核糖体开关的研究进展
某理工大学《微生物学教程》考试试卷(1929)
某理工大学《微生物学教程》课程试卷（含答案）__________学年第___学期考试类型：（闭卷）考试考试时间：90 分钟年级专业_____________学号_____________ 姓名_____________1、判断题（230分，每题5分）1. 1676年，荷兰的列文虎克最先用自制的复式显微镜看到了细菌等微生物。
（）答案：错误解析：荷兰的列文虎克最先用自制的单式显微镜看到了细菌等微生物。
2. 与人和动物的病原微生物相似，在植物病原微生物中，最常见的也是病毒，其次是细菌，最少的是真菌。
（）答案：错误解析：物病原微生物以真菌和病毒居多，细菌相对较少。
3. 现代免疫概念认为免疫就是指机体免除传染性疾病的能力。
（）答案：错误解析：现代免疫概念认为免疫是机体识别和排除抗原性异物的一种保护性机制，在异常条件下也可损害机体。
4. 在做艾姆斯试验时，有少数可疑“三致”试样还应事先用存在加氧酶活性的鼠肝匀浆处理一下。
（）答案：正确解析：5. 核糖开关（Riboswitch）主要是细菌调控核糖体蛋白表达的一种方式。
[南开大学2014研]答案：错误解析：核糖开关是指mRNA一些非编码区的序列折叠成一定的构象，这些构象的改变应答于体内的一些代谢分子，从而通过这些构象的改变达到调节mRNA转录的目的。
6. 好氧性芽孢杆菌的菌体形态呈梭状，厌氧性芽孢杆菌的菌体形态呈杆状。
（）答案：错误解析：芽孢杆菌属为好氧性芽孢杆菌，其菌体为杆状；梭菌属是厌氧性芽孢杆菌，其菌体呈梭状。
7. 卵孢子的数量决定于与藏卵器交配的雄器中细胞核的数量。
（）答案：错误解析：卵孢子的数量取决于卵球的数量。
8. 真核微生物的“9＋2”型鞭毛，指的是其鞭杆和基体的横切面都显示出外围有9个微管二联体，中央为2条中央微管。
（）答案：错误解析：真核微生物的“9＋2”型鞭毛，其鞭杆的横切面都显示出外围有9个微管二联体，中央为2条中央微管；而基体的结构与鞭杆接近，但在电镜下其横切面却呈“9＋0”型，且其外围是9个三联体，中间则没有微管和鞘。
生物化学反应研究的新进展
生物化学反应研究的新进展生物化学反应是指在生物体内发生的一系列化学反应，在维持生命活动中发挥了重要的作用。
生物化学反应研究的新进展为生命科学研究提供了重要的基础，本文将介绍几种最新的生物化学反应研究进展。
1. DNA修复细胞自噬DNA修复是指细胞在受到DNA损伤后通过一系列修复机制来修复受损的DNA序列，从而保持基因的完整性和稳定性。
DNA 修复细胞自噬是一种新的DNA修复机制，其主要作用是将受损的细胞器和蛋白质通过自噬降解，从而保护细胞的DNA不受进一步的损伤。
研究表明，DNA修复细胞自噬在人体免疫系统中发挥了重要作用，对于预防某些遗传性疾病的发生有一定的帮助。
2. RNA转运蛋白的拓扑构象RNA转运蛋白是一种负责将RNA从细胞核转移到细胞质的蛋白质，其结构和生物学功能一直备受生物化学家的关注。
最新的研究表明，RNA转运蛋白的拓扑构象可以显著影响RNA的转运速度和准确性。
研究人员利用X射线晶体学和电子显微镜技术揭示了RNA转运蛋白在细胞质中的拓扑结构，为进一步探究其作用机制奠定了基础。
3. 蛋白质自组装蛋白质自组装是指蛋白质在特定的条件下自行形成各种形态的超分子结构，如微晶体、纳米颗粒等。
这种自组装方式不仅能够在生物体内形成具有特殊功能的大分子结构，而且还可以作为一种新的药物载体。
最新的研究表明，利用蛋白质自组装的方法可以实现对药物精准的靶向输送，从而大大提高药物的疗效。
4. RNA辅因子的结构和功能RNA辅因子是RNA在翻译过程中所需要的一类蛋白质辅助因子，它们能够在翻译过程中促进mRNA与核糖体的结合。
最新的研究表明，RNA辅因子的结构和功能非常复杂，其功能不仅包括与mRNA的结合，还包括对核糖体的调节等。
研究人员利用单粒子冷冻电镜技术获得了RNA辅因子的三维结构，为研究其作用机制提供了重要的基础。
总之，近年来生物化学反应研究的新进展为我们深入了解生命活动的本质和机制提供了重要的支持和帮助。
NPM异常表达对肿瘤细胞周期调控作用的研究进展
NPM异常表达对肿瘤细胞周期调控作用的研究进展徐骏.，曹恩.，矢庆明b,王嘉。
，尹碧洋。
，况晓东.(南昌大学a.病理教研室；b.第二附属医院骨科；c.玛丽女王学院2018级，南昌330006)摘要：细胞周期为母细胞分裂为2个子细胞并且遗传物质均等分配的一个过程.核仁磷酸蛋白(NPM)是一类穿梭于核仁、核质和胞质的多功能蛋白质，与细胞周期密切相关，可通过多种信号通路调节细胞增殖和凋亡，在肿瘤的发生发展中起着重要作用.文章主要阐述NPM异常表达，包括基因突变、过表达和沉默表达等3种形式对细胞增殖或凋亡的影响，以及对肿瘤发生发展的作用.关键词：核仁磷酸蛋白；突变；移位；过表达；沉默表达；增殖；凋亡中图分类号：R392文献标志码：A文章编号：10098194(2021)02—0079—04DOI：10.13764/ki.lcsy.2021.02.024Research Progress on the Regulation of Tumor Cell Cycleby Abnormal Expression of NPMXU Jun a,CAO En a,SHI Qing-ming b,WANG Jia c,YIN Bi-yang c,KUANG Xiao-dong a(.Department of Pathology； b.Department of Orthopaedics,the Second Affiliated Hospital；c.Class of2018Queen Mary College Nanchang University^Nanchang330006,China)ABSTRACT：Thece l cycleisaprocessin whichthe motherce l dividesintotwodaughterce l s and the genetic material is evenly distributed.Nucleolar phosphoprotein(NPM)is a kind of multi-functionalproteinshu t lingbetweennucleolus nucleoplasmandcytoplasm,whichiscloselyrelat-ed to cell cycle.It can regulate cell proliferation and apoptosis through a variety of signal pathways,and plays an important role in the occurrence and development of tumor.This article mainly describesthee f ectsofabnormalexpressionofNPM，includinggenemutation，overexpressionand silent expression,on cell proliferation or apoptosis,s well as on tumorigenesis and development. KEY WORDS：nucleolarphosphoprotein；mutation；shift；overexpression；silentexpression；multiplication；apoptosis所有真核生物的核糖体RNA(rRNA)在细胞核中合成，核糖体是细胞合成所需的蛋白质合成的分子机器.核仁磷酸蛋白(NPM)是一种重要的核蛋白，与细胞周期密切相关.NPM在调节细胞周期和凋亡中起着重要作用，主要涉及2个方面：其一，NPM直接影响细胞周期，参与核糖体合成，中心体复制和周期控制蛋白的调节⑴，其二,NPM还可以调节促肿瘤或抑制作用，抑制蛋白的活性并影响其靶基因的下游转录，从而调节细胞的增殖和凋亡[2].本文就NPM异常表达对肿瘤细胞周期调控作用的研究进展进行综述.1细胞周期特征细胞的生长和增殖在整个生命周期中都受到仔收稿日期:2021-01-08基金项目：国家自然科学基金(81960012)作者简介：徐骏(1990—),男，硕士研究生，主要从事病理学的研究.