天麻丸新版药典微生物检验方法探究
药品微生物限度与无菌检查方法验证实验的要点及体会
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中国药品生物制品检定所
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表2中上市抽验样品（液体制剂）的最少检验量
供试品装量V (ml)
≤1 1<V<5 5 ≤ V<20 20 ≤V<50 50 ≤V<100 50 ≤V<100(静脉给药) 100 ≤V ≤ 500 V>500 * 每种培养基各接种10支供试品
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为什么验证?
• 1）、采用经过验证的方法，是分析测量科学的基本 要求，是各种法规遵循工作的基础。药品微生物检 查作为整个药品质量体系中的一个环节，应与其他 检验项目一样，对方法和条件进行考察，以保证结 果的科学性，如鉴别、含量测定。 • 2）、验证的思想其实早已贯彻于微生物检测的诸多 方面：无菌环境验证（尘埃离子、浮游菌、沉降菌 检测）、灭菌器的验证、培养基灵敏度检测、阴性 对照、阳性对照等等。
• 验证实际上伴随着整个实验过程，实验过程中的每一 个环节均应有合理的证明（验证），保证其对结果判 断没有影响。 • 前处理方法直接影响后续步骤的效果和重现性，应在 验证范围内。已有标准规程（SOP）和充足实验证明的 前处理方法可以直接采用，但出现疑问应进一步研究 提高。 • 供试品中抗菌活性的去除是当前验证工作的重点。尤 其强调应充分验证供试品本身对微生物生长的影响。
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药物名称 抗栓再造丸 更年安胶囊 清热安宫丸 通宣理肺丸 肝德志胶囊 宁心安神胶囊 防癌胶囊 肠胃舒胶囊 骨络通酒
生产企业 辽宁华鑫药业有限公司 福州金象中药药业有限公司 江西国药药业有限公司 广东阳江制药厂 四川省通阳制药厂 广西南宁万士达制药厂 北京北卫药业有限公司 北京北卫药业有限公司 北京北卫药业有限公司
最新版中国药典微生物限度检查方法验证方案
最新版中国药典微生物限度检查方法验证方案人工牛黄甲硝唑胶囊微生物限度检查方法验证方案起草部门：QC 组签名：日期：审核部门：QC组签名：日期：部门：质量部签名：日期：批准质量负责人签名：日期：质量部颁发本文件根据需要应分发于以下部门：01 质量部下表用于记录修订/变更主要内容及历史。
文件编号修订原因修订日期TS-VP-4201-00 按GMP（2010年修订版）要求新制定2015.10.22目录1. 概述2. 验证目的和范围3. 组织及职责4. 验证进度计划表5. 验证所需要的仪器设备及相关文件的确认6. 验证所需要的菌种、培养基、检验样品的确认7.验证项目和验证方法7.1试验菌株7.2需氧菌总数检查、霉菌和酵母菌总数检查方法验证的菌液制备7.3需氧菌总数检查、霉菌和酵母菌总数检查方法验证--常规倾注平皿法7.4需氧菌总数检查方法验证—离心沉淀-薄膜过滤法7.5控制菌检查方法验证—离心沉淀-薄膜过滤法8.偏差与漏项控制9.验证报告会审1. 概述我公司生产品种人工牛黄甲硝唑胶囊，产品微生物限度检查项目为需氧菌总数、霉菌和酵母菌总数、以及大肠埃希菌检查和沙门菌检查。
参照《中国药典》2015版四部附录1105：微生物计数法，以及1106：控制菌检查法的规定，本公司对该产品的微生物限度检查方法予以验证。
通过验证以确认所采用的微生物限度检查方法适用。
人工牛黄甲硝唑胶囊处方中含有甲硝唑、人工牛黄以及常用辅料成分，文献资料介绍甲硝唑对细菌有抑菌特性，对霉菌和酵母菌无抑菌活性。
甲硝唑在水中微溶，可以通过离心沉淀-薄膜过滤法去除其对微生物生长的影响。
