重组包涵体的纯化与复性
兽 医 临 床
收稿日期:200703
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作者简介:
龙英娜(19812),女,硕士研究生1通讯作者:刘焕奇(19702),男,副教授,博士.重组包涵体的纯化与复性龙英娜,刘焕奇,王明志(莱阳农学院动物科技学院,山东青岛266109)中图分类号:Q816文献标识码:B文章编号:100427034(2008)042007002 大肠杆菌表达系统是目前最常用的外源蛋白表达系统,具有操作简单、生长快、成本低、产量高等优点。然而,此体系最大的问题在于表达产物往往为不可溶、无生物活性的包涵体。其包涵体中蛋白的一级结构(即氨基酸序列)是正确的,但是其立体结构是错误的,所以没有生物活性。包涵体一般含有50%以上的重组蛋白,其中无活性的重组蛋白量可占总重组蛋白表达量的95%,其杂质主要是核糖体元件、RNA聚合酶、外膜蛋白、环状或缺口质粒DNA以及脂体、脂多糖等。因此要获得高纯度的活性蛋白必须对其进行分离、纯化及进一步的复性处理。1 包涵体形成的原因1.1 目的基因的过度表达基因工程菌的表达产率过高,超过了细菌正常的代谢水平,使得大肠杆菌无法及时分泌出蛋白后期加工所需的众多酶类及辅助因子,从而使蛋白无法实现折叠或者无法形成正确的次级键,造成大量蛋白以包涵体形式存在于细胞内。此外,过多的蛋白质之间非特异性沉淀也是形成包涵体的原因之一。1.2 重组蛋白的氨基酸组成含硫氨基酸多的重组蛋白形成包涵体的机率大,其原因可能是宿主细胞内的还原性环境使表达蛋白二硫键稳定性下降,出现错配或多余的二硫键。已有试验证明,在胞质内形成氧化性环境将有利于二硫键的正确形成。1.3 重组蛋白所处的环境条件蛋白质形成的动力学研究表明,蛋白质折叠是一个产热过程。多种蛋白质在体内折叠过程中均有不耐热的中间体形成,这些中间体在环境温度升高时成为包涵体的前体物质,随后聚合成包涵体;当环境pH值接近某种蛋白的等电点时,蛋白的凝集也会增加,进而形成包涵体。此外,某些金属离子也能影响包涵体动力学的稳定,造成包涵体形成增加。1.4 原核细胞质内含物的限制目的基因所表达的重组蛋白,对大肠杆菌是异源蛋白,而大肠杆菌中缺乏真核生物翻译后修饰蛋白所需的酶类和辅助因子,如折叠酶或分子伴侣等,致使中间产物大量聚集,从而形成包涵体沉淀。2 包涵体的分离与纯化2.1 包涵体的分离包涵体的分离首先要进行细胞破碎,方法有机械法、超声法和化学法等。机械破碎法利用包涵体与细胞碎片的密度差,通过离心将包涵体与细胞碎片及可溶性蛋白质分开,从而获得纯净的包涵体。化学破菌法所采用的试剂既可以破菌又可以溶解包涵体,将两道工序融为一道,节省了设备和时间,比较适合于实验室操作。为了充分破碎细胞,减少细胞碎片的共沉淀,目前多采用机械破碎和化学破碎联合的方法。2.2 包涵体的洗涤细胞破碎后可经低速离心收获包涵体,分离出来的包涵体中除了目的蛋白外还含有脂类、脂多糖、核酸和杂蛋白等成分,故去折叠前应充分洗涤包涵体,以去除杂质。这一步很重要,因为大肠杆菌外膜蛋白OmpT(37ku)在4～8mol/L尿素中具有蛋白水解酶活性,在包涵体的溶解和复性过程中可导致重组蛋白质的降解。常用EDTA、低浓度的变性剂(尿素、盐酸胍)、弱去污剂TrionX-100、脱氧胆酸等洗涤包涵体,洗涤后包涵体的主要成分为聚合态的目的蛋白[1]。2.3 包涵体的溶解溶解包涵体需要用很强的变性剂,如6mol/L盐酸胍或8mol/L尿素。它们对包涵体氢键有较强的可逆性变性作用,并且易经透析和超滤除去。盐酸胍溶解能力比尿素强,且溶解作用快而不造成重组蛋白质的共价修饰。