水稻配子体雄性不育细胞质多态性及恢保关系差异研究

江西农业大学学报２０１６，３８（６）：１０１７—１０２２　Ａｃｔａ　Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｅ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔａｔｉｓ　Ｊｉａｎｇｘｉｅｎｓｉｓ　ｈｔｔｐ：／／ｘｕｅｂａｏ．ｊｘａｕ．ｅｄｕ．ｃｎ　

ＤＯＩ：１０．１３８３６／ｊ．ｊｊａｕ．２０１６１４３　

钱明娟，谢红卫，蔡怡聪，等．水稻配子体雄性不育细胞质多态性及恢保关系差异研究［Ｊ］．江西农业大学学报，２０１６，３８　（６）：１０１７－１０２２．　

水稻配子体雄性不育细胞质多态性　及恢保关系差异研究　钱明娟　，谢红卫　，蔡怡聪　，潘境涛。，谢启鑫　，　李永辉　，毛凌华　，蔡耀辉　（１．江西省超级水稻研究发展中　Ｏ／国家水稻工程实验室（南昌），江西南昌３３０２００；２．中国水稻研究所，浙江杭州　３１０００６；３．南昌大学生命科学学院，江西南昌３３００３１）　

摘要：为解释育种实践中常出现的相同类型不育系与不同恢复系杂交组合Ｆ　代育性恢复有明显差异的现象，　笔者通过对同核异质的５个配子体不育系Ｗ１５Ａ、Ｗ２０Ａ、Ｗ３４Ａ、Ｗ４６Ａ和ＹＡ线粒体ＤＮＡ进行ＲＡＰＤ扩增聚　类，不育基因ｏｒｆ（Ｈ）７９基因及基因间区序列测序，测配Ｆ　分析其恢保关系，展示同型细胞质的差异与恢保差异　的关系。结果表明，通过ＲＡＰＤ扩增聚类，这５个配子体细胞质雄性不育系在线粒体基因组可聚分为３类，而　Ｗ３４Ａ与其他４个不育系的细胞质亲源关系较远。不育基因及基因间区序列均存在多个差异位点，５个水稻配　子体雄性不育细胞质在大部分水稻材料的测恢中，恢保关系一致，而一部分材料的恢保关系差异较大。该研究　为新型配子体不育系的选育、组合配制和同核多胞质混合杂交水稻亲本的选择提供一定的理论依据。　

关键词：配子体细胞质雄性不育；多态性；线粒体基因组；水稻　中图分类号：￥５１１．０３２　文献标志码：Ａ　文章编号：１０００—２２８６（２０１６）０６—１０１７—０６　

Ａ　Ｓｔｕｄｙ　ｏｆ　Ｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃ　Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ　ａｎｄ　Ｒｅｓｔｏｒｅ・ｍａｉｎｔａｉｎ　Ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ　ｏｆ　Ｒｉｃｅ　Ｇａｍｅｔｏｃｙｔｅ　Ｍａｌｅ　Ｓｔｅｒｉｌｉｔｙ　

ＱＩＡＮ　Ｍｉｎｇ－ｊｕａｎ　，ＸＩＥ　Ｈｏｎｇ．ｗｅｉ　，ＣＡＩ　Ｙｉ—ｃｏｎｇ　，ＰＡＮ　Ｊｉｎｇ—ｔａｏ。，　ＸＩＥ　Ｑｉ．ｘｉｎ　，ＬＩ　Ｙｏｎｇ—ｈｕｉ　，ＭＡＯ　Ｌｉｎｇ—ｈｕａ　，ＣＡＩ　Ｙａｏ—ｈｕｉ　（１．Ｊｉａｎｇｘｉ　Ｓｕｐｅｒ—ｒｉｃｅ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ　ａｎｄ　Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ　Ｃｅｎｔｅｒ／Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　ｏｆ　Ｒｉｃｅ（Ｎａｎ・　ｃｈａｎｇ），Ｎａｎｃｈａｎｇ　３３０２００；２．Ｃｈｉｎａ　Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ｒｉｃｅ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ　Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，Ｈａｎｇｚｈｏｕ　３１０００６；３．Ｎａｎｃｈａｎｇ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉ－　ｔｙ，Ｎａｎｃｈａｎｇ　３３００３１）　

Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｉｎ　ｏｒｄｅｒ　ｔｏ　ｉｌｌｕｍｉｎａｔｅ　ｔｈｅ　ｆｅｒｔｉｌｉｔｙ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅｓ　ｉｎ　ｔｈｅ　Ｆ１　ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎｓ　ｆｒｏｍ　ｃｒｏｓｓｂｒｅｅｄｉｎｇ　ｂｅｔｗｅｅｎ　ｔｈｅ　ｓａｍｅ　ｔｙｐｅ　ＣＭＳ　ｌｉｎｅｓ　ｗｉｔｈ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ　ｒｅｓｔｏｒｅｒｓ，ｆｉｖｅ　ｈｏｍｏｎｕｃｌｅｕｓ－ａｌｌｏｐｌａｓｍ　Ｇａｍｅｔｏｐｈｙｔｅ　ｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃ　ｍａｌｅ　ｓｔｅｒ－　ｉｌｅ　ｌｉｎｅｓ　ｗｅｒｅ　ｕｓｅｄ，ｔｈｅｙ　ｗｅｒｅ　Ｗ１５Ａ，Ｗ２０Ａ，Ｗ３４Ａ，Ｗ４６Ａ　ａｎｄ　ＹＡ．ＲＡＰＤ（Ｒａｎｄｏｍ　Ａｍｐｌｉｆｉｅｄ　Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｃ　

收稿日期：２０１６—０５—３１　修回日期：２０１６—０８—１０　基金项目：国家自然科学基金项目（３１３６０３３２）、江西省科技计划重大项目（２０１４３ＡＣＦ６０００８）、江西省科技支撑计划　（２０１２３ＢＢＦ６０１８７）和江西省农业科学院博士启动基金项目（２０１４１ＣＢＳ００１）　Ｐｒｏｊｅｃｔ　ｓｕｐｐｏｓｅｄ　ｂｙ　ｔｈｅ　Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ｎａｔｕｒａｌ　Ｓｃｉｅｎｃｅ　Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｃｈｉｎａ（３１３６０３３２），Ｍａｊｏｒ　ｐｒｏｊｅｃｔｓ　ｏｆ　ｓｃｉｅｎｃｅ　ａｎｄ　ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　ｐｌａｎ　ｏｆ　Ｊｉａｎｇｘｉ　ｐｒｏｖｉｎｃｅ（２０１４３ＡＣＦ６０００８），Ｔｈｅ　Ｓｃｉｅｎｃｅ　ａｎｄ　ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　ｓｕｐｐｏ￣ｐｒｏｇｒａｍ　ｏｆ　Ｊｉａｎ・　ｇｘｉ　Ｐｒｏｖｉｎｃｅ（２０１２３ＢＢＦ６０１８７）ａｎｄ　Ｄｏｃｔｏｒ　ｓｔａｒｔｕｐ　Ｆｕｎｄ　ｏｆ　Ｊｉａｎｇｘｉ　Ａｃａｄｅｍｙ　ｏｆ　Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ　Ｓｃｉｅｎｃｅｓ　（２０１４１ＣＢＳ００１）　作者简介：钱明娟（１９８６一），女，助理研究员，硕士，主要从事水稻遗传育种研究，ｑｉａｎｍｊ０１２３＠１６３．ｃｏｒｎ；　通信作者：　