本验证方案通过试验菌株的回收率测试，首先确认常规倾注平皿法是否适用于本品的微生物限度检查；如常规倾注平皿法不适用，则进一步验证可去除供试品抑菌物质的离心沉淀-薄膜过滤法是否适用于本品的微生物限度检查。
本验证方案根据样品特性制定微生物限度检查方法和检验条件，按制定的方法进行试验，根据验证结果判断是否符合验证标准。
中国药典2005年版一部附录 丸剂 微生物
我国药典2005年版一部附录丸剂微生物一、微生物限度1.1 总生菌数总生菌数是指指丸剂中细菌和真菌的总数，其测定方法是按照《中华人民共和国药典》中的规定进行。
在浸提液中每克细菌数不得超过10^4CFU，霉菌数不得超过10^3CFU。
1.2 大肠杆菌大肠杆菌是一种肠道致病菌，它的存在会对丸剂的质量和安全造成严重威胁。
大肠杆菌的检测在微生物限度中是非常重要的。
根据《中华人民共和国药典》中的规定，每克丸剂中大肠杆菌数不得超过10^2CFU。
1.3 金黄色葡萄球菌金黄色葡萄球菌是一种常见的皮肤和黏膜致病菌，其存在可能会对患者造成感染。
根据《中华人民共和国药典》中的规定，每克丸剂中金黄色葡萄球菌数不得超过10^2CFU。
1.4 霉菌和酵母菌霉菌和酵母菌是丸剂中常见的真菌，其存在可能会导致产品变质和感染。
根据《中华人民共和国药典》中的规定，每克丸剂中霉菌和酵母菌数不得超过10^2CFU。
二、微生物检验方法2.1 培养基法培养基法是目前微生物检验中常用的方法之一，其主要原理是将样品悬浮在适当的培养基上，利用培养基中的营养成分和湿度来促进细菌和真菌的生长。
通过观察培养基上的菌落数量和形态来测定样品中的微生物含量。
2.2 膜过滤法膜过滤法是一种通过将样品通过特殊的膜过滤器，将微生物过滤到膜上，并通过培养基来检测微生物数量的方法。
这种方法具有操作简单、灵敏度高的特点，适用于对微生物含量要求比较严格的丸剂品种。
2.3 PCR法PCR法是一种分子生物学方法，通过扩增微生物基因来检测微生物的存在和数量。
这种方法的优点是可以对微生物进行快速检测，并且对微生物的特异性比较高。
三、微生物限度的重要性微生物限度是丸剂生产过程中非常重要的一环，它直接关系到丸剂的质量和安全。
合格的微生物限度可以保证丸剂的质量和安全性，防止因微生物污染导致的药品感染和变质。
在丸剂的生产过程中，要严格按照相关标准进行微生物限度的检测，确保产品的质量和安全。
药品微生物限度与无菌检查方法验证实验的要点及体会
为什么验证？
• 5）、验证的必要性（质量控制的新手段）：
不同企业以及同企业不同批次黄连上清丸稀释法 的回收率比较试验结果，可能反映了不同黄连上 清丸样品的质量差异。
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表5 七企业黄连上清丸稀释法的回收率比较实验结果 Tab 1 Recovery of dilute method in microbiological test of huanglianshangqingwan from 7 corporations
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药物名称 抗栓再造丸 更年安胶囊 清热安宫丸 通宣理肺丸 肝德志胶囊 宁心安神胶囊 防癌胶囊 肠胃舒胶囊 法 中和法 离心法
验证
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供试品中抗菌活性的去除
• 稀释法——降低供试品的相对浓度 • 薄膜法——利用体积差异分离 • 中和法——利用化学（生物）专属性灭 活 • 离心法——利用沉降系数差异分离
各方法组合运用，效果更佳！
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抗菌活性去除效果的检验
• 应根据供试品的特点，选择敏感菌株，对 供试品抗菌活性去除效果加以检验（阳性 菌的回收实验），再按药典要求全面验证， 提高效率。