此外,用去垢剂也可溶解一些包涵体蛋白质。膜蛋白在E.coli中形成的包涵体,通常不易溶于尿素或盐酸胍,可用强去垢剂或温和去垢剂与变性剂联合使之溶解,如SunithaK等[2]成功地用Tri2tonX-100来溶解Zymononasmobilislevansucrase包涵体蛋白。对于含有半胱氨酸的蛋白质,溶剂中常加入二硫苏糖醇(DTT)、β-巯基乙醇(β-ME)等,它们可以还原包涵体链间形成的二硫键和链内的非活性二硫键;通常还要加入螯合剂,如EDTA、EGTA等来捕获07HeilongjiangAnimalScience andVeterinaryMedicine №42008兽 医 临 床一些金属离子以清除这些金属离子带来的不必要的氧化反应。3 包涵体的复性3.1 包涵体复性的机制大肠杆菌产生的包涵体颗粒尺寸范围大约为0.5～1μm,一般的水溶液很难将其溶解。在变性剂中溶解的蛋白质呈变性状态,其氢键、疏水键全被破坏,疏水侧链完全暴露,但其一级结构和共价键不被破坏。因此当除去变性剂时,一部分蛋白质可以自动折叠成具有活性的正确构型,这一折叠过程称为蛋白质的复性。并非所有变性的蛋白质都能自发恢复具有完全活性的天然构象。许多蛋白酶的正确折叠必须依赖前导肽(Pro肽)的帮助才能完成,如丝氨酸蛋白酶、半胱氨酸蛋白酶、金属蛋白酶和天冬氨酸蛋白酶等。有试验表明,伸展的肽链折叠成活性蛋白质并不是一步完成的,它经过早期折叠进入中间态,然后由中间态过渡到最终具有特定二维结构和生物活性的天然态[3]。中间态的形成很迅速,从中间态到天然构象折叠则是反应的限速步骤。由于蛋白再折叠过程中会产生一些错误折叠的中间体,而且缺乏协助折叠的辅助蛋白和酶,同时还受到聚集反应的竞争,因此体外折叠形成蛋白质天然构象所需时间从十几小时到几十小时不等。3.2 包涵体复性的方法3.2.1 稀释复性 稀释是最简单、有效的复性方法。稀释使变性剂及还原剂下降至一定浓度时,蛋白质分子开始重新折叠,但这意味着需要大量的复性缓冲液和生产成本的提高,因此不利于工业放大。目前稀释法主要有一次稀释、分段稀释和连续稀释3种方式[4]。3.2.2 透析复性 用变性液将蛋白稀释至较低浓度(0.01～0.2mg/mL)后装入透析袋中,用含低浓度变性剂的复性液低温透析。有一步透析法和多步透析法,此法优点是不增加体积,通过逐渐降低外透液浓度来控制变性剂的去除速度,但此法易形成无活性蛋白聚体,不适合大规模操作[4]。3.2.3 超滤复性 超滤复性是选择合适载留分子质量的膜,允许变性剂通过膜而蛋白质通不过。伴随变性剂的去除,以相同的速度加入复性液,蛋白浓度保持不变。这种方法较稀释法和透析法耗时显著减少,比较适合工业化生产。3.2.4 凝胶过滤柱复性 通过分子筛效应将变性蛋白质与变性剂加以分离,从而使变性蛋白质进入复性溶液进行复性。柱中最常用的介质有葡萄糖凝胶、琼脂糖凝胶、疏水色谱柱、亲和色谱柱和各种阴阳离子交换树脂。3.2.5 对含有二硫键的蛋白复性 蛋白结构中存在的二硫键越多,就越可能形成更多的不同组合,而其中只有一种结构是正确的天然构象。改变不适宜的氧化还原条件,使之达到平衡,可以帮助蛋白恢复正确的结构。目前最常用的方法是在透析液中加入氧化还原体系,包括氧化/还原谷胱甘肽、氧化/还原二硫苏糖醇(1,4-dithiothreitol,DTT)、胱胺/半胱胺、2-β-羟乙基二硫化物/β-巯基乙醇等。3.2.6 分子伴侣辅助蛋白质复性 分子伴侣是一组在胞内活动中起重要作用的多种蛋白和酶的总称。它们在蛋白折叠过程中可识别、捕获错误折叠的蛋白,从而控制折叠过程,包括磷酸二酯酶、脯氨酸异构酶、DnaK和GroE。