谢红卫，博士，ｘｈｗ２０６＠１６３．ｃｏｒｎ。　・１０１８・　江西农业大学学报　第３８卷　ＤＮＡ）ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ，ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ　ａｎｄ　ｃｒｏｓｓｂｒｅｅｄｉｎｇ　ｗｅｒｅ　ｕｓｅｄ　ｔｏ　ｄｉｓｐｌａｙ　ｔｈｅ　ｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃ　ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ　ａｎｄ　ｔｈｅ　ｖａｒｉ—　ＯＵＳ　ｒｅｓｔｏｒｅ－ｍａｉｎｔａｉｎ　ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐｓ．Ｂａｓｅｄ　ｏｎ　ＲＡＰＤ　ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ　ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ　ＤＮＡ，ｔｈｅ　ｆｉｖｅ　ＣＭＳ　ｌｉｎｅｓ　ｃｏｕｌｄ　ｂｅ　ｄｉｖｉｄｅｄ　ｉｎｔｏ　ｔｈｒｅｅ　ｃａｔｅｇｏｒｉｅｓ，Ｗ３４Ａ　ｈａｄ　ｔｈｅ　ｆｕｒｔｈｅｓｔ　ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ　ｗｉｔｈ　ｔｈｅ　ｏｔｈｅｒｓ．Ｖｉａ　ｓｅ－　ｑｕｅｎｃｅ　ａｎａｌｙｓｉｓ　ｏｆ　ｔｈｅ　０矿（Ｈ）７９　ｇｅｎｅ　ａｎｄ　ｔｈｅ　ｌｉｎｋｅｄ　ｓｅｇｍｅｎｔ　ｓｈｏｗｅｄ　ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ　ｖａｒｉａｔｉｏｎｓ．Ｆｅｒｔｉｌｉｔｙ　ａｎａｌｙｓｉｓ　ｏｆ　Ｆ１　ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎｓ　ｆｒｏｍ　ｃｒｏｓｓｉｎｇ　ｂｅｔｗｅｅｎ　ｔｈｅ　ｆｉｖｅ　ＣＭＳ　ｌｉｎｅｓ　ｗｉｔｈ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ　ｒｅｓｔｏｒｅｒｓ　ｓｈｏｗｅｄ　ｔｈａｔ　ｍｏｓｔ　ｒｅｓｔｏｒｅ・－ｍａｉｎ・－　ｔａｉｎ　ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐｓ　ｗｅｒｅ　ｉｄｅｎｔｉｃａｌ，ｂｕｔ　ｄｉｆｅｒｅｎｃｅｓ　ｉｎ　ｓｅｖｅｒａｌ　ｈｙｂｒｉｄｉｚｅｄ　ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎｓ　ｗｅｒｅ　ａｌｓｏ　ｄｅｔｅｃｔｅｄ．Ｔｈｅｒｅ—　ｆｏｒｅ，ｔｈｅ　ｓｔｕｄｙ　ｃｏｕｌｄ　ｐｒｏｖｉｄｅ　ｔｈｅｏｒｅｔｉｃａｌ　ｇｕｉｄａｎｃｅ　ｆｏｒ　ｂｒｅｅｄｉｎｇ　ｎｅｗ　ｓｔｅｒｉｌｅ　ｃｙｔｏｐｌａｓｍ，ｈｙｂｒｉｄ　ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ　ｄｅｓｉｇｎ　ａｎｄ　ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ　ｏｆ　ｒｉｃｅ　ｐａｒｅｎｔｓ　ｔｏ　ｇｅｔ　ｈｏｍｏｎｕｃｌｅｕｓ－ａｌｌｏｐｌａｓｍ　ｃｕｈｉｖａｒｓ．　Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：ｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃ　ｍａｌｅ　ｓｔｅｒｉｌｉｔｙ；ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ；ｒｅｓｔｏｒｅ－ｍａｉｎｔａｉｎ　ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ；ｒｉｃｅ　

