I型胶原-壳聚糖复合材料生物相容性研究共11页文档

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果胶-壳聚糖复合水凝胶的制备及性能研究开题报告

开题报告题目：果胶-壳聚糖复合水凝胶的制备及性能研究参考文献[1] WU J,WEI W,WANG L Y,et al.A thermosensitive hydrogel based on quaternized chitosan andpoly ( ethylene glycol) for nasal drug delivery system[J].Biomaterials,2007,28(13):232. [2] CHEN L Y,TIAN Z G,DU Y M.Synthesis and pH sensitivity of carboxymet hyl chitosan2based polyampholyte hydrogels for protein carrier matrice s[ J].Biomaterials,2004,25( 17) : 3725-3732.[3] MAJET I N V,RAVI K.A review of chitin and chitosan applications[J].Reactive andFunctional Polymers,2000,46(1):1227.[4] Liu LS,Won YJ,Cooke PH.(2005).Pectin/poly(lactide-co-glycolide) composite matrices forbiomedical applications.Biomaterials,24,3201-3210.[5] 丁小斌,孙宗华,万国祥,等.热敏性高分子包裹的磁性微球的合成.高分子报,1998,5:628.[6] Kwon I C,Bze Y H,Okano T,et al.Dru from electric current sensitive polymers.Rel,1991,17(2):149.[7] 李文俊,王汉夫,卢玉华,等.壳聚糖.聚丙烯酸配合物半互穿聚合物网络膜及其对pH和离子的刺激响应.高分子学报,1997,1:106.[8] 卓仁禧,张先正.温度及pH敏感聚(丙烯酸) /聚( N-异丙基丙烯酰胺)互穿聚合物网络水凝胶的合成及性能研究.高分子学报,1998,1:39.[9] 顾雪蓉,朱育平.凝胶化学.北京:化学工业出版社,2005.1.[10] 邹新禧.超强吸水剂.北京:化学工业出版社,2002.473.[11] 吴季怀,林建明,魏月琳,等.高吸水保水材料.北京:化学工业出版社,2005.1.[12] Wichterle O,Lim D.Hydrophilic gels in biologic use.Nature,1960,185:117.[13] 刘锋,卓仁禧.温度pH敏感水凝胶的合成及其在生物大分子控制释放中的应用[J].高分子材料科学与工程,1998,14(2):54257.[14] COVIELLOA T, GRASSIB M,LAPASIN R,et al.Scleroglucan / borax: Biomaterials, 2003,24(16):278922798.characterization of a novel hydrogel system suitable for drugdelivery[J].[15] LIU Y Y,SHAO Y H,LV J.Preparation,properties and controlled release behaviors of pH:induced thermosensitive amphiphilic gels[J].Biomaterials,2006,27(21) : 4016-4024.[16] NICOLE J E, KELLY R S,WEIYUAN J K.Synthesis and physicochemical analysis of gelati n: based hydrogels for drug carrier matrices [J].Biomaterials,2003,24(3): 509-522.[17] Liu SQ,Tong YW,Yang YY (2005).Incorporation and in vitro release of doxorubicin inthermally sensitive micells made from poly (N-isopropylacrylamide-co-N,N-dimethyl-acrylamide)-b-poly(D,L-lactide-co- glycolide) with varying compositions.Biomaterials,26: 5064-5074.[18] Lee ES,Na K,Bae YH (2003).Polymeric micelle for tumor pH and folate-mediated targeting.JControl Release,91:103-113.[19] Chaterji S,Kwon IK,Park K.(2007).Smart polymeric gels: Redefining the limits of biomedicaldevices.Progress in Polymer Science,32:1083-1122.[20] Lin Shuliu,Marshall L Fishman,Joseph Kost (2003).Pectin-based systerns for colon-specificdrug delivery via oral route.Biomaterials,(24)19: 3333.。