通信作者:况晓东，副教授,************************.细和严格的调控，G1/S测试点是最重要的调控开关之一.在这一转折点上，细胞对不同的胞内和胞外刺激因素做出各种不同反应，即细胞分裂、细胞分化或生长停止、G1期停止等.同时在此期间，中心体结合的NPM被cyclin E和CDK2异二聚体复合物磷酸化，启动中心体复制⑶.因此，在G1/S这个测试点，任何可能的损伤或者突变，如抑癌基因失活或癌基因激活，都可能导致异常的细胞增殖或转化.有研究⑷表明,NPM蛋白敲除会导致中心粒数制NPM蛋白磷酸化会导致中心体复制失败.2NPM的结构与功能NPM,也称为B23或N038,位于5q35,包括3个亚型，即NPM1、NPM2和NPM3,目前学术界对NPM1了解最为详细.NPM蛋白的N端富含非极性氨基酸，具有组蛋白伴侣的功能，中间部分是核糖核酸酶活性区，负责组蛋白和核糖体的组装，可以依赖乙酰化增加组装水平.C端是含有核定位信号的核酸结合域.野生型NPM可通过核孔在细胞核和细胞质之间穿梭，参与细胞核和细胞质之间的运输.穿梭过程受核输出信号、核定位信号和核仁定位信号序列控制.NPM可以被一些激酶磷酸化，如酪蛋白激酶n（CKH）.NPM和CKH共同位于细胞核中，调节细胞生长和凋亡［］.3NPM异常表达对肿瘤细胞增殖及凋亡的影响NPM异常表达，包括基因突变、过表达和沉默表达3种形式，对肿瘤细胞的增殖或凋亡产生影响. 33NPM突变对肿瘤细胞增殖的影响有研究［616］表明,NPM突变对许多恶性肿瘤,特别是对血液肿瘤发生发展尤为密切.3.1.1NPM突变与急性髓细胞白血病（AML）FALINI等归首次发现成人AML中NPM1基因突变的检出率为35.2%,正常核型AML中为61.7%,这揭示了NPM基因与血液肿瘤的相关性.近年来,AML中NPM1的异常表达引起了人们的关注和研究.AML中的NPM1突变可发生在FAB-AML的几乎所有亚型中，最常见的突变是M4（发病率77%）、M5a（发病率71%）和M5b（发病率90%）［7］.目前，最常见的突变类型B和D是在相同的基因位点插入CATG和CCTG,而突变类型A 是在野生型NPM1核苷酸序列的956959位插入1个TCTG［］.NPMI基因第12外显子突变在原发性AML尤其是正常核型AML患者中发生率较高，具有特殊的临床特征和较好的预后归.3.1.3NPM突变导致NPM突变基因胞浆异常定位基因突变致NPM胞浆移位的白血病细胞称之为NPMc+细胞.NAKAGAWA等［10］提出，C端色氨酸只在野生型NPM的核仁定位中起主要作用，但是在野生型NPM的细胞质移位中并无显著性作用.当NPM1发生突变后，11-氨基酸残基取代NPM1蛋白C端7-氨基酸,NPM1蛋白末端5个氨基酸均为VSLRK，导致NPM1蛋白C端288和290位点至少1个色氨酸发生突变，削弱了核定位信号，最终导致NPM1在细胞质中的异常定位.此外有研究［11］还发现，突变NPM1的C端产生额外的富含亮氨酸的核输出信号序列，这增强了依赖于CRM1的核输出信号.细胞核定位信号减弱，输出信号增强，最终导致NPM1蛋白在细胞质中的异常定位.FALINI等［幻通过基因转染技术进一步证实突变NPM移位胞浆是通过CRM1依赖途径，此外通过NES序列敲除实验证明突变NPM只有在同时具有2种NES序列的情况下才能实现其胞浆的聚集.NPMc+的异常表达是多种因素共同作用的结果.3.1.3NPM突变（NPMc+）导致血液肿瘤增殖的可能机制白血病细胞的恶性增殖可以通过p53依赖或p53非依赖途径来促进.一方面，依赖P53途径，通过影响p53的稳定性导致肿瘤细胞异常增殖.P53是一种肿瘤抑制基因，由于其突变常导致肿瘤发生。
2025年上海中学高三第一次质检生物试题试卷含解析
2025年上海中学高三第一次质检生物试题试卷考生请注意：1．答题前请将考场、试室号、座位号、考生号、姓名写在试卷密封线内，不得在试卷上作任何标记。
2．第一部分选择题每小题选出答案后，需将答案写在试卷指定的括号内，第二部分非选择题答案写在试卷题目指定的位置上。
3．考生必须保证答题卡的整洁。
考试结束后，请将本试卷和答题卡一并交回。
一、选择题：（共6小题，每小题6分，共36分。
每小题只有一个选项符合题目要求）1．下列有关细胞结构的叙述，错误的是（）A．溶酶体的存在，可避免水解酶破坏整个细胞B．将离体的溶酶体和液泡放于蒸馏水中均会发生破裂C．高尔基体是真核细胞中的物质转运系统，承担着物质运输的任务D．将叶绿体中所有磷脂分子铺展成单分子层，其面积约是叶绿体表面积的4 倍2．发热是生物体应对感染和损伤的防御机制，可以有效地激活免疫系统来清除病原体，从而维持机体稳态。
研究表明当机体高热（38.5℃及以上）达到6小时，就可以有效诱导热休克蛋白90（Hsp90）表达并发挥作用，从而促进T细胞迁移到淋巴结和炎症部位。
一旦Hsp90被成功诱导，即便体温回归正常水平，Hsp90的表达也可以维持大约48小时。
下列相关叙述错误的是（）A．在发热持续维持38.5℃时期，人体的产热量大于散热量B．T细胞接受抗原刺激后可以增殖分化成效应T细胞和记忆细胞C．高热初期不适合立即使用退烧药，而高热6小时后再使用退烧药降温，对免疫细胞迁移的影响不大D．免疫细胞的迁移运动是机体发挥免疫防卫的关键环节，对机体维持内环境的稳态发挥重要作用3．某人利用基因工程改变①～⑤功能性区域的酶甲基因，剔除部分区域后，获得酶乙～丁。
取等量的酶甲～丁进行酶活性分析，结果如图，下列分析正确的是（）A．直接导致酶乙、丙、丁活性差异的原因是酶甲基因的区域差异B．提供酶丙更高浓度的底物。
其活性会持续升高C．若横坐标改为不同的温度，则甲曲线的变化趋势不变D．若获得具有①②③⑤结构的酶戊，则其酶活性变化可用丁曲线表示4．某实验小组为了探究细胞膜的通透性，将小鼠肝细胞在体外培养一段时间后，检测培养液中的氨基酸、葡萄糖和尿素含量（在原培养液中没有尿素），发现它们的含量发生了明显的变化（如图），以下分析合理的是（）A．随培养时间延长，培养液中尿素含量升高，推测其是细胞代谢的产物B．随培养时间延长，培养液中葡萄糖和氨基酸含量降低，这肯定是协助扩散的结果C．培养液中的氨基酸一定是协助扩散进入细胞，其主要作用是合成蛋白质D．转氨酶是肝细胞内参与蛋白质代谢的一类酶，正常情况下这类酶不会排出胞外，若在细胞培养液中检测到该类酶，则一定是胞吐作用排出的5．细胞膜上协助离子跨膜运输的方式有：通过离子通道运输的被动运输和通过离子泵运输的主动运输等，下列叙述不．正确．．的是（）A．神经元处于静息状态时，钾离子通过离子通道外流B．缺氧会影响神经元兴奋是因为钠离子通过离子泵内流C．离子通过离子泵的跨膜运输是逆浓度梯度进行的D．葡萄糖进入红细胞的方式与离子泵运输离子的方式不相同6．细颗粒物（PM2.5）可影响免疫系统功能，下表相关推论错误的是对长期吸入高浓度PM2.5的研究选项推论结果影响非特异性免A损害呼吸道黏膜疫B改变T细胞数目影响特异性免疫C刺激B细胞增殖分化影响细胞免疫D导致抗体水平升高影响体液免疫A．A B．B C．C D．D二、综合题：本大题共4小题7．（9分）轮状病毒是引起婴幼儿腹泻的主要病原体之一，感染症状还伴随发烧、呕吐等。
RNA结合蛋白LIN28的研究进展
原性谱系，在分化过程中它们表达ＬＩＮ２８。然而，处
于控制中的胚胎干细胞，当有异种胚胎形成时， ＬＩＮ２８下调。这些结果提示，ＬＩＮ２８在肌肉中有着重 要的组织特异性功能。
Ｐｏｌｅｓｓｋａｙａ等旧¨发现，ＬＩＮ２８连接到多核糖体层
的翻泽起始复合物上可增强蛋白合成的效率，ＬＩＮ２８ 在肌细胞中的表达增加了分化的效率，这提示ＬＩＮ２８
鉴定了用于此抑制的ＬＩＮ２８必需区域，此发现确立
了前体的末端环在ｍｉＲＮＡ成熟过程中的调节作用， 提供了ＬＩＮ２８负性调节ｌｅｔ－＇／加工的机制。最近的研
变体中，Ｌ２期大量细胞的特异性分化消失，１３期的
细胞和后期细胞的发育出现成熟。Ｌａｕ等¨２１提出 ＬＩＮ２８的阶段特异性是由２个遗传通路所调节的。
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ＲＮＡ结合蛋白ＬＩＮ２８的研究进展
周红梅△
（江都市人民医院血库，江苏江都２２５２００） 中图分类号：１１３９２．Ｉｌ 文献标识码：Ａ 文章编号：１００６－２０８４（２００９）２０－３０５５－０４
