食品安全学实验指导

食品安全学实验指导宁喜斌2007年4月5※<前言>随着生活水平的提高，消费者对食品安全问题越来越重视。

社会对食品安全的专门人才数量和质量都在增加，在此背景下国内许多高校都成立了食品质量与安全专业。

《食品安全学》作为该专业的一们核心课程，不但要求学生掌握坚实的食品安全理论知识，也要求学生具备扎实的实践技能，因此，我们组织了相关人员编写这本实验指导，供同学们参考。

本实验指导由宁喜斌，丛健，张慧，窦勇，王璐华完成。

鉴于水平有限，以及时间较紧，书中的错误不可避免，希望使用者能够给予批评指正，以便我们能够及时进行修正。

编者2007年4月5※<目录>实验一食品中金黄色葡萄球菌的检验实验二食品中沙门氏菌的检验实验三酶联免疫吸附试验（ELISA）实验四PCR技术快速检测副溶血弧菌实验五 3M大肠杆菌和大肠菌群快速检验实验六对硫磷在苹果中残留的分析方法实验七食品中药残的快速检测5※<实验一>实验一食品中金黄色葡萄球菌的检验一、实验目的学习食品中金黄色葡萄球菌的基本检验方法。

二、基本原理葡萄球菌在自然界分布极广，空气、土壤、水、饲料、食品(剩饭、糕点、牛奶、肉品等)以及人和动物的体表粘膜等处均有存在，大部分是不致病，也有一些致病的球菌。

金黄色葡萄球菌是葡萄球菌属一个种。

可引起皮肤组织炎症，还能产生肠毒素。

如果在食品中大量生长繁殖，产生毒素，人误食了含有毒素的食品，就会发生食物中毒，故食品中存在金黄色葡萄球菌对人的健康是一种潜在危险，检查食品中金黄色葡萄球菌及数量具有实际意义。

金黄色葡萄球菌能产生凝固酶，使血浆凝固，多数致病菌株能产生溶血毒素，使血琼脂平板菌落周围出现溶血环，在试管中出现溶血反应。

这些是鉴定致病性金黄色葡萄球菌的重要指标。

三、设备和材料实验器材：显微镜、恒温培养箱（37℃）、冰箱、移液管（1mL、5 mL 、10mL）、试管（15×150mm）、锥形瓶（250mL、100mL）、培养皿、L型涂布棒、酒精灯、接种环、试管架、试管篓、灭菌锅、小试管（3×50mm）实验材料：污染牛奶等。

四、培养基和试剂胰酪胨大豆肉汤、血琼脂平板、Baird－Prker琼脂平板、营养肉汤、0.85％灭菌生理盐水、兔血浆、革兰氏染色剂五、操作步骤1.检样处理：吸取25mL液体样品，加入225mL灭菌生理盐水，置均质器中制成混悬液。

2.增菌培养1)增菌及分离培养：吸取5mL上述混悬液，接种于胰酪胨大豆肉汤50mL培养基内，置36±1℃温箱培养24h，转种血平板和Baird－Parker平板，36±1℃培养24h，挑取金黄色葡萄球菌菌落进行革兰氏染色镜检及血浆凝固酶试验。

2)形态观察：本菌为革兰氏阳性球菌，排列是葡萄球状，无芽胞，无荚膜，致病性葡萄球菌菌体较小，直径约为0.5～1μm。

在肉汤中呈混浊生长，在胰酪陈大豆肉汤内有时液体澄清，菌量多时呈混浊生长，血平板上菌落呈金黄色，也有时为白色，大而突起、圆形、不透明、表面光滑，周围有溶血圈。

在Baird－Parker平板上为圆形、光滑凸起、湿润、直径为2～3mm，颜色呈灰色到黑色，边缘为淡色，周围为一混浊带，在其外层有一透明圈。

用接种针接触菌落似有奶油树胶的硬度，偶然会遇到非脂肪溶解的类似菌落；但无混浊带及透明圈。

长期保存的冷冻或干燥食品中所分离的菌落比典型菌落所产生的黑色较淡些，外观可能粗糙并干燥。

3)血浆凝固酶实验吸取1∶4新鲜兔血浆0.5mL，放入小试管中，再加入培养24h的金黄色葡萄球菌肉浸液肉汤培养物0.5mL，振荡摇匀，放36±1℃温箱内，每半小时观察一次，观察6h，如呈现凝固，即将试管倾斜或倒置时，呈现凝块者，被认为阳性结果。