目前,由于分子伴侣具有使用费用高、需要与复性蛋白质分离等缺点,在实际工作中较难应用。4 复性蛋白质的检测研究蛋白质的复性,必须建立适当的检测方法,以鉴定复性蛋白质的生化、免疫学、物理性质以及蛋白变性态与天然态的区别,从而对复性方法进行评价和条件优化。目前常用的检测方法:①凝胶电泳。其中最为常用的是还原和非还原的SDS-PAGE,适于鉴定产物的纯度及复性蛋白质的聚集状态。②光谱学方法。主要有紫外光谱、荧光光谱和圆二色谱CD等,用来研究蛋白质分子复性过程中构象的变化,特别用于鉴定折叠中间体和复性蛋白质的构象。③色谱学方法。利用蛋白质天然态和变性态色谱行为的差异来研究复性并用于复性蛋白质的检测。④黏度与浊度测定。蛋白质折叠状态不同,其溶解性和黏度存在一定差异,可通过测定溶液的浊度(常以600nm或400nm的光吸收值表示)来反映蛋白质聚集的快慢与程度。⑤免疫学方法。利用酶联免疫、蛋白印迹法可以测定不同状态蛋白质的抗体-抗原结合力的差异,说明其空间构象状态。⑥生物学活性及比活性测定。这是作为对最后的折叠状态评价的一个重要指标,一般是通过采用动物或细胞模型直接测定复性蛋白质所具有的生物学效应来表示。参考文献:[1] CLARKED.Proteinrefoldingforindustrialprocess[J].CurrOpinBiotechnol,2001,12(2):202-207.[2] SUNITHAK,CHUNGBH,JANGKH,etal.Refoldingandpuri2ficationofzymomonasmobilislevansucraseproducedasinclusionbodiesinfed-batchcultureofrecombinantEscherichiacoli[J].ProteinExprPurif,2000,18:338-393.[3] CREIGHTONTE.Intermediatesintherefoldingofreducedpancre2atictrypsininhibitor[J].JMolBiol,1974,87(3):579-602.[4] 邹平.重组包涵体蛋白质复性[J].厦门科技,2005(5):42-45.(009)17 《黑龙江畜牧兽医》2008年第4期
包涵体复性
包涵体表达的蛋白的复性包涵体表达的蛋白的复性
关于包涵体的纯化是一个令人头疼的问题，包涵体的复性已经成为生物制药的瓶颈，关于包涵体的处理一般包括这么几步：菌体的破碎、包涵体的洗涤、溶解、复性以及纯化，内容比较庞杂
一、菌体的裂解
1、怎样裂解细菌？
细胞的破碎方法
1.高速组织捣碎：将材料配成稀糊状液，放置于筒内约1/3体积，盖紧筒盖，将调速器先拨至最慢处，开动开关后，逐步加速至所需速度。此法适用于动物内脏组织、植物肉质种子等。
2.玻璃匀浆器匀浆：先将剪碎的组织置于管中，再套入研杆来回研磨，上下移动，即可将细胞研碎，此法细胞破碎程度比高速组织捣碎机为高，适用于量少和动物脏器组织。
3.超声波处理法：用一定功率的超声波处理细胞悬液，使细胞急剧震荡破裂，此法多适用于微生物材料，用大肠杆菌制备各种酶，常选用50-100毫克菌体/毫升浓度，在1KG至10KG频率下处理10-15分钟，此法的缺点是在处理过程会产生大量的热，应采取相应降温措施，时间以及超声间歇时间、超声时间可以自己调整，超声完全了菌液应该变清亮，如果不放心可以在显微镜下观察。对超声波及热敏感的蛋白和核酸应慎用。
4.反复冻融法：将细胞在-20度以下冰冻，室温融解，反复几次，由于细胞内冰粒形成和剩余细胞液的盐浓度增高引起溶胀，使细胞结构破碎。
