第十三章 生化药物制造工艺 核酸类药物

六、胞二磷胆碱（CDP-胆碱）
（一）结构与性质 胞二磷胆碱其化学名称为胞嘧啶核苷 -5 ＇ - 二磷酸 胆碱钠盐本品为白色无定形粉末，易吸湿，易溶于水， 几不溶于乙醇、氯仿、丙酮等多数有机溶剂。
四、阿糖胞苷
（一）结构与性质
阿糖胞苷又称胞嘧啶阿拉伯糖苷，糖的组成部分 是阿拉伯糖。 阿糖胞苷进入体内转变为阿糖胞苷酸，抑制DNA聚 合酶，抑制DNA的合成，干扰DNA病毒繁殖和肿瘤 细胞增殖。
（二）生产工艺
1．以5＇－CMP为原料的合成法 （1）工艺路线：
2、以葡萄糖酸钙为原料的合成路线
（五）聚肌胞苷酸（聚肌胞）
（三）核苷的制备
本节叙述核苷的化学法和发酵法生产。 1、RNA化学水解法制备核苷 （1）核苷生产工艺流程 RNA经甲酰胺化学水解制备核苷
2、发酵法生产核苷
发酵法生产核苷是近代发酵工程领域中的杰出成果， 产率高，周期短，控制容易，产量大。用发酵法生产 各种核苷的菌株有着许多共同特点： ①它们都使用磷酸单酯酶活力很强的枯草芽孢杆菌 或短小芽孢杆菌为诱变出发菌株； ②它们都是通过使用物理或化学诱变方法选育出在 遗传性状上具有特定标记的诱变菌；
此合成路线的起始原料是胸苷。
（二）阿糖腺苷Adenine arabinoside
1、结构与性质 阿糖腺苷的化学名称为 9-β-D-阿拉伯呋喃糖腺嘌呤， 或称腺嘌呤阿拉伯糖苷。 早在1960年就在实验室合成了阿糖腺苷，1969年美 国用Streptomyces antibioticus NRRL3238菌株，1972年 日本用Strepto－myces hebacecus 4334菌株发酵法分别 制备了阿糖腺苷。
（2）以5`-AMP为原料的化学合成
3、作用与用途 阿糖腺苷是近年来引人注目的广谱DNA病毒抑制 剂，对单纯疱疹Ⅰ、Ⅱ型，带状疱疹，巨细，牛痘等 DNA病毒，在体内外都有明显抑制作用。 而且阿糖腺三磷对于病毒DNA聚合酶的亲和性比 宿主细胞的同一个酶的亲和性高。因此这个药物对于 抑制病毒具有较高选择性。
1、结构与性质 1967年美国人Field发现聚肌胞是干扰素诱导物，而 且具有广谱抗病毒作用。本品是人工合成的干扰素诱 导剂，系由多聚肌苷酸和多聚胞苷酸组成的双股多聚 核苷酸。本品可溶于0.85％氯化钠溶液。 2、生产工艺 聚肌胞生产工艺如下：
1）底物5-核苷二磷酸吡啶盐的制备
2）固定化多核苷酸磷酸化酶
（5）碱水解法生产2＇，3＇-混合核苷酸
RNA 结构中的磷酸二酯键对于碱性条件不稳定， 很容易生成 2′， 3-环状磷酸酯，此环状磷酸酯对碱更 不稳定，很易加水分解生成2‘，3’-混合核苷酸。 从 RNA水解成 2′ ， 3‘- 核苷酸的降解率达 95％以上， 将2′，3’-混合核苷酸制成每片含50～100mg的片剂。 经临床使用，对非特异性血小板减少症、对白血 球减少症、癌肿的化疗和放疗后的升白血球均有较好 疗效。
DNA疫苗为目前尚无满意疗法的某些疾病（如慢 性病毒性肝炎、疟疾、艾滋病）提供一种新的治疗途 径。
二、核酸类物质的分离提取及其发酵生产
（一）RNA与DNA的提取与制备 1、 RNA的提取与制备 （l）工业用RNA的提取 ① RNA及其工业来源 从微生物中提取RNA是工 业上最实际和有效的方法。一些最常见的菌体含有丰 富的核酸资源，如酵母、白地霉、多种抗菌素的菌丝 体。
2、发酵法生产核苷酸