同时以已知阳性和阴性葡萄球菌株及肉汤作为对照。

3.直接计数方法1)吸取上述1：10混悬液，进行5倍递次稀释，根据样品污染情况，选择不同浓度的稀释液1mL，分别加入三块Baird－Parker平板，每个平板接种量分别为0.3mL、0.3mL、0.4mL，然后用灭菌L棒涂布整个平板。

如水分不多吸收，可将平板放在36±1℃温箱1h，等水分蒸发后反转平皿置36±1℃温箱培养。

2)在三个平板上点数周围有混浊带的黑色菌落，并从中任选1个菌落，接种血琼脂平板，36±1℃24h培养后进行染色镜检、血浆凝固酶试验，步骤同增菌培养法。

3)菌落计数：将三个平板中疑似金黄色葡萄球菌黑色菌落数相加，乘以血浆凝固酶阳性数，除以5，再乘以稀释倍数，即可求出每克样品中金黄色葡萄球菌数。

六、实验报告1．鉴别牛奶中是否含有金黄色葡萄球菌。

2．对牛奶中含有的金黄色葡萄球菌进行计数。

5※<实验二>实验二食品中沙门氏菌的检验一、实验目的学习食品中沙门氏菌的基本检测方法。

二、基本原理沙门氏菌为肠杆菌科沙门氏菌属细菌，广泛分布于自然界，是人畜共患的肠道病原菌，常引起伤寒、肠炎、肠热症和食物中毒，危害人类健康。

沙门氏菌可通过人类、畜、禽的粪便或带菌者直接或间接污染药品，生产环境及生产的各个环节，特别是以动物、脏器为原料的食品污染机率较高。

受到污染的食品，不仅直接影响食用者的安全，并可造成沙门氏菌的传播和流行。

故对某些食品必须检查沙门氏菌。

食品中污染的沙门氏菌常在生产过程中受到损伤而处于濒死状态，故检验时须先在无选择性的增菌液中使其复苏，然后再进行选择性增菌。

沙门氏菌在各种选择性培养基上的菌落形态不同，这可以作为辨别沙门氏菌的一个简单方法，在实际工作中，我们还要配合生化实验以及血清学实验来作准确的鉴定。

三、设备和材料实验器材：恒温培养箱（37℃、42℃）、显微镜、广口瓶（500mL）、移液管（10mL）、锥形瓶（250mL）、培养皿、酒精灯、试管架、试管篓、灭菌锅实验材料：污染牛奶等、沙门氏菌株四、培养基和试剂缓冲蛋白胨水、氯化镁孔雀绿增菌液、亚硒酸盐胱氨酸增菌液、亚硫酸铋琼脂、DHL琼脂、HE琼脂、WS琼脂、SS琼脂五、操作步骤1.前增菌和增菌：吸取检样25mL，加在装有225mL缓冲蛋白胨水的500mL广口瓶内，于37℃培养4h，移取10mL，转种于100mL氯化镁孔雀绿增菌液内，于42℃培养18～24h。

同时，另取10mL，转种于100mL亚硒酸盐胱氨酸增菌液内，于37℃培养18～24h。

2.分离取增菌液1环，划线接种于一个亚硫酸铋琼脂平板和一个DHL琼脂平板、HE琼脂平板、WS和SS琼脂平板。

两种增菌液可同时划线接种在同一个平板上。

于36±1℃分别培养18～24h(亚硫酸铋琼脂、DHL、HE、WS、SS) 或40～48h(BS)，观察各个平板上生长的菌落，沙门氏菌Ⅰ、Ⅱ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ和沙门氏菌Ⅲ在各个平板上的菌落特征见表1。

表1 沙门氏菌属各群在各种选择性琼脂平板上的菌落特征六、实验报告1.辨别牛奶污染菌株是否为沙门氏菌株。

2.辨别污染牛奶的沙门氏菌株的属群。

5※<实验三>实验三酶联免疫吸附试验（间接ELISA）一、目的要求1.了解ELISA的基本原理，及其优缺点。

2.掌握间接ELISA法的试验操作过程。

二、基本原理酶联免疫吸附试验（enzyme-linked immunosorbent assay，简称ELISA）是免疫酶技术的一种，是将抗原抗体反应的特异性与酶反应的敏感性相结合而建立的一种新技术。