摘要：ＲＮＡ结合蛋白（ＲＢＰ）是决定细胞分化、活动力和其他过程的调节子。Ｌ１Ｎ２８是一 种高度保守的ＲＢＰ，在线虫和高等物种中有着复杂的调节机制和表达方式。它对微小ＲＮＡ 表达的调节、骨髂肌及心肌分化、肿瘤形成、多潜能诱导等多种发育的重要事件中起关键作 用。本文就ＬＩＮ２８的研究进展予以综述。 关键词：ＲＮＡ结合蛋白；ＬＩＮ２８；胚胎干细胞；诱导性多潜能细胞；微小ＲＮＡ
中ＬＩＮ２８的阻抑发生于转录后，且受ｕＮ４、ＬＩＮｌ４的 调控‘１引。
２
ＲＮＡ联结模体：冷休克结构域（ｃｏｌｄ
ｓｈｏｃｋ ｄｏｍａｉｎ， ｆｉｎｇｅｒ ｍｏ—
ＣＳＤ）和一对反向的ＣＣＨＣ锌指模体（ｚｉｎｃ
ｔｉｆｓ，ＺＦＭ），在哺乳动物中，以多种类型富集于未分化 的细胞中，ＬＩＮ２８影响分化中特殊ＲＮＡ的翻译和稳 定性…。
剧毒性Ⅱ型核糖体失活蛋白蓖麻毒素和相思子毒素的检测鉴定方法研究进展
２０２１年３月Ｖｏｌ．３９Ｎｏ．３Ｍａｒｃｈ２０２１ＣｈｉｎｅｓｅＪｏｕｒｎａｌｏｆＣｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ２６０ ２７０专论与综述ＤＯＩ：１０．３７２４／ＳＰ．Ｊ．１１２３．２０２０．１０００１收稿日期：２０２０⁃１０⁃１０∗通讯联系人．Ｔｅｌ：（０１０）６９７６０３３０，Ｅ⁃ｍａｉｌ：ｌｉｕｃｈａｎｇｃａｉ＠ｓｋｌｎｂｃｐｃ．ｃｎ（刘昌财）；Ｔｅｌ：（０１０）６９７６０２５９，Ｅ⁃ｍａｉｌ：ｌｉｕ＿ｓｈｉｌｅｉ＠ｌａｃｒｉｃｄ．ｃｏｍ（刘石磊）．基金项目：国民核化生灾害防护国家重点实验室基金项目（ＳＫＬＮＢＣ２０１８⁃１０）．Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎｉｔｅｍ：ＰｒｏｇｒａｍｏｆＳｔａｔｅＫｅｙＬａｂｏｒａｔｏｒｙｏｆＮＢＣＰｒｏｔｅｃｔｉｏｎｆｏｒＣｉｖｉｌｉａｎ（Ｎｏ．ＳＫＬＮＢＣ２０１８⁃１０）．剧毒性Ⅱ型核糖体失活蛋白蓖麻毒素和相思子毒素的检测鉴定方法研究进展梁龙辉１，２，㊀夏俊美２，㊀刘昌财１，２∗，㊀刘石磊１，２∗（１．国民核生化灾害防护国家重点实验室，北京１０２２０５；２．防化研究院分析化学实验室，北京１０２２０５）摘要：Ⅱ型核糖体失活蛋白（ＲＩＰｓ）是一类重要的蛋白毒素，该类毒素大都具有一对二硫键连接的Ａ⁃Ｂ链结构特征，Ｂ链具有半乳糖结合特性，能够与真核细胞膜表面受体特异性结合，将具有Ｎ⁃糖苷酶活性的Ａ链导入细胞，与核糖体特定位点发生脱嘌呤作用使核糖体失活，最终通过抑制蛋白质合成而展现出细胞毒性㊂Ⅱ型ＲＩＰｓ毒素毒性极强，来源于植物的蓖麻毒素（ｒｉｃｉｎ）和相思子毒素（ａｂｒｉｎ）的毒性分别是神经性毒剂维埃克斯（Ｖｘ）的３８５倍和２８８５倍㊂同时，该类毒素来源广泛㊁易于制备㊁稳定性好，成为一类潜在化生恐怖战剂，受到国内外广泛关注，其中蓖麻毒素作为唯一的蛋白毒素被收录于禁止化学武器公约禁控清单㊂近年来发生的多次蓖麻毒素邮件恐怖事件，进一步促进了有关Ⅱ型ＲＩＰｓ毒素的准确㊁灵敏㊁快速的检测鉴定技术的发展㊂剧毒性Ⅱ型ＲＩＰｓ毒素的检测鉴定方法主要涉及免疫分析法为代表的特异性识别和生物质谱分析为主的定性定量检测方法，以及基于脱嘌呤反应活性和细胞毒性的毒素活性检测方法㊂基于抗原⁃抗体作用的免疫检测法及基于寡核苷酸适配体的特异性识别检测法具有速度快㊁灵敏度高的优势，但对于复杂样品中高度同源蛋白的检测，易产生假阳性结果㊂随着生物质谱技术的快速发展，电喷雾离化（ＥＳＩ）或基质辅助激光解吸离化（ＭＡＬＤＩ）等技术广泛应用于蛋白质的准确鉴定，不仅能够提供蛋白毒素的准确分子量和结构序列信息，而且能够实现准确定量㊂酶解质谱法是应用最为广泛的检测鉴定方法，通过酶解肽指纹谱分析，实现蛋白毒素的准确鉴定；对于复杂样品中蛋白毒素的分析，通过多种蛋白酶酶解策略获得丰富的特异性肽段标志物，然后进行肽段标志物的靶向质谱分析从而获得准确的定性及定量信息，方法有效提升了Ⅱ型ＲＩＰｓ毒素鉴定的准确度和灵敏度㊂免疫分析法和生物质谱法能够准确鉴定Ⅱ型ＲＩＰｓ毒素，但无法识别毒素是否还保持毒性㊂对于Ⅱ型ＲＩＰｓ毒素的活性分析，主要包括基于Ｎ⁃糖苷酶活性的脱嘌呤反应测定法和细胞毒性测定法，两种方法均可实现毒素毒性的简便㊁快速㊁灵敏的分析检测，是Ⅱ型ＲＩＰｓ毒素检测方法的有效补充㊂由于该类毒素的高度敏感性，国际禁止化学武器组织（ＯＰＣＷ）对相关样品中Ⅱ型ＲＩＰｓ毒素的分析提出了唯一性鉴定的技术要求㊂该文引用了Ⅱ型ＲＩＰｓ毒素及其检测方法相关的７０篇文献，综述了以上Ⅱ型ＲＩＰｓ毒素的结构性质㊁中毒机理及典型剧毒性Ⅱ型ＲＩＰｓ毒素检测方法的研究进展，对不同检测方法的特点和应用潜力进行了总结，并结合ＯＰＣＷ对Ⅱ型ＲＩＰｓ毒素唯一性鉴定的技术需求，展望了未来Ⅱ型ＲＩＰｓ毒素检测技术研究的发展趋势㊂关键词：Ⅱ型核糖体失活蛋白；Ｎ⁃糖苷酶活性；毒素；分析检测方法；综述中图分类号：Ｏ６５８㊀㊀㊀文献标识码：Ａ㊀㊀㊀文章编号：１０００⁃８７１３（２０２１）０３⁃０２６０⁃１１ＨｉｇｈｌｙｔｏｘｉｃｔｙｐｅⅡｒｉｂｏｓｏｍｅ⁃ｉｎａｃｔｉｖａｔｉｎｇｐｒｏｔｅｉｎｓｒｉｃｉｎａｎｄａｂｒｉｎａｎｄｔｈｅｉｒｄｅｔｅｃｔｉｏｎｍｅｔｈｏｄｓ：ａｒｅｖｉｅｗＬＩＡＮＧＬｏｎｇｈｕｉ１，２，ＸＩＡＪｕｎｍｅｉ２，ＬＩＵＣｈａｎｇｃａｉ１，２∗，ＬＩＵＳｈｉｌｅｉ１，２∗（１．ＳｔａｔｅＫｅｙＬａｂｏｒａｔｏｒｙｏｆＮＢＣＰｒｏｔｅｃｔｉｏｎｆｏｒＣｉｖｉｌｉａｎ，Ｂｅｉｊｉｎｇ１０２２０５，Ｃｈｉｎａ；２．ＴｈｅＬａｂｏｒａｔｏｒｙｏｆＡｎａｌｙｔｉｃａｌＣｈｅｍｉｓｔｒｙ，ＲｅｓｅａｒｃｈＩｎｓｔｉｔｕｔｅｏｆＣｈｅｍｉｃａｌＤｅｆｅｎｃｅ，Ｂｅｉｊｉｎｇ１０２２０５，Ｃｈｉｎａ）Ａｂｓｔｒａｃｔ：ＴｙｐｅⅡｒｉｂｏｓｏｍｅ⁃ｉｎａｃｔｉｖａｔｉｎｇｐｒｏｔｅｉｎｓ（ＲＩＰｓ）ａｒｅａｎｉｍｐｏｒｔａｎｔｃｌａｓｓｏｆｐｒｏｔｅｉｎｔｏｘ⁃ｉｎｓｔｈａｔｃｏｎｓｉｓｔｏｆＡａｎｄＢｃｈａｉｎｓｌｉｎｋｅｄｂｙａｎｉｎｔｅｒｃｈａｉｎｄｉｓｕｌｆｉｄｅｂｏｎｄ．ＴｈｅＢ⁃ｃｈａｉｎｗｉｔｈｌｅｃ⁃ｔｉｎ⁃ｌｉｋｅａｃｔｉｖｉｔｙｉｓｒｅｓｐｏｎｓｉｂｌｅｆｏｒｂｉｎｄｉｎｇｔｏｔｈｅｇａｌａｃｔｏｓｅ⁃ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇｒｅｃｅｐｔｏｒｓｏｎｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ㊃１６２㊃㊀第３期梁龙辉，等：剧毒性Ⅱ型核糖体失活蛋白蓖麻毒素和相思子毒素的检测鉴定方法研究进展ｃｅｌｌｓｕｒｆａｃｅｓ，ｗｈｉｃｈｉｓｅｓｓｅｎｔｉａｌｆｏｒＡ⁃ｃｈａｉｎｉｎｔｅｒｎａｌｉｚａｔｉｏｎｂｙｅｎｄｏｃｙｔｏｓｉｓ．ＴｈｅＡ⁃ｃｈａｉｎｈａｓＮ⁃ｇｌｙｃｏｓｉｄａｓｅａｃｔｉｖｉｔｙｔｈａｔｉｒｒｅｖｅｒｓｉｂｌｙｄｅｐｕｒｉｎａｔｅｓａｓｐｅｃｉｆｉｃａｄｅｎｉｎｅｆｒｏｍ２８ＳｒｉｂｏｓｏｍａｌＲＮＡ（２８ＳｒＲＮＡ）ａｎｄｔｅｒｍｉｎａｔｅｓｐｒｏｔｅｉｎｓｙｎｔｈｅｓｉｓ．ＴｈｅｓｙｎｅｒｇｉｓｔｉｃｅｆｆｅｃｔｏｆｔｈｅＡ⁃Ｂｃｈａｉｎｉｎａｃｔｉｖａｔｅｓｔｈｅｒｉｂｏｓｏｍｅ，ｉｎｈｉｂｉｔｓｐｒｏｔｅｉｎｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，ａｎｄｅｘｈｉｂｉｔｓｈｉｇｈｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ．ＲｉｃｉｎａｎｄａｂｒｉｎｔｈａｔａｒｅｅｘｐｒｅｓｓｅｄｂｙｔｈｅｐｌａｎｔｓＲｉｃｉｎｕｓｃｏｍｍｕｎｉｓａｎｄＡｂｒｕｓｐｒｅｃａｔｏｒｉｕｓ，ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ，ａｒｅｔｙｐｉｃａｌｔｙｐｅⅡＲＩＰｓ．Ｔｈｅｔｏｘｉｃｉｔｙｏｆｒｉｃｉｎａｎｄａｂｒｉｎａｒｅ３８５ｔｉｍｅｓａｎｄ２８８５ｔｉｍｅｓ，ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ，ｍｏｒｅｔｈａｔｏｆｔｈｅｎｅｒｖｅａｇｅｎｔＶＸ．