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选择敏感菌株
间接方法——文献、技术资料（可靠） 直接方法——预实验（体外抑菌实验） 参考选择： 一般中药选择枯草和金葡； 一般抗生素根据抗菌谱选择。
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表6 同厂不同批黄连上清丸稀释法的回收率比较实验结果（1：200） Tab 2 recoverice of dilute method in microbiological test of huanglianshangqingwan from different batchs in same corporation (1:200)
高效液相色谱法测定半夏天麻丸中天麻的含量
·药学研究·高效液相色谱法测定半夏天麻丸中天麻的含量乔楚杨雪松高旋半夏天麻丸由法半夏、天麻、黄芪白术（麸炒）、茯苓、陈皮、黄柏、（蜜炙）、人参、苍术（米泔炙）、泽泻、六神曲（麸炒）、麦芽（炒）等中药组方而成，具有健脾祛湿、化痰息风的作用［1］，用于脾虚聚湿生痰和眩晕头痛临床效果显著［2，3］。
天麻有平肝潜阳、息风止痉等功效，可治风痰眩晕、痰厥头痛，在方中与半夏共为君药，主要成分为天麻素［4］。
2015版《中国药典》中规定了半夏天麻丸中橙皮苷（陈皮的有效成分）的含量测定方法和质控限值，而对与疗效相关的天麻药材未规定质量控制方法。
为了更好的控制半夏天麻丸质量，结合文献［5⁃10］方法，建立高效液相色谱法测定半夏天麻丸中的天麻素，并依据测定结果和文献经验，提出天麻素的质控限值。
经方法学验证，本法简便快速、准确度高、无阴性干扰，为提高半夏天麻丸质量标准提供依据。
员仪器与试药1.1仪器Agilent1200高效液相色谱仪（美国安捷伦公司）；超声波清洗器（KQ-500DE型，昆山市超声仪器有限公司）；电子分析天平（AL204型，梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司）；Diamonsil C18（250mm×4.6mm，5μm）色谱柱。
1.2试药天麻素标准品（中国食品药品检定研究院，批号110807）；半夏天麻丸（太极集团四川绵阳制药有限公司，批号180403、180705、180906）；法半夏、黄芪白术（麸炒）、茯苓、陈皮、黄柏、（蜜炙）、人参、苍术（米泔炙）、泽泻、六神曲（麸炒）、麦芽（炒）购自北京同仁堂（亳州）饮片有限责任公司，部分药材炮制再加工。
甲醇和乙腈［色谱纯，赛默飞世尔科技（中国）有限公司］；水为自制二次蒸馏水，其他试剂为分析纯。
1.3方法1.3.1色谱条件：以Diamonsil C18（250mm×4.6mm，5μm）色谱柱分离，乙腈-0.01%KH2PO4（1∶99）为流动相，流速为1.0 mL/min进行等度洗脱，设置柱温为40℃，在检测波长220 nm处检测天麻素的含量。
药品微生物限度检查方法验证步骤及示教
药品微生物限度检查方法验证一般步骤1.样品及确定验证项目样品要求：不含菌或少量菌验证项目：根据药品用药途径、处方、制法确定。
细菌、霉菌及酵母菌计数验证（一般必作）；控制菌检查如为中药制剂必须查标准，根据用药途径、处方、制法确定控制菌检查项目。
特殊的如滴眼剂、用于烧伤、严重创伤等应根据制剂通则项下要求及微生物限度标准来确定。
2. 确定供试液制备方法3. 方法选择预试验（1）目的：确定样品对试验菌有无抑菌活性及计数验证各试验菌的回收试验方法。
（2）查资料，根据样品的功能、主治及所含成分等确定方法选择预试验方案。
（3）根据预试验结果确定各试验菌计数验证方法控制菌验证方法4. 验证试验：选择3个批号样品进行3次独立实验，证明方法的有效性；5. 据验证结果优化试验条件，建立微生物限度检查方法SOP。