牙周膜细胞与壳聚糖-聚磷酸三钙复合材料生物相容性研究

ｘｎ（ｅｒｅｔｆＰｒｄｎｌｉａｅＳｍｔｌｙＨｓｉｌｉＵｉｒｔ，ａｇｈｎ１０４，ｈａｉ．Ｄｐｔｎｏｅｏｏｔｓｓ，ｔａｏｏｔ，ｎｎｅｉｃｎｃｕ３０１Ｃｉ）ａｍｉａｄｅｏｏｇｐａｖｓｙｈｎＡｓａｔＯｂｃｖＴｕｙｈｆｃｏｉｓ／－ａｉｈｓｈｔ（ｑＰｏｅａａｈｅｔｎｒｉｒｉｈｍｎｂｔｃ：ｊｔｅｏｓｄｅｅｅｔｆｈｏａｎｃｌｕｐｏｐａＣＥ）ｎｔｔｃｍｎａｄｐｏｆａｏｏｕａｒｅｉｔｔｃｔｎｉｃｍｅｈｔｌｔｎｆｅｐｒｄｎｌｉｍｎｃｌ（ＤＣ）ｕｉｔｄｅｐｒｔｉｂｏｏｐｔｉｅ．ｔｏｓＴｅＣ＇ａｐｅａｅｙｆｅ－ｒ— ｅｏｏｔｇｅｔｅｓＰＬｓｃｌａｄａｘｌｅｈｒｉｍａｂｔｓＭｅｄｈＩＰＷＳｒｒｂｅｚｄｙｉａｌａｌｔｅｎｖｏｅｃｉｌｉｉｈＣｐｄｒｅ
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中国实验诊断学
２０Ｏ７年１第１卷０月１
第１０期
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１３一３１
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ＴｍｏａｄｍｚｄｔｄａＪ．ＳｌｉＯｃｌ０３０ｉｅｆｒｒｎｏｉｓｉｅｕｓ［ｅｎｎｏ，２０，３Ｊｎ—
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［］１陈忠平，２周旺宁．我国胶质瘤诊断治疗现状和努力方向［］中国Ｊ．

壳聚糖ppt课件

2019 13
四壳聚糖抑菌性能影响因素、机理及应用
1 壳聚糖的抑菌性能影响因素
（1）分子量对壳聚糖抑菌性能的影响：
壳聚糖分子量对其抑菌性能的影响初步认为与不同分子量壳聚糖的不同作用机理及细菌的不同结构与特性有关。
（2）浓度对壳聚糖抑菌活性的影响：
水溶性壳聚糖的抗菌活性随其浓度的增加而增加，且它的抗真菌活性强于抗细菌活性。
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3 水溶性甲壳素的热性质
水溶性甲壳素的玻璃化转变温度( Tg)是 219．6℃。而脱乙酰度为95．8l％的壳聚糖的玻璃化温度是202.6℃。水溶性甲壳素的玻璃化转变温度高于壳聚糖，主要是因为水溶性甲壳素含有较多的乙酰基，分子间的作用较壳聚糖强，分子运动更困难。从水溶性甲壳素和壳聚糖的热失重结果分析，二者在60℃附近开始脱水，水溶性壳聚糖脱去总重的4.61％，而壳聚糖脱去了3.69％，说明水溶性甲壳素的亲水性更好，在环境条件下样品含水量高，与水的作用更强。
（3）壳聚糖在农业中的应用
可做种子处理剂、生物农药
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（4）壳聚糖在医疗卫生中的应用
壳聚糖可用于伤口填料物质，具有杀菌、促进伤口愈合、吸收伤口渗出物、不易脱水收缩，减少疤痕的生成等作用。
（5）壳聚糖在环保中的应用
利用壳聚糖的抗菌性，可将壳聚糖用于生化水处理方面。
（6）壳聚糖在化妆品中的应用
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6 金福生-壳聚糖抗菌成膜喷雾剂
简介：今福生是一种喷雾型分子级隐形敷料，喷洒在皮
肤、黏膜患处及损伤表面，通过全新的物理及生物双重抗菌机制，隔离、杀灭病原微生物，同时促进组织修复与再生。作用机理：物理及生物双重抗菌机理。使用范围：普通外科、皮肤科、妇产科、烧伤科、整形美容外科、肛肠科、褥疮的预防与治疗、预防医院内感染等。