Ｏｗｉｎｇｔｏｔｈｅｉｒｅａｓｅｏｆｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ，ｗｉｄｅａｖａｉｌａｂｉｌｉｔｙ，ａｎｄｐｏｔｅｎｔｉａｌｕｓｅａｓａｂｉｏｔｅｒｒｏｒｉｓｍａｇｅｎｔ，ｔｙｐｅⅡＲＩＰｓｈａｖｅｇａｒｎｅｒｅｄｉｎｃｒｅａｓｉｎｇａｔｔｅｎｔｉｏｎｉｎｒｅｃｅｎｔｙｅａｒｓ．Ｒｉｃｉｎｉｓｌｉｓｔｅｄａｓａｐｒｏｈｉｂｉｔｅｄｓｕｂｓｔａｎｃｅｕｎｄｅｒｓｃｈｅｄｕｌｅ１ＡｏｆｔｈｅＣｈｅｍｉｃａｌＷｅａｐｏｎｓＣｏｎｖｅｎ⁃ｔｉｏｎ（ＣＷＣ）．Ｔｈｅｏｃｃｕｒｒｅｎｃｅｏｆｒｉｃｉｎ⁃ｒｅｌａｔｅｄｂｉｏｔｅｒｒｏｒｉｓｍｉｎｃｉｄｅｎｔｓｉｎｒｅｃｅｎｔｙｅａｒｓｈａｓｐｒｏｍｏ⁃ｔｅｄｔｈｅｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｏｆａｃｃｕｒａｔｅ，ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ，ａｎｄｒａｐｉｄｄｅｔｅｃｔｉｏｎａｎｄｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙｆｏｒｔｙｐｅⅡＲＩＰｓ．ＳｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｐｒｏｇｒｅｓｓｈａｓｂｅｅｎｍａｄｅｉｎｔｈｅｓｔｕｄｙｏｆｔｏｘｉｃｉｔｙｍｅｃｈａｎｉｓｍｓａｎｄｄｅｔｅｃｔｉｏｎｍｅｔｈｏｄｓｏｆｔｙｐｅⅡＲＩＰｓ，ｗｈｉｃｈｐｒｉｍａｒｉｌｙｉｎｖｏｌｖｅｑｕａｌｉｔａｔｉｖｅａｎｄｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅａｎａｌｙｓｉｓｍｅｔｈｏｄｓｉｎｃｌｕｄｉｎｇｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌａｓｓａｙｓ，ｍａｓｓｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙａｎａｌｙｓｉｓｍｅｔｈｏｄｓ，ａｎｄｔｏｘｉｎａｃｔｉｖ⁃ｉｔｙｄｅｔｅｃｔｉｏｎｍｅｔｈｏｄｓｂａｓｅｄｏｎｄｅｐｕｒｉｎａｔｉｏｎａｎｄｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ．Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙｓｇｅｎｅｒａｌｌｙｉｎｖｏｌｖｅｔｈｅｓｐｅｃｉｆｉｃｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎｏｆａｎｔｉｇｅｎｓａｎｄａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，ｗｈｉｃｈｉｓｂａｓｅｄｏｎｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｍｏｌｅｃｕｌａｒｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎｅｌｅｍｅｎｔｓｃａｌｌｅｄａｐｔａｍｅｒｓ．Ｔｈｅｓｅｍｅｔｈｏｄｓａｒｅｆａｓｔａｎｄｈｉｇｈｌｙｓｅｎｓｉｔｉｖｅ，ｂｕｔｆｏｒｈｉｇｈ⁃ｌｙｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓｐｒｏｔｅｉｎｓｉｎｃｏｍｐｌｅｘｓａｍｐｌｅｓ，ｔｈｅｙｐｒｏｖｉｄｅｆａｌｓｅｐｏｓｉｔｉｖｅｒｅｓｕｌｔｓ．Ｗｉｔｈｔｈｅｒａｐｉｄｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｏｆｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｍａｓｓｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙｄｅｔｅｃｔｉｏｎｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓｓｕｃｈａｓｅｌｅｃｔｒｏｓ⁃ｐｒａｙｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ（ＥＳＩ）ａｎｄｍａｔｒｉｘ⁃ａｓｓｉｓｔｅｄｌａｓｅｒｄｅｓｏｒｐｔｉｏｎｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ（ＭＡＬＤＩ）ａｒｅｗｉｄｅｌｙｕｓｅｄｉｎｔｈｅｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆｐｒｏｔｅｉｎｓ．Ｔｈｅｓｅｍｅｔｈｏｄｓｎｏｔｏｎｌｙｐｒｏｖｉｄｅａｃｃｕｒａｔｅｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎｏｎｍｏｌｅｃ⁃ｕｌａｒｗｅｉｇｈｔａｎｄｓｔｒｕｃｔｕｒｅｏｆｐｒｏｔｅｉｎｓ，ｂｕｔａｌｓｏｄｅｍｏｎｓｔｒａｔｅａｃｃｕｒａｔｅｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ．Ｅｎｚｙｍｅｄｉｇｅｓｔｉｏｎｃｏｍｂｉｎｅｄｗｉｔｈｍａｓｓｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙｉｓｔｈｅｐｒｅｄｏｍｉｎａｎｔｌｙｕｓｅｄｄｅｔｅｃｔｉｏｎｍｅｔｈｏｄ．Ａｃｃｕ⁃ｒａｔｅｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆｐｒｏｔｅｉｎｔｏｘｉｎｓｃａｎｂｅａｃｈｉｅｖｅｄｂｙｆｉｎｇｅｒｐｒｉｎｔａｎａｌｙｓｉｓｏｆｅｎｚｙｍａｔｉｃａｌｌｙｄｉｇｅｓｔｅｄｐｅｐｔｉｄｅｓ．Ｆｏｒａｎａｌｙｓｉｓｏｆｐｒｏｔｅｉｎｔｏｘｉｎｓｉｎｃｏｍｐｌｅｘｓａｍｐｌｅｓ，ａｂｕｎｄａｎｔｐｅｐｔｉｄｅｍａｒｋｅｒｓａｒｅｏｂｔａｉｎｅｄｕｓｉｎｇａｍｕｌｔｉ⁃ｅｎｚｙｍｅｄｉｇｅｓｔｉｏｎｓｔｒａｔｅｇｙ．Ｔａｒｇｅｔｅｄｍａｓｓｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙａｎａｌｙｓｉｓｏｆｐｅｐｔｉｄｅｍａｒｋｅｒｓｉｓｕｓｅｄｔｏｏｂｔａｉｎａｃｃｕｒａｔｅｑｕａｌｉｔａｔｉｖｅａｎｄｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ，ｗｈｉｃｈｅｆｆｅｃ⁃ｔｉｖｅｌｙｉｍｐｒｏｖｅｓｔｈｅａｃｃｕｒａｃｙａｎｄｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙｏｆｔｈｅｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆｔｙｐｅⅡＲＩＰｔｏｘｉｎｓ．ＡｌｔｈｏｕｇｈｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙａｎｄｍａｓｓｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙｄｅｔｅｃｔｉｏｎｍｅｔｈｏｄｓｃａｎｐｒｏｖｉｄｅａｃｃｕｒａｔｅｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆｔｙｐｅⅡＲＩＰｓ，ｔｈｅｙｃａｎｎｏｔｄｅｔｅｒｍｉｎｅｗｈｅｔｈｅｒｔｈｅｔｏｘｉｎｓｗｉｌｌｒｅｔａｉｎｐｏｔｅｎｃｙ．ＴｈｅｗｉｄｅｌｙｕｓｅｄｄｅｔｅｃｔｉｏｎｍｅｔｈｏｄｓｆｏｒａｃｔｉｖｉｔｙａｎａｌｙｓｉｓｏｆｔｙｐｅⅡＲＩＰｓｉｎｃｌｕｄｅｄｅｐｕｒｉｎａｔｉｏｎａｓｓａｙｂａｓｅｄｏｎＮ⁃ｇｌｙｃｏｓｉｄａｓｅａｃｔｉｖｉｔｙａｎｄｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙａｓｓａｙ．Ｂｏｔｈｔｈｅｍｅｔｈｏｄｓｐｒｏｖｉｄｅｓｉｍｐｌｅ，ｒａｐｉｄ，ａｎｄｓｅｎｓｉ⁃ｔｉｖｅａｎａｌｙｓｉｓｏｆｔｙｐｅⅡＲＩＰｔｏｘｉｃｉｔｙ，ａｎｄｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔｏｔｈｅｒｄｅｔｅｃｔｉｏｎｍｅｔｈｏｄｓ．ＯｗｉｎｇｔｏｔｈｅｉｍｐｏｒｔａｎｃｅｏｆｔｙｐｅⅡＲＩＰｔｏｘｉｎｓ，ｔｈｅＯｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎｆｏｒｔｈｅＰｒｏｈｉｂｉｔｉｏｎｏｆＣｈｅｍｉｃａｌＷｅａｐｏｎｓ（ＯＰＣＷ）ｈａｓｐｒｏｐｏｓｅｄｃｌｅａｒｔｅｃｈｎｉｃａｌｒｅｑｕｉｒｅｍｅｎｔｓｆｏｒｔｈｅｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎａｎｄａｎａｌｙｓｉｓｏｆｒｅｌｅ⁃ｖａｎｔｓａｍｐｌｅｓ．Ｗｅｈｅｒｅｉｎｒｅｖｉｅｗｅｄｔｈｅｓｔｒｕｃｔｕｒａｌｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ，ｍｅｃｈａｎｉｓｍｏｆａｃｔｉｏｎ，ａｎｄｔｈｅｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｎｄａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｏｆｔｙｐｅⅡＲＩＰｄｅｔｅｃｔｉｏｎｍｅｔｈｏｄｓ；ｎｅａｒｌｙ７０ｓｔｕｄｉｅｓｏｎｔｙｐｅⅡＲＩＰｔｏｘｉｎｓａｎｄｔｈｅｉｒｄｅｔｅｃｔｉｏｎｍｅｔｈｏｄｓｈａｖｅｂｅｅｎｃｉｔｅｄ．ＩｎａｄｄｉｔｉｏｎｔｏｔｈｅｔｅｃｈｎｉｃａｌｒｅｑｕｉｒｅｍｅｎｔｓｏｆＯＰＣＷｆｏｒｔｈｅｕｎａｍｂｉｇｕｏｕｓｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆｂｉｏｔｏｘｉｎｓ，ｔｈｅｔｒｅｎｄｏｆｆｕｔｕｒｅｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｏｆｔｙｐｅⅡＲＩＰ⁃ｂａｓｅｄｄｅｔｅｃｔｉｏｎｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙｈａｓｂｅｅｎｅｘｐｌｏｒｅｄ．Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：ｔｙｐｅⅡｒｉｂｏｓｏｍｅ⁃ｉｎａｃｔｉｖａｔｉｎｇｐｒｏｔｅｉｎｓ（ＲＩＰｓ）；Ｎ⁃ｇｌｙｃｏｓｉｄａｓｅａｃｔｉｖｉｔｙ；ｔｏｘｉｎ；ｄｅｔｅｃｔｉｏｎｍｅｔｈｏｄｓ；ｒｅｖｉｅｗ色谱第３９卷㊀㊀核糖体失活蛋白（ＲＩＰｓ）是一类Ｎ⁃糖苷酶家族的特征毒蛋白，基于蛋白结构，ＲＩＰｓ被分为Ⅰ型㊁Ⅱ型㊁Ⅲ型共３类［１］㊂Ⅰ型ＲＩＰｓ由单亚基或两个亚基通过非肽键相连构成，相对分子质量约为３０ｋＤａ，具有ＲＮＡ⁃Ｎ⁃糖苷酶活性，例如商陆植物（Ｐｈｙｔｏｌａｃ⁃ｃａａｃｉｎｏｓａ）的ＰＡＰ蛋白和玉米黍的Ｍａｉｚｅｂ⁃３２蛋白等［２，３］㊂Ⅲ型ＲＩＰｓ全部由单亚基构成，相对分子质量约为２５ｋＤａ，通常以前体形式存在，包括Ｎ⁃糖苷酶活性区和未知功能区，经酶切加工转换生成有活性的ⅡＩ型ＲＩＰｓ，目前，仅在大麦中分离检测出Ⅲ型ＲＩＰ蛋白ＪＩＰ６０［４］㊂Ⅱ型ＲＩＰｓ是两个亚基通过二硫键连接构成的异二聚体蛋白，含有Ａ㊁Ｂ链，其中Ａ链为功能链，具Ｎ⁃糖苷酶活性；Ｂ链为结合链，具半乳糖结合的凝集素活性㊂与Ｉ型和Ⅲ型ＲＩＰｓ相比，Ⅱ型ＲＩＰｓ多了具有凝集素活性的Ｂ链，导致其毒性远高于Ｉ型和Ⅲ型ＲＩＰｓ［３］㊂目前，除在少数几种细菌和真菌中发现以外，Ⅱ型ＲＩＰｓ主要存在于一些有毒植物中，并且具有明显的组织特异性，普遍发现植物成熟种子中Ⅱ型ＲＩＰｓ活性相对较高［２］㊂３种类型的ＲＩＰｓ结构及代表蛋白质如图１所示㊂表１㊀剧毒Ⅱ型ＲＩＰｓ及其毒性［２］Ｔａｂｌｅ１㊀ＨｉｇｈｌｙｔｏｘｉｃｔｙｐｅⅡＲＩＰｓａｎｄｔｈｅｉｒｔｏｘｉｃｉｔｙ［２］ＴｏｘｉｎＳｏｕｒｃｅＴｏｘｉｃｉｔｙＨｅｌａｃｅｌｌＩＣ５０／（ｍｏｌ／Ｌ）ａ）ＭｉｃｅｉｎｊｅｃｔｉｏｎＬＤ５０／（μｇ／ｋｇ）ｂ）Ａｂｒｉｎ（相思子毒素）Ａｂｒｕｓｐｒｅｃａｔｏｒｉｕｓｓｅｅｄｓ３．９ˑ１０－１２０．０４Ｒｉｃｉｎ（蓖麻毒素）Ｒｉｃｉｎｕｓｃｏｍｍｕｎｉｓｓｅｅｄｓ６．０ˑ１０－１３３ＭｉｓｔｌｅｔｏｅｌｅｃｔｉｎＩ（槲寄生凝集素Ｉ）Ｖｉｓｃｕｍａｌｂｕｍｌｅａｖｅｓ１．７ˑ１０－９２．４Ｍｏｄｅｃｃｉｎ（药莲毒素）Ａｄｅｎｉａｄｉｇｉｔａｔａｒｏｏｔ２．８ˑ１０－１２５．３Ｖｏｌｋｅｎｓｉｎ（蒴莲毒素）Ａｄｅｎｉａｖｏｌｋｅｎｓｉｉｒｏｏｔ３．０ˑ１０－１３１．７ＲＩＰ（ＲＩＰ毒素）Ａｄｅｎｉａｇｏｅｔｚｉｉｃａｕｄｅｘ１．０ˑ１０－１２－Ｌａｎｃｅｏｌｉｎ（柳杉毒素）Ａｄｅｎｉａｌａｎｃｅｏｌａｔａｃａｕｄｅｘ５．０ˑ１０－１３６．８Ｓｔｅｎｏｄａｃｔｙｌｉｎ（西番莲毒素）Ａｄｅｎｉａｓｔｅｎｏｄａｃｔｙｌａｃａｕｄｅｘ３．０ˑ１０－１３１．２Ａｒａｌｉｎ（阿拉林毒素）Ａｒａｌｉａｅｌａｔａｓｈｏｏｔｓ１．３ˑ１０－１２－Ｒｉｐｒｏｘｉｍｉｎ（利普西敏毒素）Ｘｉｍｅｎｉａａｍｅｒｉｃａｎａｐｏｗｄｅｒ１．１ˑ１０－１２－㊀ａ）ＩＣ５０：ｈａｌｆｐｒｏｔｅｉｎｓｙｎｔｈｅｓｉｓｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ；ｂ）ＬＤ５０：ｌｅｔｈａｌｄｏｓｅｏｆ５０％．－：ｎｏｔｒｅｐｏｒｔｅｄ．㊀㊀Ⅱ型ＲＩＰｓ发挥毒性作用的分子机理是能够特异㊁不可逆地催化脱去真核细胞核糖体的２８ＳｒＲＮＡ中保守ＧＡＧＡ⁃茎环结构中的第一个腺苷上的腺嘌呤，导致核糖体失去进行正常的蛋白质合成功能，从而引起细胞死亡［５，６］㊂表１列举了代表性剧毒Ⅱ型ＲＩＰｓ蛋白的来源及毒性［２］㊂在已发现的剧毒Ⅱ型ＲＩＰｓ毒素中，蓖麻毒素和相思子毒素的毒性最强㊁危害最大㊂由于分布广泛㊁易于获得㊁致命性强等特点，Ⅱ型ＲＩＰｓ被一些国家军方深入研究并制作为化学武器［７］，第一次世界大战期间，美军曾对蓖麻毒素开展过深入研究，并开展了蓖麻毒素作为吸入剂图１㊀３种类型核糖体失活蛋白的结构示意图［１］Ｆｉｇ．１㊀Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｄｉａｇｒａｍｏｆｔｈｅｔｈｒｅｅｔｙｐｅｓｏｆｒｉｂｏｓｏｍｅ⁃ｉｎａｃｔｉｖａｔｉｎｇｐｒｏｔｅｉｎｓ（ＲＩＰｓ）［１］的测试试验㊂在第二次世界大战期间，英国军方研发了一种含有蓖麻毒素的复合炸弹，只是由于难以将大剂量的蓖麻毒素原体转化为气溶胶状态，这类武器还未在正式战争中使用［４］㊂但是，蓖麻毒素经常被作为生物恐怖战剂用于恐怖袭击以及政治暗杀等活动中［７］㊂１９７８年在伦敦的国际间谍人员曾用装有蓖麻毒素的伞尖在公开场所行刺，造成保加利亚作家及持不同政见者乔治㊃马可夫中毒身亡㊂２０１３年和２０２０年，美国时任总统奥巴马和特朗普都收到了含有蓖麻毒素粉末的信件㊂此外，Ⅱ型ＲＩＰｓ毒素来源广泛，易于制备，一旦被不法分子掌握其制备技术，将会成为严重的安全隐患㊂㊀㊀因此，无论是化学武器核查还是生物恐怖防御，对剧毒Ⅱ型ＲＩＰｓ毒素开展检测研究十分重要，也是国内外学者关注的热点㊂目前国际禁止化学武器组织（ＯＰＣＷ）正在组织国际相关领域实验室开展毒素分析演练工作，旨在形成技术体系完善的检测能力，并将毒素分析结果根据获得的信息分为４级，分别是：唯一性鉴定（ｕｎａｍｂｉｇｕｏｕｓ）㊁确证（ｃｏｎｆｉｒｍｅｄ）㊁㊃２６２㊃㊀第３期梁龙辉，等：剧毒性Ⅱ型核糖体失活蛋白蓖麻毒素和相思子毒素的检测鉴定方法研究进展临时性确证（ｐｒｏｖｉｓｉｏｎａｌ）和未确证（ｕｎｃｏｎ⁃ｆｉｒｍｅｄ）㊂由于Ⅱ型ＲＩＰｓ毒素的高度敏感性，ＯＰＣＷ要求对样品必须实现最高级别的唯一性鉴定［８］，这包括必须提供：１）应用质谱或电泳检测的毒素分子量信息；２）应用酶解⁃串联质谱检测至少两条分别来源于Ａ链和Ｂ链肽段标志物的质谱鉴定结果；３）应用酶联免疫吸附检测（ＥＬＩＳＡ）检测的毒素定量分析结果；４）应用脱嘌呤或体外细胞毒性检测方法对Ⅱ型ＲＩＰｓ毒素Ａ链的脱嘌呤活性以及可选的Ｂ链凝集素活性的鉴定结果㊂本课题组所在的防化研究院分析化学实验室作为ＯＰＣＷ指定实验室代表中国持续参加该毒素分析演练任务，研究并构建了包括酶解质谱结构鉴定㊁ＥＬＩＳＡ定量检测以及体外脱嘌呤活性检测等Ⅱ型ＲＩＰｓ毒素唯一性鉴定技术体系［９－１２］㊂本文综述了典型Ⅱ型ＲＩＰｓ蓖麻毒素和相思子毒素的理化性质㊁毒理作用及其检测鉴定方法研究进展，以期为开展相关科学研究提供参考依据㊂１㊀Ⅱ型ＲＩＰｓ的毒性作用机理１．