5.化学处理法：有些动物细胞，例如肿瘤细胞可采用十二烷基磺酸钠（SDS）、去氧胆酸钠等细胞膜破坏，细菌细胞壁较厚，可采用溶菌酶处理效果更好，我用的浓度一般为1mg/ml。
无论用哪一种方法破碎组织细胞，都会使细胞内蛋白质或核酸水解酶释放到溶液中，使大分子生物降解，导致天然物质量的减少，加入二异丙基氟磷酸（DFP）可以抑制或减慢自溶作用；加入碘乙酸可以抑制那些活性中心需要有疏基的蛋白水解酶的活性，加入苯甲磺酰氟化物（PMSF）也能清除蛋白水解酶活力，但不是全部，而且应该在破碎的同时多加几次；另外，还可通过选择pH、温度或离子强度等，使这些条件都要适合于目的物质的提取。
包涵体变复性的原理
包涵体变复性的原理
体变复性是指物体的形态或结构随着外界条件的改变而发生变化。在自然界和人工制品中，都存在着体变复性的现象，如温度变化下金属的热胀冷缩、橡胶的伸缩变形等。体变复性的原理是可以根据物体的结构和材料的特性来解释的。
体变复性的现象是由于物体的结构和材料的特性所致。一个物体的结构可以看作是由许多微小的单元组成的，而这些微小的单元之间存在着相互作用力。当外界条件改变时，这些相互作用力的强度和作用方式也会发生变化，从而导致整个物体的形态或结构发生变化。
体变复性变化的原理可以从材料的微观结构和力学的角度来解释。对于某个物体而言，它的微观结构是由原子或分子组成的，这些原子或分子之间存在着相互作用力。当物体暴露在外界条件下时，温度、压力、湿度等因素会改变这些相互作用力的强度和作用方式。例如，在温度升高的情况下，物体的分子会加速运动，这使得各个微观单元之间的距离变大，从而导致整个物体的体积扩大，即热胀。相反，在温度降低的情况下，物体的分子的运动减慢，各个微观单元之间的距离变小，从而导致物体的体积缩小，即热缩。
除了温度的影响外，其他外界条件的改变，如压力、湿度等也会对物体的体变复性产生影响。在外界压力作用下，物体内部的微观单元之间的相互作用力发生变化，从而导致物体的体积发生变化。例如，在外界压力增大的情况下，物体的微观单元之间的距离减小，从而导致物体的体积减小，即压缩。相反，在外界压力减小的情况下，物体的微观单元之间的距离增大，从而导致物体的体积增大，即膨胀。
此外，湿度对物体的体变复性也有影响。某些材料在受潮后会吸收水分，导致材料体积膨胀，而在干燥的环境下则会失去水分，导致材料体积收缩。
总的来说，体变复性的原理是由物体的结构和材料的特性所决定的。当外界条件发生改变时，物体内部各个微观单元之间的相互作用力发生变化，从而导致物体的体积或形态发生相应的变化。这种体变复性的现象广泛应用于日常生活和工业生产中，例如热胀冷缩应用在计量仪器的设计、橡胶的应用等。在工程设计中充分考虑体变复性的特点，可以使产品更加稳定和可靠。
重组人干细胞因子工艺研究
重组人干细胞因子工艺研究
---------专业班级 姓名 学号
摘要 人干细胞因子(Human stem cell factor，hSCF)是一种重要的造血细胞因子，该文章在重组hSCF工程菌的基础上，通过高密度发酵培养、包涵体分离纯化、变复性、SP—Sepharose FF、Source 30RPC与Q—Sepharose FF层析等技术分离纯化出具有生物学活性的重组人干细胞因子，建立了适合大规模生产重组人干细胞因子的分离纯化工艺。
关键词 组人干细胞因子 包涵体 复性 分离与纯化 生物学活性 分离纯化工艺
人干细胞因子(Human stem cell factor，hSCF) 又称为肥大细胞生长因子(mast cellgro、Ⅵh factoL MGF)、kit配体(kit ligand，KL)及steel因子(steel