浅谈纳米纤维素制备及壳聚糖-NCC复合膜的性能研究

浅谈纳米纤维素制备及壳聚糖/NCC复合膜的性能研究本文从网络收集而来，上传到平台为了帮到更多的人，如果您需要使用本文档，请点击下载按钮下载本文档（有偿下载），另外祝您生活愉快，工作顺利，万事如意！随着经济的不断发展，资源短缺逐渐显露，人们开始关注环境问题，环保、绿色成为人们关注的焦点。

无论是在生活的哪个方面，环保变得越来越重要。

在包装方面也是如此。

研究人员探索研制更为环保、绿色的包装材料，以满足社会和环境的需要。

所以，人们将目光转移到了天然可再生的高分子材料上，掀起了天然可再生的高分子材料研究与应用的狂潮。

在众多天然且可再生的高分子材料当中脱颖而出的当属纤维素和壳聚糖。

纳米纤维素是一种直径为1～100nm，长度为几十到几百纳米的刚性纤维素。

现代研究已表明，纳米纤维素具有许多优良性能，如比表面积较大、结晶度高、亲水性好、模量高、强度高、结构超精细和透明性好等，这些优异的性能使其在食品、医药、造纸、纺织及新材料制备等方面具有很好的应用前景。

纳米纤维素是天然生物材料，也是环境友好型的可再生资源，用纳米复合包装材料代替人工合成的包装材料具有广阔的应用前景。

加之壳聚糖具有可降解性和食品包装安全性，将它和纳米纤维素复合，可以极大地提高两种材料在包装方面的综合性能。

壳聚糖已在包装领域有所应用，而纳米纤维素在包装领域应用的研究还处于起步阶段。

本研究将以废弃瓦楞纸板作为来源进行纳米纤维素的制备及与壳聚糖共成膜的性能进行研究，以期扩大可利用的资源及废弃物的高效回收利用。

1试验部分材料瓦楞纸板来自废弃包装纸箱，为B型瓦楞;杨木浆板，厚2mm;浓硫酸(化学纯，含量≥%～%)，北京化工厂;去离子水，生化专用。

壳聚糖(脱乙酰度%～%，～，黏度50～800mPa·s)，国药集团化学试剂有限公司;冰醋酸(分析纯)，北京化工厂;丙三醇(分析纯)，北京化工厂。

制备方法纳米纤维素的制备将瓦楞纸板及杨木浆板与质量分数为60%硫酸按质量比为1∶25，放入三口瓶中在40℃下水解4h。

壳聚糖微球的制备及研究开题报告

壳聚糖微球的制备及研究-开题报告壳聚糖微球的制备及研究摘要：壳聚糖是性能优良的天然黏膜黏着剂，常用于多肽类药物的黏膜给药。

壳聚糖微球除具有壳聚糖本身特点外，在性能上又有新的改善，利用壳聚糖制成的微球可以延长药物在吸收位置的保留时间，达到控释目的。

实验以戊二醛，多聚磷酸钠为交联剂制备微球，通过单因素法考察微球制备工艺。

关键词：微球，壳聚糖，戊二醛，多聚磷酸钠1 研究背景1.1 微球微球是近年来发展的新剂型，它是以清蛋白、明胶、聚乳酸等材料制成的球状载体给药系统，微球中的药物分散或包埋在材料中而形成球状实体，微球直径大小一般为0.3~100μm。

不同粒径范围的微球针对性地作用于不同的靶组织。

这类剂型的开发，对于发展缓控释和靶向给药系统具有重要的意义。

微球的特点药物制备成微球后可达到下述目的：掩盖药物不良气味及口味，如鱼肝油、生物碱类等；提高药物的稳定性，如易氧化的β-胡萝卜素、对水气敏感的阿司匹林等；使液态药物固体化便于应用与储存，如油类、香料、脂溶性维生素等；对缓释或控释药物，可采用惰性基质、薄膜、可生物降解材料、亲水性凝胶等制成微球或微囊，可使药物控释或缓释；使药物浓集于靶区，如治疗指数低的药物或细胞毒素药物（抗癌药）制成微球或微囊的靶向制剂，可将药物浓集于肝或肺等靶区，提高疗效，降低毒副作用；除药物外，可将活细胞或生物活性物质包囊，如胰岛、血红蛋白等包囊，在体内生物活性高，而具有很好的生物相容性和稳定性[1]。