１㊀毒理作用㊀㊀Ⅱ型ＲＩＰｓ毒素的Ａ链具Ｎ⁃糖苷酶活性，特异性水解真核细胞核糖体６０Ｓ大亚基２８ＳｒＲＮＡ保守茎环结构顶部四核苷酸ＧＡ４３２４ＧＡ的腺嘌呤残基；Ⅱ型ＲＩＰｓ毒素的Ｂ链具凝集素特性，通过两个球状结构域发挥活性，每个结构域含有一个半乳糖结合位点，与细胞表面的半乳糖结合，介导Ａ链进入细胞［１３］，导致核糖体失活，从而抑制蛋白质合成，最终引起细胞死亡［９－１１］㊂研究［１４］显示，蓖麻毒素与ＨｅＬａ细胞具较强的相互作用，在每个细胞上检测到约３ ３ˑ１０７个毒素结合位点，结合常数达到２ ６ˑ１０７ｍｏｌ－１㊂然而，Ⅱ型ＲＩＰｓ对植物细胞展现的毒性远不如动物细胞，原因可能是植物细胞壁表面的半乳糖结合位点较少［２］㊂㊀㊀Ⅱ型ＲＩＰｓ毒性强，相思子毒素和蓖麻毒素的小鼠静脉注射毒性是神经性毒剂维埃克斯（Ｖｘ）的２８８５倍和３８５倍㊂同时，研究［１５，１６］发现，序列高度同源的Ⅱ型ＲＩＰｓ毒素以及毒素不同亚型之间的毒性具有较大差异㊂例如，同样来源于植物蓖麻子中的蓖麻凝集素（ＲＣＡ１２０）具有与蓖麻毒素相似的糖苷酶活性，其氨基酸序列与蓖麻毒素Ａ链和Ｂ链的同源性分别达到了９３％和８４％，但其细胞毒性不足蓖麻毒素的十分之一［１７］㊂相思子毒素存在ａ㊁ｂ㊁ｃ和ｄ４种亚型，同源性高达７８％，但毒性差异较大，其中相思子毒素⁃ｂ和相思子毒素⁃ｃ由于其Ｂ链的凝集素活性较低而只有较弱的细胞毒性，反之相思子毒素⁃ａ与相思子毒素⁃ｄ具有极强的细胞毒性［１５，１８］㊂ＲＩＰｓ细胞毒性产生巨大差异的原因主要与细胞表面的受体数量㊁受体亲和力以及ＲＩＰｓ本身的抗降解能力等因素有关㊂１．２㊀细胞内转运途径㊀㊀对于Ⅱ型ＲＩＰｓ毒素在细胞内的代谢途径，目前公认的机理是［１９］：Ⅱ型ＲＩＰｓ毒素通过胞吞作用进入细胞膜，一部分返回细胞膜表面，另一部分进入初级内体（ｅａｒｌｙｅｎｄｏｓｏｍｅｓ）后被转运至次级内体（ｌａｔｅｅｎｄｏｓｏｍｅｓ）；次级内体中的毒素大部分进入溶酶体中进行降解，仅约５％的毒素原体到达高尔基体反面网络结构，经逆向转运至内质网（ＥＲ）；在蛋白质二硫键异构酶和分子伴侣的作用下，Ⅱ型ＲＩＰｓ毒素Ａ链和Ｂ链解离，暴露出疏水区域的Ａ链从ＥＲ释放到细胞质中发挥毒理作用（见图２）［７］㊂此Ａ㊁Ｂ链解离代谢途径在酵母中得到了证实，研究［２０］表明进入内质网的蓖麻毒素Ａ链（ＲＴＡ）通过误折叠激活内质网相关蛋白质降解途径（ＥＲＡＤ），将Ａ㊁Ｂ链解离并使ＲＴＡ穿过ＥＲ膜进入胞浆后在完整核糖体诱导下重新折叠，恢复活性，催化２８ＳｒＲＮＡ脱去腺嘌呤，破坏核糖体结构，导致细胞死亡㊂２㊀Ⅱ型ＲＩＰｓ的检测鉴定方法㊀㊀由于Ⅱ型ＲＩＰｓ毒素的特点及毒害作用，使得此类致命毒素在化生防护㊁化武履约核查和防反化生恐怖等工作中备受关注㊂利用分析检测技术准确鉴定环境及生物医学等样本中的Ⅱ型ＲＩＰｓ毒素，可为Ⅱ型ＲＩＰｓ毒素的使用取证㊁核查分析以及染毒人员的救治提供重要技术依据㊂基于结构与活性，我们将剧毒性Ⅱ型ＲＩＰｓ毒素的检测方法分为３大类，第一类是基于免疫等原理的特异性识别检测方法分析方法，第二类是生物质谱分析方法，前两类均属于毒素非活性定性定量分析方法；第三类是基于脱嘌呤反应活性和细胞毒性的毒素活性体外检测分析法㊂２．１㊀特异性识别检测方法２．１．１㊀酶联免疫吸附检测㊀㊀ＥＬＩＳＡ是将可溶性的抗原或抗体结合到聚苯乙烯等固相载体上，利用抗原抗体专一性结合进行免疫反应的定性和定量检测方法㊂ＥＬＩＳＡ方法种类较㊃３６２㊃色谱第３９卷图２㊀Ⅱ型ＲＩＰｓ毒素进入细胞及在细胞内运输途径的示意图［７］Ｆｉｇ．２㊀ＰａｔｈｗａｙｏｆｔｙｐｅⅡＲＩＰｔｏｘｉｎｓｅｎｔｅｒｉｎｇｃｅｌｌｓａｎｄｔｒａｎｓｐｏｒｔｉｎｇｉｎｃｅｌｌｓ［７］ＥＲ：ｅｎｄｏｐｌａｓｍｉｃｒｅｔｉｃｕｌｕｍ．多且具有敏感度高㊁特异性强㊁操作简便等特点，使其在Ⅱ型ＲＩＰｓ毒素的检测中应用最为广泛㊂随着增强比色法和化学发光技术的出现，进一步提高了ＥＬＩＳＡ方法的灵敏度［２１，２２］㊂Ｓｈｙｕ等［２３］建立了尿液和血清样品中蓖麻毒素的双抗体夹心ＥＬＩＳＡ定量检测方法，检出限达到了５ ０ｎｇ／ｍＬ㊂王晨宇等［２４］利用蓖麻毒素单克隆抗体（ＭＡｂ）３Ｄ７４和标记的小鼠抗⁃蓖麻毒素单克隆抗体４Ｃ１３辣根过氧化物酶（ＨＲＰ），建立了定量检测血清和大鼠组织样品中蓖麻毒素的双夹心ＥＬＩＳＡ方法，检出限为１ ２５ｎｇ／ｍＬ，方法应用于蓖麻毒素组织分布的定量测定，在静脉染毒大鼠的心㊁肝㊁脾㊁肺㊁肾㊁肠和脂肪等组织中均成功检测出蓖麻毒素㊂Ｌｅｉｔｈ等［２５］应用亲和素⁃生物素⁃过氧化物酶复合物法（ａｖｉｄｉｎ⁃ｂｉｏｔｉｎ⁃ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅｃｏｍｐｌｅｘｍｅｔｈｏｄ，ＡＢＣ法），建立了动物组织样本中蓖麻毒素的竞争ＥＬＩＳＡ检测方法，检出限达到０ ２ｎｇ／ｍＬ㊂ＥＬＩＳＡ方法的缺点是对抗体的要求极为苛刻，一旦出现抗体对同源性抗原间的交叉反应，极容易产生假阳性结果㊂同源蛋白干扰（如蓖麻毒素与蓖麻凝集素ＲＣＡ１２０，相思子毒素与相思子凝集素（ａｂｒｕｓａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ））一直是ＥＬＩＳＡ方法检测Ⅱ型ＲＩＰｓ毒素的技术瓶颈，随着样品基质复杂程度的提高，出现假阳性结果的可能性也大大提高㊂为了区分Ⅱ型ＲＩＰｓ同源蛋白蓖麻毒素和ＲＣＡ１２０，德国ＲｏｂｅｒｔＫｏｃｈ研究中心［２６］开发了蓖麻毒素和ＲＣＡ１２０的专属双夹心ＥＬＩＳＡ方法㊂蓖麻毒素⁃ＥＬＩＳＡ双抗体夹心方法应用单抗Ｒ１８（抗蓖麻毒素Ａ链）与单抗Ｒ１０９（抗蓖麻毒素Ｂ链），对蓖麻毒素的最低检出限达到２ｐｇ／ｍＬ，定量范围为５７０８ｐｇ／ｍＬ，在蓖麻毒素定量线性检测范围内，该方法与同源蛋白ＲＣＡ１２０基本不发生交叉反应；ＲＣＡ１２０⁃ＥＬＩＳＡ双抗体夹心方法应用ＲＣＡ１２０单抗ＡＲＫ４和多抗ＩＧＹＲＣ２２，对ＲＣＡ１２０的最低检出限达到１ｐｇ／ｍＬ，定量范围为３ ００ １５４９ｐｇ／ｍＬ，在ＲＣＡ１２０的线性检测范围内，该方法对同源蛋白蓖麻毒素基本不发生交叉反应㊂该中心［２７］应用这两个方法，在２０１３年国际 复杂基质中蓖麻毒素定性和定量检测 能力考试中，准确鉴定出９个样品中添加的蓖麻毒素或蓖麻凝集素，定量检测结果准确度均达到９０％以上㊂２０１７年，Ｈｅ等［２８］从７种相思子毒素新型单克隆抗体中分别筛选出专属相思子毒素Ａ链和Ｂ链的单克隆抗体，并建立了相思子毒素夹心ＥＬＩＳＡ检测方法，该方法能够区分相思子毒素和其同源蛋白相思子凝集素，对牛奶等基质，相思子毒素检出限达为１ｎｇ／ｍＬ㊂随着抗体技术的不断发展，ＥＬＩＳＡ分析法在专属性方面取得了很大的进步，然而，要想获得专属性强的抗体，制备成本非常高，而且需要忍受较短的储存期限和苛刻的保存条件㊂２．１．２㊀蛋白质免疫印迹法㊀㊀蛋白质印迹法（ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ，ＷＢ）是将经过凝胶电泳分离的蛋白质样品转移到固相膜载体（例如硝酸纤维素薄膜）上，再利用抗原抗体结合专一性进行免疫反应的定性和定量检测方法㊂近年来，ＷＢ也常应用于Ⅱ型ＲＩＰ毒素的检测，Ｌａｎｇ等［２９］采用抗ＲＴＡ的兔血清作为抗体，建立了蓖麻毒素的ＷＢ检测方法，最低检出限可达１ｎｇ㊂该方法已成㊃４６２㊃㊀第３期梁龙辉，等：剧毒性Ⅱ型核糖体失活蛋白蓖麻毒素和相思子毒素的检测鉴定方法研究进展功应用于兔血清㊁肝脏组织样品中蓖麻毒素的检测，能够分别在最低加标水平为０ ６７μｇ／ｍＬ的兔血清㊁肝脏组织匀浆样本中检测出蓖麻毒素㊂２．１．