细胞实验技术

（一）干扰引物（shRNA）设计：

1、NCBI上下载基因序列

2、在sigema网站输入基因号设计一对21个碱基的干扰引物（上下游）

3、从起始密码（ATG）下游25bp开始；

4、GC含量介于40%~60%

5、干扰引物至少一个在SDS区，一个在3’UTR区

6、选择脱靶率低的

（二）、干扰载体构建

1、引物退火（引物加水看标签X 50,弹匀，瞬离）

退火体系：

上游：5ul

下游：5ul

10X M buffer 5ul

H2O 35ul

水浴锅100℃2min，锅里隔夜

（三）、酶切plko.1载体

1、AgeI 酶切，反应体系：

plko.1载体4ug

AgeI 2ul

10X AgeI buffer 5ul

H2O 39ul

37℃水浴2~3h

2、切胶回收AgeI 酶切产物，30ul 水洗脱

3、EcoRI酶切，反应体系：

AgeI 酶切产物30ul

EcoRI 2ul

10X H buffer 5ul

H2O 13ul

37℃水浴2~3h

切胶回收，30ul 水洗脱，测浓度

（四）、连接

连接体系：T4连接：

退火引物2ul 退火引物5ul

酶切载体1ul 酶切载体1ul

Solution I 5ul T4连接酶1ul

H2O 2ul T4连接酶Buffer 1ul

H2O 2ul

室温下连接4h。

（五）、转化

-80℃取感受态细胞于冰上融化，在1.5ml离心管加33ul感受态，将连接产物加入，冰上放置30min，42℃水浴60~90s，冰上放置2min，加入无氨苄培养基，37℃摇床1h，涂布在氨苄平板上，37℃，16h。

（六）、挑菌

用枪头挑取5个菌落（可送测序）扩大培养，加有氨苄的培养基，37℃过夜培养。

（七）、提质粒

碱裂解法是一种应用最为广泛的制备质粒DNA的方法，碱变性抽提质粒DNA是基于染色体DNA与质粒DNA 的变性与复性的差异而达到分离目的。在pH值高达12.6的碱性条件下，染色体DNA的氢键断裂，双螺旋结构解开而变性。质粒DNA的大部分氢键也断裂，但超螺旋共价闭合环状的两条互补链不会完全分离，当以pH4.8的NaAc/KAc高盐缓冲液去调节其pH值至中性时，变性的质粒DNA又恢复原来的构型，保存在溶液中，而染色体DNA不能复性而形成缠连的网状结构，通过离心，染色体DNA与不稳定的大分子RNA、蛋白质－SDS复合物等一起沉淀下来而被除去。

简明原理：碱裂解法是基于DNA的变性与复性差异而达到分离目的的。碱性使质粒DNA变性，再将pH值调至中性使其复性，复性的为质粒DNA，而染色体DNA不会复性，缠结成网状物质，通过离心除去。

1、取5ml菌液于离心管，12000 rpm 1min ，弃上清

2、向沉淀加500 ul P1 ，震荡重悬

3、加入500 ul P2 ，温和翻转6~8 次，充分裂解（不超过5 min，一般3min）

4、加入700 ul P3 ，温和翻转6~8 次，出现白色絮状沉淀，12000 rpm 10 min

5、将上清加入CS柱（已放入收集管），12000 rpm 2min，将收集管中液体加入吸附柱CP4中，12000 rpm ，

1min ，弃废液

6、CP4柱中加入500 ul PD ,12000rpm ，1 min ，弃液

7、CP4柱中加入600 ul Pw,室温放置3 min ,12000rpm ，1 min ，弃液

8、空离12000rpm ，2 min，室温放置几分钟（把乙醇蒸发）

9、CP4柱置于1.5ml 离心管，向柱中心加35 ul ddH2O ，室温放置2 min ，12000rpm ，1 min。

（八）、测质粒浓度

打开软件，ddH2O 清洗仪器3~5次，点击black ，F1，结果不大于0.2

每个样品吸取1ul，于仪器上，F1，结果浓度大于500，OD值1.88~1.90

质粒置于-20 ℃，保存

（九）、细胞复苏

1、37℃预热PBS，取8ml PBS 于10 ml 离心管中

2、液氮中取出冻存的细胞，37℃水浴融化

3、吸取冻存细胞于PBS中，轻混匀，室温800 rpm 3min ，去上清，加入1ml 培养基重悬，

4、细胞重悬液加到含8ml 培养基的培养皿中，37℃，5% CO2 ,培养

（十）、细胞分盘

1、吸去培养液，加入PBS 清洗

2、吸去PBS ，加入1ml 胰酶，37℃培养箱消化1min

3、用巴氏吸管加入2ml 培养液终止消化，用枪头冲洗培养皿，将液体转到5 ml 离心管中，750 rpm ，

室温，5 min

4、加入1ml培养液重悬，按1；3 分盘

（十一）、转染

1、PLP1 625 ng/孔

PLP2 625 ng/孔

2ml 离心管PLP/VSVG 625 ng/孔混匀

目的质粒625 ng/孔

Opti 培养基500ul/孔

2、脂质体6ul/孔

2ml 离心管请轻混匀，室温下孵育，5 min

Opti 培养基500ul/孔

将质粒和脂质体混合，轻轻混匀，室温孵育20 min

3、吸去细胞培养皿中的培养液，加入3 ml PBS 清洗，加1ml 胰酶，37℃消化，加培养液终止消化；收集于5ml离心管，750 rpm，室温，5 min；弃上清，加入Opti 培养液重悬

4、在六孔板中加入850ul Opti 培养液，加入包装的脂质体，混匀后加入细胞重悬液，十字摇匀，37℃，5% CO2 ,

培养，6~8h 后去除培养基，加入3ml 新转染培养基，继续培养两天