（1）发酵法生产肌苷酸（IMP） （2）发酵生产黄苷酸（XMP）及酶法转化成鸟苷酸
3、半合成法制备核苷酸
由于发酵法生产核苷的产率很高，核苷悬浮于磷酸 三甲酯或磷酸三乙酯中，在冷却条件下加入氯化氧磷， 进行磷酸化，从核苷生成5′-核苷酸收率可达90%。 例一：肌苷2mmol／L悬浮于5ml磷酸三乙酯中，温 度控制 0℃，添加氯化氧磷 6mmol ／ L ，水 2mmol ／ L ， 反应2h，5＇-IMP摩尔产率达91％。 例二：鸟苷2mmol／L悬浮于5ml磷酸三甲酯中，温 度控制 0℃，添加氯化氧磷 6mmol ／ L ，水 2mmo/L ， 反应6h，5＇-GMP摩尔产率达90%。
（3）双酶法生产肌苷酸和鸟苷酸（I＋G）
呈味核苷酸的主要品种是肌苷酸钠和鸟苷酸钠， 商品名简称为（I＋G），用核酸酶Pl降解RNA可获得 GMP和AMP，其中AMP经脱氨生成IMP。双酶法生 产（I十G）工艺 。
（4）菌体自溶法生产核苷酸
磷酸二酯酶在合适的条件下降解细胞内的RNA可 产生5′-核苷酸。在国内用谷氨酸产生菌体自溶法生产 5‘-核苷酸。 （1）菌体自溶法生产核苷酸工艺流程：
（ 3 ）固定化多核苷酸磷酸化酶，将分离纯化的酶液 滴加入冰浴中的载体，得到共价结合的固定化多核苷 酸磷酸化酶。 3、Poly I：C制备
（ 1 ）底物预处理： CDP 吡啶盐转成锂盐， IDP 吡啶 盐转成钠盐。
（2）酶促反应： （每毫升反应液含μmol／L数）IDP 或CDP 15；Tris 150；MgC126；
随着分子生物学和遗传工程的发展，基因治疗应 运而生，得到广泛的肯定。其中包括反义核酸技术， 简称反义技术。利用这一技术研制的药物称为反义药 物，根据核酸杂交原理，反义药物能与特定基因杂交， 在基因水平干扰致病蛋白的产生过程，及干扰遗传信 息从核酸向蛋白质的传递。
反义核酸作为药物与常规药物相比有两个显著特 点： ① 有关疾病的靶基因mRNA序列是已知的，因 此，设计合理特异性的反义核酸比较容易； ② 反义寡核苷酸与靶基因能通过碱基配对原理 发生特异和有效的结合从而调节基因的表达。
第三节 核酸类药物
一、核酸类药物概述 核酸类药物可分为两大类，一类为具有天然结构 的核酸类物质，缺乏这类物质会使机体代谢失调，发 生病态，提供这类物质，有助于改善机体的物质代谢 和能量平衡。 第二类为天然结构碱基、核苷、核苷酸结构类似 物或聚合物，这一类核酸类药物是当今人类治疗病毒、 肿瘤、艾滋病等的重要手段，也是产生干扰素、免疫 抑制的临床药物，已经在临床上应用的抗病毒核苷酸 类药物有以下一些品种：
EDTA 1；聚合酶5单位，pH9.0，37℃，3～4小时。 用盐酸调pH1.5～2.0，使PolyI（或Poly C）沉淀，立 即离心。此后在磷酸液冲液中溶解，等摩尔 Poly I 与 Poly C混合，生成产品 。
（三）作用与用途 本品具有抗病毒，抗肿瘤，增强淋巴细胞免疫功能 和抑制核酸代谢等作用。本品注入人体诱导产生干扰 素。
通常在细菌中 RNA 占 5 ％～ 25 ％，在酵母中占 2.7 ％～1含量的变化受培养基组成影响，其 中关键是铵离子浓度和磷酸盐浓度。培养酵母菌体收 率高，易于提取RNA。
很显然在许多酵母中，早期细胞中的 RNA 含量高， 其确切数值取决于碳、氮比例和培养基组成等。 ② 高RNA含量酵母菌株的筛选 可以从自然界筛选 到RNA含量高的酵母菌株，也可用诱变育种的方法提 高酵母菌的RNA含量。 ③ 工业废水培养高含量RNA酵母 RNA的提取的方法：