３㊀免疫磁性微球及生物传感检测㊀㊀免疫磁性微球（ｉｍｍｕｎｏｍａｇｎｅｔｉｃｍｉｃｒｏ⁃ｓｐｈｅｒｅｓ，ＩＭＭＳ）检测将目标蛋白抗体与磁性微球进行偶联，特异性捕获复杂基质中的目标蛋白，从而达到分离纯化和检测目的㊂免疫磁性微球捕获具分离速度快㊁效率高㊁操作简单㊁重现性好等优点，结合荧光㊁化学发光或电化学发光检测技术，极大地提升了检测速率，使检测时间由８ｈ缩短至２ ４ｈ［３０，３１］㊂基于免疫原理发展的生物传感检测技术，其最大优点是能够通过微型芯片的设计，实现多种毒素的同时快速检测，是事故现场快速检测的有效手段㊂Ｄｅｌｅｈａｎｔｙ等［３２］使用配备电荷耦合原件的抗体微阵列免疫芯片，在１５ｍｉｎ内实现了霍乱毒素㊁葡萄球菌肠毒素Ｂ（ＳＥＢ）㊁蓖麻毒素和芽孢杆菌的同时检测，其中蓖麻毒素的检出限为１０ｎｇ／ｍＬ㊂Ｌｉｇｌｅｒ等［３３］对免疫芯片进一步优化设计，实现了６种毒素的同时检测㊂Ｍｕ等［３４］发展了一种基于隧道磁阻（ＴＭＲ）生物传感器的蓖麻毒素快速检测新方法，将磁免疫色谱试纸与ＴＭＲ磁敏传感器信号检测有效地结合在一起，通过检测功能化磁信号探针在免疫色谱试纸上产生的磁场强度，实现蓖麻毒素的快速检测，定量检测的线性范围为１ｎｇ／ｍＬ ２００μｇ／ｍＬ㊂该方法克服了复杂环境干扰物对毒素检测的影响，可以满足水㊁土壤㊁食物㊁血液等复杂样品的分析要求㊂Ｎａｓｉｒａｈｍａｄｉ等［３５］以含有９个氨基酸的肽段分子印迹聚合物作为模板，在紫外光作用下，在功能单体和表位之间的氢键作用下形成分子印迹聚合物，然后使用２ ５％的十二烷基硫酸钠（ＳＤＳ）和０ ６％乙酸对聚合物进行衍生，最终得到生物传感芯片；将设计的纳米生物传感器应用于血浆和尿样等样品中槲寄生蛋白毒素的快速检测，检出限分别为０ ５和１ ２５ｎｇ／μＬ㊂２．１．４㊀适配体分析法㊀㊀目前已报道的基于抗体识别原理的免疫分析法具有灵敏度高㊁专属性好㊁耗时短㊁定量准确等优点，广泛应用于复杂基质中Ⅱ型ＲＩＰｓ蛋白蓖麻毒素和相思子毒素的检测㊂存在的不足是：方法依赖亲和力强㊁效价高的抗体，对实验室抗体制备能力要求较高，且抗体的贮存稳定性较差㊂Ｓｈｕ等［３６］通过指数富集的配体系统进化技术（ＳＥＬＥＸ），结合ＰＣＲ体外扩增，经过数轮反复的体外筛选㊁扩增得到与蓖麻毒素抗体亲和力和特异性相当的寡核苷酸适配体，建立了基于适配体识别的多纳米孔检测技术，实现了蓖麻毒素的有效检测㊂Ｔａｎｇ等［３７，３８］使用ＳＥＬＥＸ技术筛选出了蓖麻毒素和相思子毒素的适配体并应用于两种毒素的定量检测，定量限分别为１μｇ和０ ３μｇ㊂与免疫识别法相比，适配体的最大优势在于稳定性好㊁可反复使用，但存在筛选过程复杂㊁灵敏度较差等问题㊂因此Ⅱ型ＲＩＰｓ毒素的特异性识别技术的一个关键在于设计制备稳定性好㊁灵敏度高的适配体㊂２．２㊀生物质谱分析㊀㊀２０世纪８０年代发展起来的基质辅助激光解吸附离子化（ＭＡＬＤＩ）和电喷雾离子化（ＥＳＩ）技术，为分析稳定性差㊁难挥发的生物大分子样品提供了优越的分析手段，越来越多的科学家将质谱技术应用于核酸㊁蛋白质等大分子的检测与鉴定㊂如今，生物质谱法已成为复杂样品中蛋白质鉴定的基本方法㊂利用生物质谱技术可以实现大分子蛋白质相对分子质量的测定，２０００年，Ｄｅｓｐｅｙｒｏｕｘ等［３９］使用ＥＳＩ⁃四极杆（Ｑ）质谱对蓖麻毒素进行鉴定，蓖麻毒素原体经电喷雾离化产生多电荷离子，将数据进行解卷积计算，最终得到平均相对分子质量为６３ｋＤ的质谱峰簇，即为蓖麻毒素的相对分子质量㊂高分辨质谱的发展可以提供更为准确的相对分子质量信息，从而有效提升鉴定结果准确性㊂例如ＭＡＬＤＩ⁃飞行时间（ＴＯＦ）高分辨质谱被报道用于鉴定完整蓖麻毒素原体，该方法检测到的蓖麻毒素的相对分子质量为６２７６６Ｄａ［４０］㊂然而，在实际应用中，相对分子质量测定法仍无法给出Ⅱ型ＲＩＰｓ毒素的准确结构信息［４１］㊂随后，人们［４２］尝试在分析前将毒素进行酶解，再应用ＬＣ⁃ＭＳ分析肽指纹图谱或ＬＣ⁃ＭＳ／ＭＳ靶向测定特异性肽段，通过酶解肽段氨基酸序列的鉴定，鉴定蛋白毒素的序列结构，依据这种策略发展出了酶解质谱分析法㊂２．２．１㊀酶解质谱鉴定法㊀㊀与免疫分析方法相比，酶解质谱法具有很多优势：１）能够准确鉴定毒素特异性肽段的氨基酸序列，从而实现高度同源蛋白间的差异性鉴定；２）准确识别毒素蛋白分子内的二硫键位置及翻译后修饰信息；３）通过靶向特异性肽段的定量检测从而实现Ⅱ型ＲＩＰｓ毒素原体的定量检测㊂此外，酶解质谱技术可以与各种分离纯化技术（如凝胶亲和㊁免疫磁㊃５６２㊃色谱第３９卷珠㊁一维及二维电泳等）结合，在质谱分析前对目标蛋白进行富集纯化，降低基质干扰，实现复杂基质中Ⅱ型ＲＩＰｓ毒素专一㊁灵敏的检测㊂酶解质谱法的分析策略如图３所示［４２］㊂图３㊀酶解质谱法分析蛋白策略［４２］Ｆｉｇ．３㊀Ｓｔｒａｔｅｇｙｏｆｐｒｏｔｅｉｎａｎａｌｙｓｉｓｂｙｍａｓｓｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙｆｏｌｌｏｗｉｎｇｅｎｚｙｍｅｄｉｇｅｓｔｉｏｎ［４２］ＳＤＳ⁃ＰＡＧＥ：ｓｏｄｉｕｍｄｏｄｅｃｙｌｓｕｌｐｈａｔｅ⁃ｐｏｌｙａｃｒｙｌａｍｉｄｅｇｅｌｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ．㊀㊀酶解质谱法将大分子蛋白质酶解生成多肽混合物，然后使用高分辨质谱技术（ＬＣ⁃Ｑ⁃ＴＯＦＭＳ或ＭＡＬＤＩ⁃ＴＯＦＭＳ）分析肽指纹图谱（ＰＭＦ）或ＬＣ⁃ＥＳＩ⁃ＭＳ／ＭＳ靶向测定特异性肽段，从而实现蛋白质的鉴定㊂２００１年，Ｄａｒｂｙ［４０］首次将ＰＭＦ法应用于蓖麻毒素的鉴定，分别使用ＬＣ⁃Ｑ⁃ＴＯＦＭＳ和ＭＡＬＤＩ⁃ＴＯＦＭＳ对蓖麻毒素的酶解产物进行分析，结合数据库检索，成功鉴定出蓖麻毒素的１４条肽段㊂Ｓｏｕｓａ等［４３］采用加速溶剂萃取（ＡＳＥ）技术处理含有蓖麻毒素的复杂样品，经ＳＤＳ⁃聚丙烯酰胺凝胶（ＰＡＧＥ）㊁胰蛋白酶解后采用ＭＡＬＤＩ⁃ＴＯＦＭＳ对酶解的肽段进行鉴定，通过ＰＭＦ数据库检索，鉴定出蓖麻毒素的１９条肽段，然后对其中３条唯一性肽段进行ＭＡＬＤＩ⁃ＴＯＦＭＳ／ＭＳ二级质谱检测，实现了蓖麻毒素的唯一性鉴定㊂㊀㊀这些方法虽然准确度高，但在酶解前需要变性㊁还原和烷基化等步骤，整个过程步骤多㊁周期长㊂为解决这一问题，有机溶剂辅助直接酶解蛋白质原体的方法被开发并应用于蓖麻毒素的分析鉴定，例如在酶解样品中使用甲醇等能够有效促进胰蛋白酶解效率㊁缩短酶解时间，这些方法在蓖麻毒素的鉴定与高灵敏检测等方面都取得了较好的结果㊂目前，Ｔ７Ａ㊁Ｔ１１Ａ㊁Ｔ６Ｂ和Ｔ１８Ｂ是蓖麻毒素的胰蛋白酶解肽段中使用最多的代表性肽段标识物，被广泛应用于粉末㊁蓖麻子粗提物㊁牛奶㊁饮料等复杂基质中痕量蓖麻毒素的唯一性鉴定［４１，４４－４９］㊂但是，该方法存在酶解效率较低㊁易发生漏切等缺点㊂本课题组［１１］研究发现乙腈有助于胰蛋白酶准确酶解毒素原体㊁高效生成标识性肽段，并开发和建立了一种乙腈辅助胰蛋白酶直接酶解蓖麻毒素原体的方法，显著提高了酶解效率，将酶解反应时间从１８ｈ减至４ｈ㊂㊀㊀随着技术的不断发展，近年来，免疫磁珠㊁凝胶亲和等技术常作为高效的样品制备手段被应用于复杂基质中目标物的分离与纯化，与质谱等技术相结合，在蛋白质鉴定等方面发挥着重要的作用㊂２０１１年，美国疾控中心（ＣＤＣ）的ＭｃＧｒａｔｈ等［４６］通过制备修饰蓖麻毒素抗体的免疫磁珠，对饮用水㊁牛奶㊁果汁等基质中的蓖麻毒素进行富集，经胰蛋白酶酶解，利用液相色谱⁃线性离子阱质谱靶向鉴定蓖麻毒素Ａ链和Ｂ链的标志性肽段（Ｔ７Ａ和Ｔ１８Ｂ），最终实现了蓖麻毒素的高灵敏鉴定与定量分析，最低检出限达到０ ６４ｎｇ／ｍＬ㊂２０１５年，Ｆｒｅｄｒｉｋｓｓｏｎ等［５０］采用半乳糖凝胶树脂填充柱，对饮用水，饮料㊁粉末以及擦拭样品中的典型剧毒Ⅱ型ＲＩＰｓ毒素（蓖麻毒素㊁相思子毒素㊁蓖麻凝集素）进行选择性富集，结合胰蛋白酶解和高分辨质谱靶向检测技术，实现了复杂样品中Ⅱ型ＲＩＰｓ毒素准确鉴定㊂Ｆｅｌｄｂｅｒｇ等［５１］采用琼脂糖凝胶亲和富集结合三重四极杆串联质谱技术建立了复杂环境样品中痕量蓖麻毒素的检测方法；该方法对从不同地理区域获取的６０种不同环境样本（例如土壤㊁沥青和植被）进行测定，蓖麻毒素的最低检出限达到１ｎｇ／ｍＬ（ｇ）㊂㊀㊀除了使用胰蛋白酶解以外，近年来，科学工作者们还探索了其他酶解方法㊂本课题组［１２］系统研究了蓖麻毒素在不同蛋白酶解（糜蛋白酶㊁胃蛋白酶㊁蛋白酶Ｋ和胰蛋白酶／胞内蛋白酶（Ｇｌｕ⁃Ｃ）串联酶㊃６６２㊃㊀第３期梁龙辉，等：剧毒性Ⅱ型核糖体失活蛋白蓖麻毒素和相思子毒素的检测鉴定方法研究进展解）体系中的最优酶解条件，采用ＬＣ⁃ＥＳＩ⁃Ｑ／ＴＯＦＭＳ高分辨质谱对酶解产生的肽段进行鉴定，结合美国国家生物技术信息中心（ＮＣＢＩ）数据库检索比对，对所有肽段的专属性进行确认与分类，最终筛选鉴定出专属性强且质谱响应好的肽段作为蓖麻毒素的肽段标志物，大大丰富了唯一性鉴定蓖麻毒素肽段标志物的选择范围㊂此外，本课题组［５２］通过离子交换㊁ＨＰＬＣ等方法对我国东北槲寄生植物（Ｖｉｓ⁃ｃｕｍ．