重组包涵体的纯化与复性

兽　医　临　床收稿日期:20070305

作者简介:龙英娜(19812),女,硕士研究生1通讯作者:刘焕奇(19702),男,副教授,博士.重组包涵体的纯化与复性

龙英娜,刘焕奇,王明志

(莱阳农学院动物科技学院,山东青岛266109)

中图分类号:Q816文献标识码:B 文章编号:100427034(2008)042007002

大肠杆菌表达系统是目前最常用的外源蛋白表

达系统,具有操作简单、生长快、成本低、产量高等优点。然而,此体系最大的问题在于表达产物往往为不可溶、无生物活性的包涵体。其包涵体中蛋白的一级结构(即氨基酸序列)是正确的,但是其立体结构是错误的,所以没有生物活性。包涵体一般含有50%以上的重组蛋白,其中无活性的重组蛋白量可占总重组蛋白表达量的95%,其杂质主要是核糖体元件、RNA 聚合酶、外膜蛋白、环状或缺口质粒DNA 以及脂体、脂多糖等。因此要获得高纯度的活性蛋白必须对其进行分离、纯化及进一步的复性处理。1　包涵体形成的原因1.1　目的基因的过度表达

基因工程菌的表达产率过高,超过了细菌正常的代谢水平,使得大肠杆菌无法及时分泌出蛋白后期加工所需的众多酶类及辅助因子,从而使蛋白无法实现折叠或者无法形成正确的次级键,造成大量蛋白以包涵体形式存在于细胞内。此外,过多的蛋白质之间非特异性沉淀也是形成包涵体的原因之一。1.2　重组蛋白的氨基酸组成

含硫氨基酸多的重组蛋白形成包涵体的机率大,其原因可能是宿主细胞内的还原性环境使表达蛋白二硫键稳定性下降,出现错配或多余的二硫键。已有试验证明,在胞质内形成氧化性环境将有利于二硫键的正确形成。1.3　重组蛋白所处的环境条件

蛋白质形成的动力学研究表明,蛋白质折叠是一个产热过程。多种蛋白质在体内折叠过程中均有不耐热的中间体形成,这些中间体在环境温度升高时成为包涵体的前体物质,随后聚合成包涵体;当环境pH 值接近某种蛋白的等电点时,蛋白的凝集也会增加,进而形成包涵体。此外,某些金属离子也能影响包涵体动力学的稳定,造成包涵体形成增加。1.4　原核细胞质内含物的限制

目的基因所表达的重组蛋白,对大肠杆菌是异源

蛋白,而大肠杆菌中缺乏真核生物翻译后修饰蛋白所需的酶类和辅助因子,如折叠酶或分子伴侣等,致使中间产物大量聚集,从而形成包涵体沉淀。2　包涵体的分离与纯化2.1　包涵体的分离

包涵体的分离首先要进行细胞破碎,方法有机械法、超声法和化学法等。机械破碎法利用包涵体与细胞碎片的密度差,通过离心将包涵体与细胞碎片及可溶性蛋白质分开,从而获得纯净的包涵体。化学破菌法所采用的试剂既可以破菌又可以溶解包涵体,将两道工序融为一道,节省了设备和时间,比较适合于实验室操作。为了充分破碎细胞,减少细胞碎片的共沉淀,目前多采用机械破碎和化学破碎联合的方法。2.2　包涵体的洗涤

细胞破碎后可经低速离心收获包涵体,分离出来的包涵体中除了目的蛋白外还含有脂类、脂多糖、核酸和杂蛋白等成分,故去折叠前应充分洗涤包涵体,以去除杂质。这一步很重要,因为大肠杆菌外膜蛋白OmpT (37ku )在4～8mol/L 尿素中具有蛋白水解酶活性,在包涵体的溶解和复性过程中可导致重组蛋白质的降解。常用E DT A 、低浓度的变性剂(尿素、盐酸胍)、弱去污剂Tri onX -100、脱氧胆酸等洗涤包涵体,

洗涤后包涵体的主要成分为聚合态的目的蛋白[1]

。2.3　包涵体的溶解

溶解包涵体需要用很强的变性剂,如6mol/L 盐酸胍或8mol/L 尿素。它们对包涵体氢键有较强的可逆性变性作用,并且易经透析和超滤除去。盐酸胍溶解能力比尿素强,且溶解作用快而不造成重组蛋白质的共价修饰。此外,用去垢剂也可溶解一些包涵体蛋白质。膜蛋白在E .coli 中形成的包涵体,通常不易溶于尿素或盐酸胍,可用强去垢剂或温和去垢剂与变

性剂联合使之溶解,如Sunitha K 等[2]