（二）用酶解法、发酵法和半合成法制备核苷酸 1、酶解法及碱水解法制备核苷酸 （1）酶解法制备脱氧核苷酸 桔青霉产生5`-磷酸二脂酶 红酵母产生3`-磷酸二脂酶
（2）酶解法制备戊糖核苷酸
我国从 60 年代开始使用核酸酶 P1 降解核糖核酸生 产单核苷酸，日本年产呈味核苷酸（肌苷酸和鸟苷酸） 3000吨，其中60%是使用酶解法生产的。 酶解法生产5‘－单核苷酸工艺流程
1979年用 从E．Coli中分离得到的尿嘧啶磷酸化酶 和嘌呤核苷磷酸化酶，以固相酶的方法将阿糖脲苷转 化为阿糖腺苷。
2、生产工艺
（1）酶-化学合成法 最新的阿糖腺苷的合成法是酶-化学合成法：用尿 苷为原料生成氧桥化合物，水解成阿糖尿苷，经酶法 转化成阿糖腺苷。 经选育的优秀菌株是产气肠杆菌，能产生尿苷磷酸 化酶（Upase）和嘌呤核苷磷酸化酶（Pynpase），从 阿糖尿苷和腺嘌呤能高效地合成阿糖腺苷，菌体也可 制成固定化细胞进行连续生产。
稀碱法：是用氢氧化钠溶液（1%），使细胞壁变 性，使核酸从细胞内释放出来。需用酸中和pH7。然 后除去菌体，将pH调至RNA的等电点（pH2.5），使 RNA沉淀出来。
此法的缺点是制得的RNA Mr较低,(磷酸单脂酶、 磷酸二脂酶降解RNA，90 ℃保持3~4h破坏酶)。
浓盐法：是用高浓度盐溶液（6%~8%）处理，同 时加热，以改变细胞壁的通透性，使核酸从细胞内释 放出来。 要避免分子降解，可采用苯酚法制备RNA 。用苯 酚处理生物材料，使蛋白质变性，然后离心，上层水 溶液内含有全部RNA，可用乙醇沉淀出来。
脱 氧 核 糖 核 蛋 白 溶 于 浓 盐 溶 液 1mol/L, 不 溶 于 0.14mol/L,而核糖核蛋白溶于0.14mol/L盐溶液。
④ RNA的提取实例：啤酒酵母是提取RNA的很好 的资源。取100g压榨啤酒酵母（含水份70%），加入 230ml含NaOH 3g的水，20℃以下缓慢搅拌30分钟。 用6mol／L HCl调至pH7，搅拌15分钟，离心得清液 255m1 。冷至 10℃以下， 6mol ／ L HCl 调 pH2.5 ，置 冷过夜，离心得RNA l.8g（纯度80％）。
（三）三氮唑核苷
1、结构与性质 三氮唑核苷商品名病毒唑，对 DNA 病毒， RNA 病 毒都有广泛作用。 这个化合物在体内被磷酸化成三氮唑核苷酸，抑 制病毒DNA合成。
2 生产工艺
酶合成法 使用产气肠杆菌，以（尿苷）肌苷和TCA （三叠氮羧基酰胺）为底物可以用酶法简易地合成三 氮唑核苷
采用前段与后段由两个不同的酶催化，即前段使用 嘧啶核苷磷酸化酶，后段使用嘌呤核苷磷酸化酶。
2、具有生物活性DNA的制备
动物内脏（肝、脾、胸腺）加 4 倍重量生理盐水 经组织捣碎机捣碎1分钟，匀浆于2500r／pm离心30分 钟。将沉淀悬浮于 20 倍重量的冷生理盐水中，加入 2 倍量 5 ％的（用 45% 乙醇作溶剂）十二烷基磺酸钠， 并搅拌2～3小时，在0℃2500r／pm离心，在上层液中 加入等体积的冷95％乙醇，离心即可得到纤维状DNA， 再用冷乙醇和丙酮洗涤，减压低温干燥得粗品DNA。 粗品DNA溶于适量蒸馏水，加入5％十二烷基磺酸 钠达1／10体积，搅拌1小时，经5000r／pm离心1小时， 清液中加入NaCl达1mol／L，再缓慢加入冷95%乙醇， DNA析出，经乙醇、丙酮洗涤，真空干燥得具有生物 活性的DNA。