各种微球的制备研究.1 清蛋白微球清蛋白微球制剂是人或动物血清清蛋白与药物一起制成的一种球状制剂。

清蛋白是体内的生物降解物质，注入肌体后，在肌体的作用下逐渐降解后清除，性能稳定、无毒、无抗原性，因此清蛋白微球制剂是理想的控缓释靶向制剂之一。

其制备方法有：热变性法；化学交联法（即用化学交联剂同清蛋白发生交联反应使之变性）；聚合物分散法和界面缩聚法等。

.2 聚乳酸、聚乳酸乙醇酸微球聚乳酸(PLA)是一种无毒可生物降解的聚合物，具有很好的生物相容性。

低分子量壳聚糖

低分子量壳聚糖低分子量壳聚糖（Low Molecular Weight Chitosan, LMWC）是一种重要的功能性生物材料，具有广泛的应用前景。

本文将介绍低分子量壳聚糖的特性、制备方法、生物活性及其应用领域的研究进展。

一、低分子量壳聚糖的特性低分子量壳聚糖是由壳聚糖经酶或化学方法降解而得到的，其相对分子质量较小，一般在1-10 kDa范围内。

相对于普通的壳聚糖，低分子量壳聚糖具有以下独特的特性：1. 溶解度好：由于分子量较小，低分子量壳聚糖在水中的溶解度较高，易于制备各种溶液和制剂。

2. 生物相容性优异：低分子量壳聚糖是从天然壳聚糖中提取得到的，具有良好的生物相容性和生物可降解性。

3. 生物活性显著：研究表明，低分子量壳聚糖具有抗菌、抗病毒、抗氧化、抗肿瘤和促进伤口愈合等多种生物活性。

4. 调节免疫功能：低分子量壳聚糖可以增强机体的免疫功能，调节免疫细胞的活性和细胞因子的产生。

二、低分子量壳聚糖的制备方法目前，低分子量壳聚糖制备方法主要包括酶解法、酸解法、还原法和辐照法等。

1. 酶解法：通过壳聚糖酶的作用，将壳聚糖降解成低分子量的产物。

2. 酸解法：利用酸（如盐酸、硫酸等）将壳聚糖进行酸解，得到低分子量壳聚糖。

3. 还原法：壳聚糖经过还原处理，将壳聚糖的N-乙酰胺基团还原为氨基基团，从而使壳聚糖的分子量降低。

4. 辐照法：利用电子束辐照或γ射线辐照壳聚糖，使其分子量降低。

三、低分子量壳聚糖的生物活性1. 抗菌活性：低分子量壳聚糖具有较好的抗菌活性，可以通过破坏细菌膜结构、抑制细菌的生物膜形成和干扰细菌DNA复制等机制发挥抗菌作用。

2. 抗氧化活性：低分子量壳聚糖可以清除自由基、抑制氧化反应、调节抗氧化酶活性等，具有较好的抗氧化活性。

3. 抗肿瘤活性：研究显示，低分子量壳聚糖可以诱导肿瘤细胞凋亡、抑制肿瘤细胞的增殖和侵袭，并调节肿瘤相关信号通路，具有良好的抗肿瘤活性。

4. 促进伤口愈合：低分子量壳聚糖可以促进伤口愈合过程中的纤维母细胞增殖、胶原合成、血管新生和上皮细胞迁移等，加速伤口愈合。

（高分子化学与物理专业论文）0酰化壳聚糖聚乳酸共混膜的氢键、相容性及细..

摘要摘要壳聚糖和聚乳酸（PLLA）是两类性能优良的生物材料，在生物医药领域均显示其优越性。

利用组分间氢键相互作用，制备出结合两者优良性能的“共混型”组织工程支架材料具有重要的意义。

本文采用甲烷磺酸保护，壳聚糖与酰氯反应合成了不同分子量和不同酰基侧链长度的O-酰化壳聚糖衍生物（OCS），用红外光谱及核磁共振谱证明产物为目标产物。

以氯仿为共溶剂，通过流延成膜法制备OCS/ PLLA共混膜，重点研究酰基侧链长度及壳聚糖分子量对共混膜组分间氢键、相容性及细胞亲和性的影响，为其在组织工程支架材料的应用提供理论基础。

合成了三种不同酰基侧链长度的O-酰化壳聚糖（O-辛酰基壳聚糖、O-十二酰基壳聚糖和O-棕榈酰基壳聚糖）（分子量均为3.0×103Da）和三种不同壳聚糖分子量的O-十二酰基壳聚糖（分子量分别为3.0×103Da、1.0×104Da和5.0×105Da）。

O-酰基化改性破坏了壳聚糖的氢键结构，提高了壳聚糖的脂溶性，OCS产物能溶解在氯仿中，为采用氯仿为共溶剂，通过溶液共混法制备OCS/PLLA共混膜提供方便。

采用FTIR、TG/DSC、WAXD和SEM等方法，研究了共混膜中的氢键作用情况。

结果表明，OCS/PLLA共混膜组分间存在较强的氢键相互作用；氢键作用主要发生在O-酰化壳聚糖的氨基和聚乳酸的羰基之间；组分间的氢键作用受到壳聚糖分子量和酰基侧链长度的影响，壳聚糖分子量越小，与聚乳酸分子间的氢键相互作用越强；酰基侧链越短，O-酰化壳聚糖与聚乳酸之间的氢键作用越强，共混膜中两组分的相容性越好。

SEM观察结果表明，酰基侧链较短的3k-OOCS/PLLA和3k-LOCS/PLLA共混膜具有较好的相容性，而侧链较长的3k-POCS/PLLA共混膜存在一定的相分离结构。

生物学研究结果表明： O-酰化壳聚糖/聚乳酸共混膜生物相容性良好，具有无毒、对动物组织无排斥性及生物可降解等特点；O-酰化壳聚糖有利于提高聚乳酸的细胞亲和性。

胶原-壳聚糖二元膜材料的制备与性能表征

复合改性得到的二元膜孔径２￣２０ｍ，孔率９％左００ｇ５右，机械强度和耐酶稳定性较高，吸水率高且在水中不
溶胀。ＤＴＥＨ－ＤＣ复合改性是较为理想的胶原基膜材料作为生物医用材料的改性方法。关键词：胶原：壳聚糖；复合膜材料；性能表征中图分类号：Ｔ２Ｂ３４文献标识码：Ａ
２３１胶原一聚糖二元膜的制备．．壳根据本研究室前期的研究成果【，原与壳聚糖的】胶ｍ
比例为１：１时具有较为明显的分子间作用力，是较为合适的共混比例。因此本试验根据此比例制备胶原一壳聚糖二元复合膜材料。确称取适量自制胶原海绵与壳准
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
及壳聚糖为主要原料制备大孔径高孔率二元膜材料，通过单一或复合改性以后比较二元膜材料的各项性能。适
当的ＤＴ改性后获得的二元膜孔径为２～１０ｍ，孔Ｈ００ｇ率９％左右，膜材料机械性能较差，０但抗酶解能力提高
２材料与方法
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叶易春等：胶原一壳聚糖二元膜材料的制备与性能表征
胶原一壳聚糖二元膜材料的制备与性能表征木
叶易春一，，林海２，曾睿。，但年华一，，米贞健２，王康建２，９２华４－，
２１材．料
不明显；．％的戊二醛．ＤＣ复合改性交联程度较为合０２０Ｅ适，ｆＤ｝ｒ改性可以一定程度减少戊二醛用量；Ｈ —ＤＣＤＴＥ

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第 1 页 I型胶原-壳聚糖复合材料的生物相容性研究1 张永强1 任志鹏1 杨自权1 孙晓丹2 卫小春1 1山西医科大学第二医院骨科骨与软组织损伤修复山西省重点实验室 030001