factoL SL)，为c．kit原癌基因编码受体的配体蛋白，是自1990年发现的一种重要的细胞因子。它能够刺激早期造血干细胞及祖细胞增值，是造血干细胞增值分化的关键因子【1】。hSCF能刺激造血细胞的生长、增生与分化。它可以与其它造血因子共同发挥作用，如与白细胞介素-3(IL-3)、白细胞介素-6(IL-6)、集落刺激因子(G-CSF)、促红细胞生成素(EPO)等表现出较强的协同效应，临床上SCF可用于治疗一系列原发性或继发性的(因毒性、辐射免疫损伤造成的)以髓细胞亚群数目减少为特征的干细胞功能异常等类型的疾病【2~4】。具有广阔的应用前景和药用开发价值。
正是由于SCF具有广阔的应用前景，所以对它的需求也很大，但是其天然来源有限，成熟型可溶性SCF(SCF165)在人体或动物体内含量甚微，在血中的浓度为3.3ng/mL，故不可能从天然组织中分离纯化足够量的样品进行实验室和临床应用研究【5】。大量实验证明，人SCF的糖基化对其活性不是必需的，如此就可以用基因工程方法，使用大肠杆菌等表达体系来生产重组人SCF(rhSCF)，以此来解决这个难题【6】。
(整理)包涵体表达的蛋白的复性
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------------- 包涵体表达的蛋白的复性
外源基因在大肠杆菌中的高表达常常导致包涵体的形成，虽然包涵体具有富集目标蛋白质、抗蛋白酶、对宿主毒性小等优点，但包涵体蛋白质的复性率一般都很低,而分子伴侣、低分子量添加物等在复性过程中的应用及新的复性方法的建立都大大提高了重组蛋白质复性产率。
一、 包涵体：
1.1包涵体的定义、组成与特性：
包涵体是指细菌表达的蛋白在细胞内凝集，形成无活性的固体颗粒。 一般含有50%以上的重组蛋白，其余为核糖体元件、RNA聚合酶、内毒素、外膜蛋白ompC、ompF和ompA等，环状或缺口的质粒DNA，以及脂体、脂多糖等，大小为0.5-1um，具有很高的密度（约1.3mg/ml），无定形，呈非水溶性，只溶于变性剂如尿素、盐酸胍等。NMR等新技术的应用表明包涵体具有一定量的二级结构，他们可能在复性的启动阶段中具有一定的作用。[1]
1.2包涵体的形成：
主要因为在重组蛋白的表达过程中缺乏某些蛋白质折叠的辅助因子，或环境不适，无法形成正确的次级键等原因形成的。
1.2.1、基因工程菌的表达产率过高，超过了细菌正常的代谢水平，由于细菌的δ因子的蛋白水解能力达到饱和，使之表达产物积累起来。研究发现在低表达时很少形成包涵体，表达量越高越容易形成包涵体。原因可能是合成速度太快，以至于没有足够的时间进行折叠，二硫键不能正确的配对，过多的蛋白间的非特异性结合，蛋白质无法达到足够的溶解度等。
1.2.2、重组蛋白的氨基酸组成：一般说含硫氨基酸越多越易形成包涵体，而脯氨酸的含量明显与包涵体的形成呈正相关。
1.2.3、重组蛋白所处的环境：发酵温度高或胞内pH接近蛋白的等电点时容易形成包涵体。
1.2.4、重组蛋白是大肠杆菌的异源蛋白，由于缺乏真核生物中翻译后修饰所需酶类和辅助因子，如折叠酶和分子伴侣等，致使中间体大量积累，容易形成包涵体沉淀。
复性资料总结
1 加人哮喘患者的血清1rnl(IgE1ng/rnl)孵育lh，用封闭液洗3次，加人辣根过氧化物酶标记的抗IgE重链的多克隆抗体孵育lh，用封闭液洗3次后进行显色反应。以小牛血清为阴性对照，以哮喘患者血清(IgE2ng/μl)10μl作阳性对照。
《人FcERIQ亚基细胞外区的原核表达及其和IgE结合的机制》
1．包涵体复性
1．1 包涵体纯化 诱导表达 250 mL细菌培养物 , 离心收集表达菌体。在 20 mL lysis buffer ( 10 mmol /L Tris pH8 .