ELISA的技术原理是：将酶分子与抗体（或抗原）结合，形成稳定的酶标抗体（或抗原）与固相载体上的相应抗原（或抗体）结合时，即可在底物溶液参与下，产生肉眼可见的颜色反应，颜色的深浅与抗原或抗体的量成比例关系，使用ELISA检测仪，即酶标测定仪，测定其吸收值可做出定量分析。

此技术具特异、敏感、结果半段客观，简便和安全等优点，日益受到重视，不仅在微生物学中应用广，而且也被其他学科领域广为采用。

ELISA类型繁多，国内已有市售，可根据需要选用，按说明书操作。

三、器材1.血清兔阴性血清2.溶液或试剂⑴包被液（0.05mol/l,Ph9.6的碳酸盐缓冲液）：NaCO3 1.59g, NaHCO3 2.93g,加去离子水定容至1000mL（加入0.5%的甲醛，4℃可保存约2周），现配现用。

⑵PBST洗涤剂（吐温-磷酸盐缓冲液pH7.4）：NaCl 8g ，KH2PO40.2g ，Na2HPO4·12H2O 2.9g，KCl 0.2g，吐温-20 0.5mL，蒸馏水加至100mLl。

⑶磷酸盐-柠檬酸缓冲液（pH5.0）：分别取甲液24.3mL，乙液25.7mL，加去离子水定容至100mLl。

甲液（0.01mol/l的柠檬酸C6H8O7·H2O）：称取C6H8O7·H2O19.2g，加去离子水定容至1000mL。

乙液（0.2mol/l的磷酸氢二钠Na2HPO4·12H2O）：称取Na2HPO4·12H2O 71.7g，加去离子水定容至1000mLl。

⑷底物溶液：40mg邻苯二胺溶于1000mL pH5.0的磷酸盐-柠檬酸缓冲液，临用前加入150μLl 30%的H2O2,现配现用。

⑸终止液2mol/L H2SO4：吸取10.66mL的98%浓H2SO4（密度为1.84g/mL），加去离子水定容至100mL。

⑹酶标二抗（山羊抗兔Ig-HRP）稀释液：分别吸取10mL小牛血清和50μL的Tween-20，加上述PBS缓冲液定容至100mL。

3.仪器或其他用具聚苯乙烯微量反应板，酶标仪，吸管，橡皮吸头等，紫外分光光度计，20μL、100μL、500μL移液枪各一只，ELISA试剂盒。

四．操作步骤1.包被抗原用100μL移液枪吸取用包被液稀释好的金黄色葡萄球菌抗原，沿孔壁准确滴加100μL至每个塑料板孔中，防止气泡产生，置37℃过夜。

2.洗板倒出包被液，用另一根习惯吸取洗涤液，加入板孔中，洗涤液量以加满但不溢出板孔为宜。

均匀振荡3min ，甩出洗涤液。

再加洗涤液，重复上述操作三次，扣干。

3.加血清用三根套有橡皮吸头的0.2mLl吸管，小心吸取稀释好的血清（待检、阳性、阴性血清），准确加100μL于对应板孔中，第4孔中加100μL的PBST洗涤液，37℃放置10min，在水池边甩出血清，洗板三次（方法同2）。

注意：切忌溢出互混！4.加酶标抗体用吸管沿孔壁上部小心准确加入100μL酶标抗体（不能让血清玷污吸管），37℃放置10min，同上倒空，洗涤三次。

5.加底物按比例加H2O2于配制的底物溶液中，立即用吸管吸取此种溶液，分别加于板孔中，每孔0.1mL。

置37℃，显色5～15min（经常观察），待对照有明显颜色后，立即加一滴2mol/L H2SO4终止反应。

6.判断结果肉眼观察（白色背景），阳性对照孔应明显黄色，阴性孔应无色或微黄色，待测孔颜色深于阳性对照孔则为阳性；酶标仪测定，酶标仪测定波长取λ=492nm（适用于底物为OPD），P/N≥2.1时阳性，P/N≤1.5阴性，2.1≥P/N≥1.5可疑阳性，应予复查。