13年《生物化学实验》指导书

《生物化学》实验指导书适用专业：化学工程、制药工程、生物医学工程

生物与食品工程学院生物科学系

生物化学实验细则

为了保证生物化学实验的顺利进行，培养同学们掌握良好、规范的生物化学基本实验技能，特制定以下实验细则，请同学们严格遵守。

1.实验前应提前预习实验指导书并复习相关知识。

2.严格按照生物化学实验分组，分批进入实验室，不得迟到。非本实

验组的同学不准进入实验室。

3.进入实验室必须穿实验服。各位同学进入各自实验小组实验台后，

保持安静，不得大声喧哗和嬉戏，不得无故离开本实验台随便走动。

绝对禁止用实验仪器或药物开玩笑。

4.实验中应保持实验台的整洁，废液倒入废液桶中，用过的滤纸放入

垃圾桶中，禁止直接倒入水槽中或随地乱丢。

5.实验中要注意节约药品与试剂，爱护仪器，使用前应了解使用方法，

使用时要严格遵守操作规程，不得擅自移动实验仪器。否则，因非实验性损坏，由损坏者赔还。

6.使用水、火、电时，要做到人在使用，人走关水、断电、熄火。

7.做完实验要清洗仪器、器皿，并放回原位，擦净桌面。

8.实验后，要及时完成实验报告。

2013年1月

实验1 蛋白质的沉淀、变性反应

（4学时）

目的要求

1. 加深对蛋白质胶体溶液稳定因素的认识。

2. 了解沉淀蛋白质的几种方法及其实用意义。

3. 了解蛋白质变性与沉淀的关系。

原理

在水溶液中，蛋白质分子表面形成水化层和双电层而成为稳定的胶体颗粒，所以蛋白质溶液和其他亲水胶体溶液相类似。但是，蛋白质胶体颗粒的稳定性是有条件的，相对的。在一定的物理化学因素影响下，蛋白质颗粒失去电荷，脱水，甚至变性，则以固态形式从溶液中析出，这个过程称为蛋白质的沉淀反应。这种反应可分为以下两种类型：

1．可逆沉淀反应

在发生沉淀反应时，蛋白质虽已沉淀析出，但它的分子内部、空间结构并未发生显著变化，基本上保持原有的性质，沉淀因素除去后，能再溶于原来的溶剂中。这种作用称为可逆沉淀反应。如大多数蛋白质的盐析作用或在低温下用乙醇（或丙酮）短时间作用于蛋白质以及利用等电点的沉淀，提纯蛋白质时，常利用此类反应。

2．不可逆沉淀反应

在发生沉淀反应时，蛋白质分子内部结构、空间构象遭到破坏，失去原来的天然性质，这时蛋白质已发生变性。这种变性蛋白质的沉淀不能再溶解于原来溶剂中的作用称为不可逆沉淀反应。重金属盐、生物碱试剂，强酸、强碱、加热、震荡、超声波、有机溶剂等都能使蛋白质发生不可逆沉淀反应。

蛋白质变性后，有时由于维持溶液稳定的条件仍然存在（如电荷）并不析出，因此，变性蛋白质不一定都表现为沉淀，而沉淀的蛋白质也未必都已变性。

试剂和器材

一、试剂

1. 蛋白质溶液：10ml/组

取5ml鸡或鸭蛋清，用蒸馏水稀释至100ml，搅拌均匀后用4—8层纱布过滤，新鲜配置。

2. 蛋白质氯化钠溶液：3ml/组

取20ml蛋清，加蒸馏水200ml和饱和氯化钠溶液100ml，充分搅匀后，以纱布滤去不溶物（加入氯化钠的目的是溶解球蛋白）。

3. 其余试剂：

硫酸铵粉末（10克/组），饱和硫酸铵溶液(150ml)，3%硝酸银（280ml），0.5%乙酸铅（200ml），浓硫酸（5ml/组），5%磺基水杨酸（100ml），0.1%硫酸铜（100ml），饱和硫酸铜溶液（400ml），

0.1%乙酸（500ml），10%乙酸（500ml），饱和氯化钠溶液（25ml），10%氢氧化钠溶液（500ml）。

二、器材

试管（15支/组），过滤漏斗（1个），试管架1个/组，玻璃棒1支/组，沸水浴4台，量筒

（总需要20ml×1,200ml×1），烧杯（总需要100ml×2，400×2），试剂瓶（12个/组，附胶头滴管10支/组），移液管（5ml×6/组，1ml×3/组），滤纸1盒，洗瓶1个/组，废液缸1个/组，药匙1个/组，移液管架1个/组

操作方法

一、蛋白质的可逆沉淀反应—蛋白质的盐析作用(分级盐析)

二、蛋白质的不可逆沉淀反应

1. 重金属沉淀蛋白质

2. 酸沉淀蛋白质

1）

2）

思考题

1. 名词解释：水化层；双电层；蛋白质变性；盐溶与盐析；蛋白质等电点沉淀。

2. 将实验结果写在实验报告中操作方法的对应位置上并就实验现象作简要解释。

3. 根据实验现象，讨论下列问题：

1）蛋白质可逆沉淀与不可逆沉淀的本质区别是什么？

2）简述蛋白质的沉淀反应、变性作用和凝固作用的相互关系。

4. 作为杀菌剂，氯化汞是怎样起作用的？

实验2 唾液淀粉酶的性质和活力测定

（8学时）

目的要求

通过唾液淀粉酶性质的测定，了解酶的专一性和多种因素对酶促反应速度的影响，如：底物浓度、酶浓度、温度、pH值、激活剂和抑制剂等。通过对唾液淀粉酶活力的测定，学习酶活力、蛋白质含量的测定方法，及酶活力和比活力的计算方法。

试剂和器材

主要器材：可见光分光光度计、试管、漏斗、移液管、恒温水浴锅、pH试纸等。

主要试剂：可溶性淀粉、葡萄糖、3，5-二硝基水杨酸、酚、NaOH、HCl、乙醇、醋酸、醋酸钠、牛血清白蛋白溶液、考马斯亮蓝G—250等。

要求涉及的实验操作：

1.用考马斯亮蓝法制作蛋白质浓度标准曲线。

2.用3，5-二硝基水杨酸试剂法或Benedict试剂法制作葡萄糖浓度标准曲线。

3.至少测定底物浓度、温度、pH值、激活剂和抑制剂对酶促反应速度的影响。

时间内容安排

1.实验前六周，教师向学生介绍实验目的、实验条件、实验材料，学生查阅文献资料。

2.实验前五周，学生提交具体实验方案和所需仪器、药品清单，实验室负责相关实验药品、

设备的准备工作。

3.实验开出。

4.提交一份实验报告，内容包括：实验的目的、实验的原理、实验试剂和器材、操作方法、

实验结果与分析、讨论和实验情况总结。

参考书目（仅供参考，另外可以查阅期刊杂志）

1.高级生化实验教程，王重庆等编

2.生化实验方法和技巧，张龙翔等编

3.生物化学实验，中国科学技术大学出版社