中国的育种工作者利用种间、亚种间及品种问杂交，先后发现并培育６０多种细胞质雄性不育系　，　在我国推广应用的主要有９种类型，其中红莲型、包台型和滇型为配子体细胞质雄性不育类型，其余为　孢子体细胞质败育类型ｌ２］。不同类型不育系恢保关系上差异明显，配子体不育系和孢子体不育系在与　很多恢复系的测恢中表现相反的恢保关系　。目前已经克隆了孢子体不育野败型不育基因ＷＡ３５２，在　其他孢子体类型不育系中，如冈型、Ｄ型、Ｋ型、矮败型、印水型等不育系中均含有该不育基因　。克隆　的配子体型不育类型包台型、红莲型不育基因ｏ（７９和ｏ￣Ｈ７９＿５　，这两个不育基因仅有５个碱基差异，　与ａｔｐ６形成共转录本　，在滇型不育系中也检测到不育基因ｏｒｆ７９　Ｊ。　以往的研究发现，含ｅｒｒ７９和ｏｏＣＨ７９的配子体不育系他们的恢复度有差异，但恢保关系还是一致，　如牟风娟等　对７种不同细胞质源滇型不育系间恢保关系研究发现保持关系一致，滇型恢复系对这７　个不育系的均能恢复，但恢复能力有差异。在实际的育种实践中，笔者也发现相同类型不育系在测交　中，恢保关系相似，但不完全相同，在一些恢复系同型不育系的测交中，Ｆ　代育性恢复是有明显差异的，　甚至会有着截然相反的结果，有些完全不恢复，有些则是完全恢复。　本研究选用５个同核异质配子体不育系Ｗ１５Ａ、Ｗ２０Ａ、Ｗ３４Ａ、Ｗ４６Ａ和ＹＡ，通过对他们的整个线　粒体基因组和不育基因的扩增鉴定、并选用多个恢复系材料对５个配子体不育系进行测恢，探讨同型不　育系细胞质差异与恢保关系的关联，为新型配子体不育系恢复系的选择和配子体型多胞质混合杂交水　稻发展的提供理论支撑。　

１材料与方法　１．１试验材料　红莲型不育系粤泰Ａ（简称ＹＡ）及其他４个配子体细胞质雄性不育系Ｗ１５Ａ、Ｗ２０Ａ、Ｗ３４Ａ、Ｗ４６Ａ　均是以普通野生稻为细胞质供体与红莲型保持系粤泰Ｂ回交培育而成的同核异质不育系。　恢复系材料均为栽培稻品种，包括Ｒ９、Ｒ２００７、２２７７、美国雷蒙特、谷农矮２３、合亲１４、ＨＢ５４２、　Ｎ０３Ｓ９７、１２９、柴圭、Ｈ３、谷甫矮、双朝２５、茂三、９８ＱＪ、合亲３０、Ｒ２８８、Ｎ０３Ｓ９５、Ｈ９００３１、ＲＲ１０４７、生恢７４７、　绵恢７４７、绵恢７２５、芝恢、反Ａ９５．１０２、反Ａ９５—１２０、干亲１１４、９３１１、秋光、Ｄ６２１３和ＣＲ２２共３１个。　１－２试验方法　１．２．１　水稻超纯线粒体ＤＮＡ提取水稻超纯线粒体ＤＮＡ的提取参考易平　的方法并且作了适当调　整。提取步骤包括：采用差速离心法从取水稻黄化苗（黑暗条件下培养的幼苗）中提取线粒体，ＤｎａｓｅＩ　处理１　ｈ后，加入ＳＤＳ裂解液（含ＲＮａｓｅＡ），５０℃水浴中裂解再加入蛋白酶Ｋ，３７℃水浴，然后在４℃　下，分别用Ｔｒｉｓ饱和酚、酚／氯仿／异戊醇（２４：２４：１）、氯仿／异戊醇（２４：１）抽提，最后通过琼脂糖凝胶电泳　和分光光度计检测线粒体ＤＮＡ的纯度和浓度，并将ＤＮＡ稀释成统一的浓度保存备用。　１．２．２线粒体ＤＮＡ　ＲＡＰＤ扩增ＲＡＰＤ引物（１０个碱基）合成于上海生物工程有限公司，ＲＡＰＤ扩增筛　选一般采用２５个循环数，退火温度３６～３８　ｃＣ，本实验根据实际情况，考虑到线粒体基因组ＤＮＡ的纯　度，采用的条件为：循环数为３Ｏ，退火温度为３７℃，延伸时间为１．５　ｍｉｎ。　１．２．３聚类分析方法根据ＲＡＰＤ分子标记扩增结果，根据有无条带将结果统计成二元数据，有带（显　性）记为“１”，无带（隐陛）记为“０”，并用Ｅｘｃｅｌ统计成表格；用ＮＴＭＡＳ（Ｎｕｍｅｒｉｃａｌ　Ｔａｘｏｎｏｍｙ　ａｎｄ　Ｍｕｈｉ—