2清华大学材料工程学院

【摘要】目的评价I型胶原-壳聚糖复合材料作为组织工程支

架材料的生物相容性。方法体外培养兔骨髓间充质干细胞（BMSCs），采用四甲基偶氮唑盐（MTT）比色法检测不同分组的BMSCs生长情况，酶标仪测吸光度值（OD），计算细胞相对增值率（RGR％）；利用材料浸提液与兔新鲜血混合观察红细胞溶解情况，评价材料细胞生物相容性。结果空白组（A组），50％浓度组（B组）和100％浓度组（C组）BMSCs均生长良好，并于1、3、5天逐渐增殖，阳性对照组（D组）细胞于第１天开始变圆、皱缩，3天和5天均皱缩死亡。A、B、C三组细胞在第1、3、5天各组吸光度值无显著差异（P>0.05），但均与Ｄ组有明显统计学差异（P<0.05）。材料相对溶血率为4.1％。结论 I型胶原-壳聚糖复合材料无明显细胞毒性，有良好的生物相容性。【关键词】胶原-壳聚糖材料；细胞毒性试验；溶血试验 Biocompatibility researches of type I collagen - chitosan scaffold Zhang yongqiang1, Ren zhipeng1, Yang ziquan1 et al.1 Department of Orthopedics,the second hospital of Shanxi Medical University, bone and soft tissue healing Key Laboratory of Shanxi Province;

1 基金项目：国家自然基金项目(30973048)；科技部国际合作重点项目（2008GR0403）；国家人力资源

与社会保障部2009年度留学回国人员科技活动择优资助项目作者简介：张永强（1985-），男，在读硕士研究生，研究方向为关节软骨的损伤与修复  通讯作者：杨自权（1972-），男，副主任医师，硕士研究生导师，e-mail: yzqonline@126.com 卫小春（1951-），男，主任医师，博士研究生导师，硕士研究生导师,e-mail:weixiaochun06@yahoo.com.cn 第 2 页

2 Tsinghua University, Institute of Materials Engineering [Abstract] Objective To evaluate the biocompatibility of the type I collagen - chitosan scaffold for tissue engineering. Methods Cultured bone marrow mesenchymal stem cells (BMSCs)in 4 different groups(A,B,C and D).Used tetrazolium salt (MTT) colorimetric to assay the growth of different groups,and measure the optical density (OD)by microplate reader, then calculate the relative growth rate (RGR%).Mixed the scafford extracts with fresh blood of the rabbit,the grade of hemolysis was made in the measures of optical density at 492nm. Results BMSCs of group A, group B and group C were growing well, and proliferating gradually in the 1st,3rd and 5th day. The positive control group (D) cells rounded and wrinkled in the 1st day, then, cells were shrinkage death. The optical density were no significant statistical differences between group A,B and C (P> 0.05), but all had significant statistical differences with group D (P <0.05).Hemolysis percentage of the scafford was 4.1%. Conclusion I collagen - chitosan scafford has no significant cytotoxicity, and accords with the biomaterial standards of tissue engineering. [Key words] I collagen-chitosan scafford; Test of hemolysis；Test for cytotoxicity

壳聚糖是一种天然高分子生物材料，为线性多糖，是氨基多

糖(GAG)的异构物。在自然界中广泛存在,是一种来源广泛、容易获得并具有良好生物相容性的可降解生物材料。I型胶原是很多组织的细胞外基质成分，并已应用于很多组织工程的支架材料中，但由于单独应用具有降解速率快、物理性能差等不足，因此常常与其他材料复合，以避免一些不足。本实验研究的I型胶原-壳聚糖复合材料是一种将I型胶原和壳聚糖有机结合的新型组织工程复合载体支架材料。细胞毒性实验是一类在离体状态下模拟生物体生长环境，检测材料和器械接触机体组织后生物学反应的体外试验，它是对材料进行生物学评价的重要检测指标之一。本实验通过四甲基偶氮唑盐（MTT）比色法检测材料浸提液对骨髓间充质干细胞（BMSCs）第 3 页