成功地用Tri 2t onX -100来溶解Zy mononas mobilis levansucrase 包涵体蛋白。

对于含有半胱氨酸的蛋白质,溶剂中常加入二硫

苏糖醇(DTT )、

β-巯基乙醇(β-ME )等,它们可以还原包涵体链间形成的二硫键和链内的非活性二硫键;通常还要加入螯合剂,如EDT A 、EGT A 等来捕获

7Heil ongjiang Ani m al Science

and VeterinaryMedicine №4

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一些金属离子以清除这些金属离子带来的不必要的氧化反应。

3　包涵体的复性

3.1　包涵体复性的机制

大肠杆菌产生的包涵体颗粒尺寸范围大约为0.5～1μm,一般的水溶液很难将其溶解。在变性剂中溶解的蛋白质呈变性状态,其氢键、疏水键全被破坏,疏水侧链完全暴露,但其一级结构和共价键不被破坏。因此当除去变性剂时,一部分蛋白质可以自动折叠成具有活性的正确构型,这一折叠过程称为蛋白质的复性。并非所有变性的蛋白质都能自发恢复具有完全活性的天然构象。许多蛋白酶的正确折叠必须依赖前导肽(Pr o肽)的帮助才能完成,如丝氨酸蛋白酶、半胱氨酸蛋白酶、金属蛋白酶和天冬氨酸蛋白酶等。

有试验表明,伸展的肽链折叠成活性蛋白质并不是一步完成的,它经过早期折叠进入中间态,然后由中间态过渡到最终具有特定二维结构和生物活性的天然态[3]。中间态的形成很迅速,从中间态到天然构象折叠则是反应的限速步骤。由于蛋白再折叠过程中会产生一些错误折叠的中间体,而且缺乏协助折叠的辅助蛋白和酶,同时还受到聚集反应的竞争,因此体外折叠形成蛋白质天然构象所需时间从十几小时到几十小时不等。

3.2　包涵体复性的方法

3.2.1　稀释复性　稀释是最简单、有效的复性方法。稀释使变性剂及还原剂下降至一定浓度时,蛋白质分子开始重新折叠,但这意味着需要大量的复性缓冲液和生产成本的提高,因此不利于工业放大。目前稀释法主要有一次稀释、分段稀释和连续稀释3种方式[4]。

3.2.2　透析复性　用变性液将蛋白稀释至较低浓度(0.01～0.2mg/mL)后装入透析袋中,用含低浓度变性剂的复性液低温透析。有一步透析法和多步透析法,此法优点是不增加体积,通过逐渐降低外透液浓度来控制变性剂的去除速度,但此法易形成无活性蛋白聚体,不适合大规模操作[4]。

3.2.3　超滤复性　超滤复性是选择合适载留分子质量的膜,允许变性剂通过膜而蛋白质通不过。伴随变性剂的去除,以相同的速度加入复性液,蛋白浓度保持不变。这种方法较稀释法和透析法耗时显著减少,比较适合工业化生产。

3.2.4　凝胶过滤柱复性　通过分子筛效应将变性蛋白质与变性剂加以分离,从而使变性蛋白质进入复性溶液进行复性。柱中最常用的介质有葡萄糖凝胶、琼脂糖凝胶、疏水色谱柱、亲和色谱柱和各种阴阳离子交换树脂。3.2.5　对含有二硫键的蛋白复性　蛋白结构中存在的二硫键越多,就越可能形成更多的不同组合,而其中只有一种结构是正确的天然构象。改变不适宜的氧化还原条件,使之达到平衡,可以帮助蛋白恢复正确的结构。目前最常用的方法是在透析液中加入氧化还原体系,包括氧化/还原谷胱甘肽、氧化/还原二硫苏糖醇(1,4-dithi othreit ol,DTT)、胱胺/半胱胺、2-β-羟乙基二硫化物/β-巯基乙醇等。

3.2.6　分子伴侣辅助蛋白质复性　分子伴侣是一组在胞内活动中起重要作用的多种蛋白和酶的总称。它们在蛋白折叠过程中可识别、捕获错误折叠的蛋白,从而控制折叠过程,包括磷酸二酯酶、脯氨酸异构酶、DnaK和Gr oE。目前,由于分子伴侣具有使用费用高、需要与复性蛋白质分离等缺点,在实际工作中较难应用。

4　复性蛋白质的检测

研究蛋白质的复性,必须建立适当的检测方法,以鉴定复性蛋白质的生化、免疫学、物理性质以及蛋白变性态与天然态的区别,从而对复性方法进行评价和条件优化。目前常用的检测方法:①凝胶电泳。其中最为常用的是还原和非还原的S DS-P AGE,适于鉴定产物的纯度及复性蛋白质的聚集状态。②光谱学方法。主要有紫外光谱、荧光光谱和圆二色谱CD 等,用来研究蛋白质分子复性过程中构象的变化,特别用于鉴定折叠中间体和复性蛋白质的构象。③色谱学方法。利用蛋白质天然态和变性态色谱行为的差异来研究复性并用于复性蛋白质的检测。④黏度与浊度测定。蛋白质折叠状态不同,其溶解性和黏度存在一定差异,可通过测定溶液的浊度(常以600n m 或400nm的光吸收值表示)来反映蛋白质聚集的快慢与程度。⑤免疫学方法。利用酶联免疫、蛋白印迹法可以测定不同状态蛋白质的抗体-抗原结合力的差异,说明其空间构象状态。⑥生物学活性及比活性测定。这是作为对最后的折叠状态评价的一个重要指标,一般是通过采用动物或细胞模型直接测定复性蛋白质所具有的生物学效应来表示。

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