0,150 mmol /L NaCl, 10 mmol /L EDT A, 100 g/L甘油 , 2 mmol /L DTT二硫苏糖醇, 0 . 5 mmol /L PMSF苯甲基磺酰氟400
mg/L溶菌酶 )中超声破碎后 , 离心收集沉淀。用 wash buffer (10 mL /L Triton- 100, 50 mmol /LTris pH8.0, 100 mmol /L
NaCl, 10 mmol /L EDT A, 2 mmol /L DTT) 洗涤包涵体 5次 , 每次 25 mL; 然后用 resus pen si onbuffer (50 mmol /L Tris
pH8 . 0, 100 mmol /L NaCl, 10 mmol /L EDT A, 2 mmol /L DTT) 洗涤 1次 , 最后离心沉淀即为纯化后的包涵体。
《人 Fc γRⅠ受体胞外区基因的克隆、 原核表达及纯化》
2.1回收PDGF-A/B包涵体
菌体破碎后，用0.05M磷酸缓冲液（ph 7.0）稀释四倍，离心，沉淀用0.02 mol l Tris–HCl (pH 8.5), 0.5mmol l EDTA, and
2% (v/v) Triton X-100洗3次。每次洗涤后8500g 4℃离心40min,最后一次离心前用25ml分装，10000g4℃离心40min，此时沉淀里含有PDGF-A/B包涵体，-70℃保存。
包涵体纯化方案
包涵体纯化方案
缓冲液配方：
1.变性复性缓冲液
缓冲液A：50mM Tris—HCl （pH8。5), 1mM EDTA①, 100mM NaCl②，1%Triton
X-100③
缓冲液B：50mM Tris—HCl (pH8.5）, 1mM EDTA， 100mM NaCl，1%Triton
X-100，2M脲素④
缓冲液C：50mM Tris-HCl （pH8。5）, 1mM EDTA, 100mM NaCl，1%Triton X—100
缓冲液D：50mM Tris-HCl （pH8。5）， 1mM EDTA， 100mM NaCl，1%Triton
X-100,2M盐酸胍④
溶解缓冲液E：50mM Tris-HCl （pH8.5）, 1mM EDTA， 100mM NaCl，10mM β-巯基乙醇/DTT⑤,2mM脱氧胆酸钠⑥，8M脲素
复性缓冲液：50mM Tris-HCl (pH8.5)，100mM NaCl ，6M/4M/2M脲素,1%甘氨酸⑦，5％甘油⑧，0。2％PEG⑨,1mM氧化型谷胱甘肽，1mM还原型谷胱甘肽⑩
2.纯化缓冲液
Binding buffer：50mM Tris-HCl， 100mM NaCl， 10mM 咪唑，pH8。5
Elution buffer：50mM Tris-HCl， 100mM NaCl, 不同浓度梯度咪唑， pH8.5
具体实施步骤：
1。大量诱导表达的菌液7000rpm离心10min。弃上清，用1×PBS重悬，洗涤菌体细胞，7000rpm，离心10min。再用PBS重复洗一遍。离心后留菌体沉淀.
2.将菌体细胞用缓冲液A重悬，液氮中反复冻融后,超声破碎。13000rpm离心10min,弃上清，收集包涵体沉淀。
2.分别用缓冲液B、C、D超声清洗包涵体沉淀。13000rpm离心10min收集沉淀.