生长的影响，同时进行材料浸提液的溶血试验检测，评价新型载体材料——I型胶原-壳聚糖复合材料作为组织工程支架材料的生物相容性。材料与方法 1 主要试验材料、试剂和仪器 I型胶原-壳聚糖复合材料（清华大学提供）；2月龄新西兰大白兔（山西畜牧研究所）；胰酶（Sigma公司）；DMEM-F12（赛默飞世尔生物化学有限公司）；胎牛血清（杭州四季青）；四甲基偶氮唑盐（Sigma公司）；苯酚（天津市福晨化学试剂厂）；BB5060型CO2培养箱（Heraeus公司）；MK3型酶标仪（热电上海仪器有限公司）。 2 细胞毒性试验 2.1 BMSCs的培养取2月龄新西兰大白兔，称重为3kg。耳缘静脉注射3%戊巴比妥钠（1ml/kg体重）约3ml麻妥，无菌条件下于双侧股骨大转子处穿刺，分别自两侧骨髓腔中抽取骨髓至含有2ml肝素（3000U/ml）注射器内，置于离心管中冲洗离心后，各加含10%胎牛血清DMEM-F12培养基5ml，分装于2个25cm2培养瓶内，置入37℃，5%CO2饱和湿度的培养箱中培养。3d后首次换液，以后每2-3d换液一次。待细胞长满瓶底达80-90%（图１），进行传代，传至三代（图2）备用。 2.2 浸提液的制备[1]（ISO10993-5）根据《GB/ T 16886. 522019/ISO 10993-5 :2019 医疗器械生物第 4 页

学评价第5 部分:体外细胞毒性试验》中的浸提液试验，将材料按1cm²试样表面积加10ml浸提介质比例在37℃恒温箱中浸提24h。浸提介质为含10%小牛血清的DMEM-F12培养液。 2.3 实验分组及检测空白组(A组)：含10%小牛血清的DMEM-F12培养液 50%浓度组（B组）：材料浸提液浓度为50% 100%浓度组（C组）：材料浸提液浓度为100% 阳性对照组（D组）：0.64%苯酚取第三代BMSCs，配制成1×105/ml细胞悬液，取3块96孔培养板，每板4组，每组10孔，每孔加100ul细胞悬液，置于条件同前的培养箱中培养。24小时后，弃去原培养液，用PBS液洗涤2次后，分别按实验分组进行换液，再把培养板放入原培养箱内继续培养，分别于1、3、5天各取出一块培养板，在倒置相差显微镜下观察活细胞形态、摄影，然后加入20ul孔MTT液，继续培养6小时，吸除原液，再加入150ul孔二甲基亚砜（DMSO），震荡10分钟，在酶联免疫检测仪上以450nm波长测吸收值。按下式计算细胞相对增殖率(RGR)： RGR=（实验组吸光值/空白对照组吸光值）×100% 对所得RGR按美国药典细胞毒性分级标准对其进行毒性分级。美国药典[2]（USP XXII 24版）中细胞相对增殖率与细胞毒性的分级的关系(下表) The relationship between cell proliferation rate 第 5 页

and cytotoxicity grade of USP 细胞相对增殖率(％) 细胞毒性分级 ≥ 100 0 ≥80 1 ≥50 2 ≥30 3 ≥0 4 3 溶血试验 3.1 采集新西兰大白兔血 4mL与 2 mL肝素（3000U/ml）混合备用。 3.2 实验分组及检测试验分组：生理盐水组(阴性对照)、实验组（材料100%浸提液）和蒸馏水组(阳性对照组)。每组10个样本，每个样本5 mL。取抗凝新鲜血液0.1 mL分别加入3组样品中，37℃培养箱孵育60min。观察大体样本溶血情况。低速离心机3000r／min 10min，酶标仪492nm下对样品进行OD值检测。溶血率=(Dt-Dnc)／( Dpc-Dnc)×100％按上述公式计算溶血率 (Dt：待测OD值；Dpc：阳性对照OD值；Dnc：阴性对照OD值)。 4 统计分析对MTT法及溶血试验测得各组吸光度值采用均数标准差表