ＯｌｏｒａｔｕｍＮａｋａｉ）中的槲寄生毒素进行分离纯化，使用Ｇｌｕ⁃Ｃ酶解槲寄生毒素，然后采用ＭＡＬ⁃ＤＩ⁃ＴＯＦＭＳ对酶解的肽段进行测定，首次鉴定出含有四对二硫键的槲寄生毒素Ｂ７㊂Ｂｒａｕｎ等［５３］报道了使用糜蛋白酶蓖麻毒素进行酶解过夜，使用高分辨液相色谱⁃质谱对糜蛋白酶酶解产生的两条蓖麻毒素肽段进行靶向鉴定，成功实现了植物提取物和土壤样品中蓖麻毒素的准确鉴定㊂㊀㊀近年来，酸消解技术也被用于Ⅱ型ＲＩＰｓ毒素的分析鉴定㊂Ｃｈｅｎ等［５４］采用微波辅助⁃热酸消解方法选择性水解蓖麻毒素氨基酸序列中的天冬氨酸残基，水解时间仅需要１５ｍｉｎ，大大提高了反应效率，结合ＭＡＬＤＩ⁃ＴＯＦＭＳ检测，成功鉴定出蓖麻毒素中的二硫键肽段，为蓖麻毒素的物证鉴定提供了一种可靠的技术手段㊂２．２．２㊀质谱定量检测㊀㊀随着ＬＣ⁃ＭＳ技术的发展，目前除了实现痕量毒素的定性检测外，更多的努力被放在定量分析研究中㊂液相色谱⁃三重四极杆质谱（ＬＣ⁃ＱＱＱＭＳ）的多反应监测模式（ＭＲＭ）和液相色谱⁃四极杆⁃轨道离子阱质谱（ＬＣ⁃Ｑ⁃ＯｒｂｉｔｒａｐＭＳ）的平行反应监测模式（ＰＲＭ）在较宽的动态范围内具有很好的线性响应，在Ⅱ型ＲＩＰｓ毒素的定量分析方面得到了广泛的关注和应用㊂质谱定量离不开同位素标记的内标，目前的研究大多基于同位素标记多肽为内标的绝对定量策略（ａｂｓｏｌｕｔｅｑｕａｎｔｉｔａｔｉｏｎｐｅｐｔｉｄｅｓｔｒａｔ⁃ｅｇｙ，ＡＱＵＡ）：在质谱分析前，向样品中添加已知浓度的同位素标记的多肽内标，由于内标肽段与目标肽段标识物具有相同的色谱和质谱特征，通过比较定量肽段和内标肽段的绝对丰度，实现复杂样品中目标蛋白质的定量检测㊂Ｓｃｈｉｅｌｔｚ等［４９］采用ＡＱＵＡ方法和酶解质谱策略，对１８种不同产地植物蓖麻子中的蓖麻毒素和ＲＣＡ１２０进行定量检测，该研究揭示了不同产地蓖麻子中两种Ⅱ型ＲＩＰｓ毒素的含量差异信息㊂ＭｃＧｒａｔｈ等［４６］以同位素内标肽段建立了饮用水㊁牛奶㊁果汁等食源性基质中蓖麻毒素的免疫捕获⁃酶解质谱定量检测方法，线性范围在１０１００００ｆｍｏｌ／ｍＬ㊂２０１７年，Ｈａｎｓｂａｕｅｒ等［１８］应用胰蛋白酶解结合液质检测不同亚型相思子毒素肽段标志物，首次实现了不同亚型相思子毒素和相思子总蛋白的定量检测㊂㊀㊀ＡＱＵＡ定量方法虽然显著提高了复杂样品中目标蛋白质的定量准确度，但是由于内标肽段无法兼容复杂样品的前处理程序，只能在样品制备后加入内标，导致定量结果仍然存在偏差㊂针对以上问题，科学家［５５，５６］提出了以稳定同位素标记的蛋白质为内标的蛋白质内标绝对定量（ｐｒｏｔｅｉｎｓｔａｎｄａｒｄａｂｓｏｌｕｔｅｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ，ＰＳＡＱ）策略㊂基于无细胞快速表达系统，在体外表达合成稳定同位素标记的内标蛋白质，由于ＰＳＡＱ内标与目标蛋白质具有相近的生化性质，因此可以在分析的最初阶段将蛋白质标样加入样品中，在样品制备及酶解过程中发生的蛋白质损失将不会影响蛋白质定量的准确性㊂Ｄｕｐｒé等［５７］使用单链ＰＳＡＱ内标标记法结合Ｑ⁃Ｏｒｂｉｔｒａｐ高分辨质谱定量研究体液㊁食品等复杂基质中的蓖麻毒素Ａ链㊁金黄葡萄球菌毒素Ｂ和产气荚膜梭菌毒素（ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ）３种毒素，检出限均达到１ｎｇ／ｍＬ㊂该方法的主要是缺点是ＰＳＡＱ内标的合成制备难度大㊁成本高昂，仅适用于Ⅱ型ＲＩＰｓ毒素单链的定量检测㊂全毒素内标的设计与制备，将是实现Ⅱ型ＲＩＰｓ毒素绝对定量检测的关键，然而，目前应用无细胞体外表达和细胞表达技术均未实现具链间二硫键的Ⅱ型ＲＩＰｓ全蛋白毒素同位素内标的生物合成㊂２．３㊀毒性活性的体外检测㊀㊀免疫分析法和酶解质谱法成功应用于Ⅱ型ＲＩＰｓ毒素的定性定量检测，但无法鉴定毒素是否还保持毒性㊂Ⅱ型ＲＩＰｓ毒素的活性鉴定在反应机理评估㊁酶学性质研究㊁寻找抑制剂以及毒素的检测诊断等方面具有重要意义㊂由于该类毒素的高度敏感性，禁止化学武器组织在核查分析中，不仅要求对其进行定性定量检测，同时还要求对其活性进行准确表征㊂目前，对于Ⅱ型ＲＩＰｓ毒素的活性鉴定一般选择脱嘌呤活性的间接测定法和细胞毒性测定法㊂２．３．１㊀脱嘌呤活性体外检测㊀㊀１９８７年Ｅｎｄｏ等［５８］开发的苯胺裂解测定法是最早用于检测Ⅱ型ＲＩＰｓ毒素的脱嘌呤活性的分析方法；结果表明，２８ＳｒＲＮＡ经Ⅱ型ＲＩＰｓ处理后迁移㊃７６２㊃。
烟草亚细胞定位
烟草亚细胞定位亚细胞定位是现代生物学研究的重要领域之一。
它通过对细胞内各种分子的运动和分布进行观察和分析，揭示了细胞内分子交互作用的复杂性和多样性。
烟草作为一种常见的植物，也是亚细胞定位研究的重要对象之一。
本文将从烟草亚细胞结构、亚细胞定位技术以及烟草亚细胞定位的研究进展等方面进行探讨。
一、烟草亚细胞结构烟草细胞是一种典型的植物细胞，由细胞质、细胞核、质膜、细胞壁、线粒体、叶绿体、高尔基体、内质网、核糖体和微管等多个不同的结构组成。
其中，细胞核是细胞的重要组成部分，包含着遗传信息和调控机制。
质膜是细胞的外层结构，维持着细胞内外环境的稳定。
细胞壁是细胞的支撑结构，保护细胞不受外界环境的侵害。
线粒体是细胞内能量的主要来源，参与细胞的呼吸作用。
叶绿体是植物细胞的特征性结构，参与光合作用。
高尔基体和内质网是细胞内蛋白质合成和转运的重要场所。
核糖体是细胞内蛋白质合成的基本单位。
微管是细胞内的一种细胞骨架，参与细胞的形态维持和运动。
二、亚细胞定位技术亚细胞定位技术是研究细胞内分子运动和分布的重要手段。
目前常用的亚细胞定位技术主要包括荧光显微镜技术、电子显微镜技术、蛋白质标记技术和基因工程技术等。
其中，荧光显微镜技术是最常用的亚细胞定位技术之一。
它利用荧光染料或荧光蛋白对细胞内分子进行标记，通过荧光显微镜观察细胞内分子的运动和分布。
电子显微镜技术则可以观察到更高分辨率的细胞结构和分子分布。
蛋白质标记技术和基因工程技术则可以对分子进行精确的定位和操作，提高亚细胞定位的精度和可靠性。
三、烟草亚细胞定位研究进展烟草作为一种常见的植物，其亚细胞定位研究也有着广泛的应用和深入的研究。
近年来，烟草亚细胞定位研究主要集中在以下几个方面：1.烟草亚细胞蛋白质定位烟草中有大量的蛋白质参与细胞的生长和发育过程。
通过荧光蛋白标记技术和基因工程技术，可以对这些蛋白质进行定位和操作。
研究表明，烟草细胞质内的微管蛋白可以定位在微管上，参与细胞的形态维持和运动。
rna功能的研究进展
RNA功能及研究进展许秀勤-2015220600-生物科学与技术学院RNA指ribonucleic acid 核糖核酸,核糖核苷酸聚合而成的没有分支的长链。
分子量比DNA小,但在大多数细胞中比DNA丰富。
RNA主要有3类,即信使RNA(mRNA),核糖体RNA(rRNA)和转运RNA(tRNA)。
rRNA是核糖体的组成成分,由细胞核中的核仁合成,而mRNA、tRNA在蛋白质合成的不同阶段分别执行着不同功能;mRNA是以DNA的一条链为模板,以碱基互补配对原则,转录而形成的一条单链,主要功能是实现遗传信息在蛋白质上的表达,是遗传信息传递过程中的桥梁;tRNA 的功能是携带符合要求的氨基酸,以连接成肽链,再经过加工形成蛋白质。
1.携带遗传信息在RNA病毒中,RNA是遗传物质,植物病毒总是含RNA。
近些年在植物中陆续发现一些比病毒还小得多的浸染性致病因子,叫做类病毒。
类病毒是不含蛋白质的闭环单链RNA分子2.具有催化活力核酶(ribozyme)是具有催化功能的RNA分子,是生物催化剂,可降解特异的mRNA序列。
具有核酸内切酶和连接酶的活性,能够对体内合成的RNA进行加工和处理,这些过程是不需要任何蛋白质和酶的参与。
研究的追彻底的是RNaseP,它是核糖核蛋白体复合物,能剪切所有tRNA前体的5’端,除去多余的序列,形成3’-OH 和5’-磷酸末端。
3.调控功能体内许多RNA调控体内的各种代谢平衡,如反义RNA、sRNA、gRNA等等,对体内的基因表达起到调控的作用。
应用:RNA干扰(RNAi)RNA干扰(RNA interference, RNAi)是指在进化过程中高度保守的、由双链R NA(double-stranded RNA,dsRNA)诱发的、同源mRNA高效特异性降解的现象。
基因沉默,主要有转录前水平的基因沉默(TGS)和转录后水平的基因沉默(P TGS)两类:TGS是指由于DNA修饰或染色体异染色质化等原因使基因不能正常转录;PTGS是启动了细胞质内靶mRNA序列特异性的降解机制。