3.用缓冲液E溶解包涵体，缓慢摇动使其缓慢溶解，室温放置30min,然后13000rpm离心10min。取上清。
包涵体复性 2
包涵体复性
结合液 80mm 300mm
Tris: 0.4 0.1 0.1
咪唑： 0.1 0.4 1.5
氯化钠： 2 0.5 0.5
尿素： 9.6g 2.4g 2.4g
水： 补足至20mL 补足至5mL 补足至5mL
1.菌体用裂解液重悬，加入溶菌酶，冰上30min或者时间更长一点。
2.破碎，离心，收集沉淀。加入包涵体溶解液，10min左右包涵体会溶解。在冰上进行，可放在摇床上。
3.处理镍柱，放出酒精，水洗2遍，结合液3ml平衡2遍。
4.将包涵体蛋白加入柱子中，结合1小时左右。
5.结合液冲洗柱子。
6.80mm 洗脱蛋白
7.300mm洗脱蛋白，收集2ml洗脱蛋白。
8.准备2个超滤管，分别加入1ml洗脱蛋白液，再加入不含尿素的PBS（可加入EDTA等），离心。再次加入PBS，离心，收集大约2ml的液体分装保存。
梯度透析法及稀释法蛋白的复性
蛋白的复性
重组基因在表达宿主中表达量过高或合成速度过快，以至于没有足够的时间进行折叠，二硫键不能正确配对，导致蛋白以包涵体的形式存在。导致包涵体形成的主要原因有以下几点：
⑴ 重组蛋白的氨基酸组成，一般说来含硫氨基酸越多越容易形成包涵体。
⑵ 重组蛋白所处的环境：诱导温度高或胞内pH接近蛋白的等电点时容易形成包涵体。
⑶ 重组蛋白是大肠杆菌(Escherichia coli)的异源蛋白，由于缺少真核生物中翻译后修饰所需酶类，致使中间体大量积累，容易形成包涵体沉淀。
⑷ 有报道认为，丰富的培养基有利于活性蛋白质的表达，当培养条件不佳时，容易形成包涵体。
包涵体内的蛋白是非折叠状态的聚集体，不具有生物学活性，因此要获得具有生物学活性的蛋白质必须将包涵体溶解，释放出其中的蛋白质，并进行蛋白质的复性。包涵体复性在世界范围内都是个难题，最好的复性方法也不会超过20%。目前大家在这方面研究也比较多，有研究证明一些分子伴侣有助于蛋白的复性；同时稀释、透析、渗透是最经典的蛋白复性的方法；另外氨基酸如精氨酸、糖类、醇类、表面活性剂对蛋白的复性都有辅助作用，还有很多的表达系统可以助复性。
本公司主要通过梯度透析和稀释的方法对变性蛋白进行复性。
梯度透析法
梯度透析缓冲液配方：
PBS（1L）：8.0NaCl、28.65gNa2HPO4·12H2O、0.234gNaH2PO4·2H2O
缓冲液A：50mM Tris-HCl (pH8.5)、1mM EDTA、100mM NaCl、1%Triton-X-100
缓冲液B：50mM Tris-HCl (pH8.5)、1mM EDTA、100mM NaCl、1%Triton X-100、2M脲素
缓冲液C：50mM Tris-HCl (pH8.5)、1mM EDTA、100mM NaCl、1%Triton-X-100、2M盐酸胍
溶解缓冲液D：50mM Tris-HCl (pH8.5)、1mM EDTA、100mM NaCl、10mM β-巯基/乙醇/DTT、2mM脱氧胆酸钠、8M脲素
包涵体的纯化实验报告(3篇)
第1篇
一、实验目的
本实验旨在通过一系列的实验步骤，对包涵体进行纯化，获得高纯度的目标蛋白。实验过程中，我们将运用包涵体的分离、裂解、复性、层析纯化等方法，确保目标蛋白的纯度和活性。
二、实验材料
1. 实验菌株：大肠杆菌表达菌株（含有目的基因）
2. 培养基：LB培养基、LB液体培养基、LB固体培养基
3. 诱导剂：异丙基-D-硫半乳糖苷（IPTG）
