压匀浆泵。
•（2）反复冻融
• 由于细胞中冰晶的形成，及剩下液体中盐浓度的 增高，能使细胞中颗粒及整个细胞破碎，从而使某些 酶释放出来。
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第十三章生化药物制造工艺酶类药物
•（3）丙酮粉
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•4、酶分离和纯化工作中的注意事项
• 酶是蛋白质，一般不太稳定。提纯过程中，酶纯 度越高，就越不稳定，酶分离纯化时尤其要注意以下 几点：
•（1）防止酶蛋白变性 为防止酶蛋白变性，应避免 pH过高或过低，应避免高温。一般要在中性pH和低 温（4℃左右）下操作。为防止酶蛋白的表面变性， 不可剧烈搅拌，以免产生泡沫。应避免酶和重金属或
•（2）浓缩 酶的浓缩方法很多，有冷冻干燥、离子交 换、超滤、凝胶吸水、聚乙二醇吸水等。
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第十三章生化药物制造工艺酶类药物
•3、酶的结晶
• 把酶提纯到一定纯度以后（通常纯度应达50％以 上），可使其结晶，但伴随着结晶的形成，酶的纯度 经常有一定程度的提高。
• 酶的结晶既是提纯的结果，也是提纯的手段，此 外，为研究蛋白质空间结构提供Ⅹ射线衍射样品，也 是酶的结晶的重要目标之一。
• 如果操作时间长，还要防止杂菌污染酶液，造成 所需要酶的失活。
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第十三章生化药物制造工艺酶类药物
•三、重要酶类药物的制备
•（一）药用酶类的概述
• 现在国内外已广泛应用于多种疾病的治疗，其 制剂品种已超过700余种。
•1、与治疗胃肠道疾病有关的酶类药物
• 利用酶作为消化促进剂，早已为人们所采用。
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第十三章生化药物制造工艺酶类药物
•（二）微生物酶制剂高产菌株的选育 • 菌种是工业发酵生产酶制剂的重要条件。 • 目前，优良菌种的获得有三条途径： • ①是从自然界分离筛选； • ②是用物理或化学方法处理、诱变； • ③是用基因重组与细胞融合技术。 • 微生物的分离筛选是一切工作的基础。