4. 裂解缓冲液：50 mM Tris-HCl (pH7.9), 0.1 mM EDTA, 5%甘油，0.1 mM DTT,
0.1 M NaCl
5. 包涵体洗涤缓冲液：含1% Triton X-100的裂解缓冲液
6. 复性缓冲液：透析缓冲液（10 mM Tris-HCl，pH 7.5，0.1 M NaCl）
7. 层析柱：镍柱
8. 层析缓冲液：Binding Buffer (BB)、Washing Buffer (WB)、Charge Buffer
(CB)
9. 其他：离心机、超声波破碎仪、电泳仪、凝胶成像系统、透析袋等
三、实验方法
1. 细胞培养与诱导
将含有目的基因的大肠杆菌表达菌株接种于LB固体培养基上，37℃过夜培养。次日，将单菌落接种于2 mL含相应抗生素的LB液体培养基中，37℃、180 r/min培养至A600nm=0.6。加入IPTG至终浓度为0.5～1 mM，诱导目的蛋白表达3～4 h。
2. 细胞裂解与包涵体分离
将诱导后的菌液转移至离心管中，8000 r/min离心10 min，收集细胞沉淀。用裂解缓冲液溶解细胞，超声波破碎细胞至清亮。12000 r/min离心20 min，收集包涵体。 3. 包涵体洗涤与复性
用含2 M尿素的BB洗涤包涵体，12000 r/min离心20 min。用含6 M尿素的BB溶解包涵体，12000 r/min离心20 min。将上清液或包涵体溶解液转移至透析袋中，在复性缓冲液中透析过夜。
蛋白质复性方法及其注意事项
1 蛋白质复性方法及其注意事项
蛋白前期准备
（1）查阅目标蛋白相关文献,了解其等电点，标签等注意点。
（2）如果目标蛋白易降解，可在纯化时加1—2mMDTT，全程低温，及时处理。
（3）透析Buffer的选择可参考文献。
蛋白复性
包涵体：在某些生长条件下，大肠杆菌能积累某种特殊的生物大分子，它们致密地集聚在细胞内，或被膜包裹或形成无膜裸露结构，这种水不溶性的结构称为包涵体(Inclusion Bodies,IB）。
在E.coli中累积的重组蛋白会迅速地以包涵体形式被沉淀出来,这些包涵体蛋白是丧失生物活性的不可溶的错误折叠蛋白的聚集体。
包涵体的处理一般包括这么几步：包涵体的洗涤、溶解、纯化及复性。
如果过表达蛋白在包涵体中，那么通常有两个选择可以考虑：(1）退一步，优化表达条件;(2）接受包涵体并采取策略来将蛋白溶解以及复性。这里主要考虑第二种方案。
包涵体的洗涤
破碎细胞都会使细胞内蛋白质或核酸水解酶释放到溶液中，使大分子生物降解，导致天然物质量的减少,加入蛋白酶抑制剂等，还可通过选择pH、温度或离子强度等，使这些条件都要适合于目的物质的提取。
洗涤Buffer：50mM Tris-HCl(pH8。0), 2mM EDTA，2mM DTT，150mM NaCl，
1％ Triton X—100， 1mg/ml Leupeptin， 1mg/ml Pepstatin,1mM TCEP。
超声时用40-60ml裂解液,因为我们的超声仪很适合用100ml小烧杯,装40-60ml裂解液,这样能让超声头离液面不高不低，不会洒出来。菌多就延长超声时间(全程冰浴）。
包涵体的溶解 2 1、对于尿素和盐酸胍的选择：
尿素和盐酸胍属中强度变性剂,易经透析和超滤除去。它们对包涵体氢键有较强的可逆性变性作用，所需浓度尿素8—10M，盐酸胍6—8M。尿素溶解包涵体较盐酸胍慢而弱,溶解度为70-90%，尿素在作用时间较长或温度较高时会裂解形成氰酸盐，对重组蛋白质的氨基进行共价修饰，但用尿素溶解具有不电离，呈中性，成本低，蛋白质复性后除去不会造成大量蛋白质沉淀以及溶解的包涵体可选用多种色谱法纯化等优点，故目前已被广泛采用。