6. 写出验证资料。
示教内容11.5.上午：菌液制备方法：一. 新鲜浓菌液制备（要求学员练习操作的内容）新鲜浓菌液接种：细菌大肠埃希菌[CMCC（B）44102]金黄色葡萄球菌[CMCC（B）26003]枯草芽孢杆菌[CMCC（B）63501]生孢梭菌[CMCC（B）64941]（厌氧梭菌）铜绿假单胞菌[CMCC（B）10104]培养基：营养肉汤3-5ml、硫乙醇酸盐流体培养基3-5ml接种及培养：1.分别取各试验菌半个--1个菌落分别接种营养肉汤（充分研匀、摇匀），36±1℃培养16-18小时。
2.生孢梭菌新鲜培养物取0.1ml接种硫乙醇酸盐流体培养基（临用前排氧）36±1℃培养18-24小时。
霉菌及酵母菌白色念珠菌[CMCC（F）98001]、黑曲霉[CMCC（F）98003]培养基：改良马丁培养基3-5ml；改良马丁琼脂培养基斜面1.取白色念珠菌的菌落接种改良马丁培养基23-28℃培养24小时（可用36±1℃培养18-24）。
2.黑曲霉孢子悬液的制备：沾取黑曲霉孢子接种改良马丁琼脂培养（红字为示教内容基，培养5-7天待培养物黑色孢子生长（全部变黑，已制备好斜面培养物示教）加入5-10ml0.9%氯化钠溶液，小心振挡洗脱表面的黑色孢子1-2次，吸出洗脱液（注意不要触到菌丝体）即为孢子悬液。
天麻检验方法确认方案.
天麻检验方法确认方案编号：SMP·AV-YF-003亳州市永刚饮片厂有限公司确认方案审批表验证项目名称：天麻检验方法确认方案编号：SMP·AV-YF-003起草人：日期：年月日审核审核部门审核人日期备注QC主管QA主管批准人：日期：年月日执行日期：年月日目录1概述 (4)3适用范围 (4)4确认小组人员及职责 (4)5验证相关文件依据 (4)6验证时间安排 (4)7验证前确认 (5)8验证内容 (5)9验证过程中的偏差及处理措施 (7)10再确认周期 (7)11.确认结果评定与结论 (7)1概述天麻检验质量标准收载在《中国药典》2015版一部P58,根据GMP（2010版）第二百二十三条规定，对收入药典和其它法定标准的分析方法，应通过检验方法确认来证明该方法在本实验室条件下的适用性。
故制定本检验方法确认方案，由化验室按制定的方法进行试验，根据试验结果判断检验方法在本公司是否适用。
2目的确认该产品的检验方法在本公司检验室的适用性，保证检验结果的可靠性。
3适用范围本方案适用于本公司天麻的鉴别、检查、含量测定。
4确认小组人员及职责4.1确认小组验证分工所在部门职务组长质量部经理组员质量部QC主管组员质量部QC组员质量部QA主管4.2验证小组职责组长：负责验证管理的日常工作和验证的协调，验证方案和报告的批准。
组员：QC，化验室。
起草验证方案和验证报告，并参与实施验证。
组员：QC主管，化验室。
审核验证方案和报告，协调与本次验证相关的化验室工作。
组员：QA主管，质量保证部。
负责审核验证方案和验证报告，如果验证中出现偏差，应对偏差进行调查。
5验证相关文件依据参考文献药品生产质量管理规范（2010年版）药品生产质量管理规范实施指南中国药典2015年版6验证时间安排计划于年月日-年月日对天麻进行检验方法的确认。
7验证前确认为了保证验证的顺利实施，需要对相关的条件进行确认，使产品的生产全过程符合GMP的要求。
版中国药典微生物限度检查方法验证方案
人工牛黄甲硝唑胶囊微生物限度检查方法验证方案目录1. 概述2. 验证目的和范围3. 组织及职责4. 验证进度计划表5. 验证所需要的仪器设备及相关文件的确认6. 验证所需要的菌种、培养基、检验样品的确认7. 验证项目和验证方法试验菌株需氧菌总数检查、霉菌和酵母菌总数检查方法验证的菌液制备需氧菌总数检查、霉菌和酵母菌总数检查方法验证--常规倾注平皿法需氧菌总数检查方法验证一离心沉淀-薄膜过滤法控制菌检查方法验证一离心沉淀-薄膜过滤法8. 偏差与漏项控制9. 验证报告会审1. 概述我公司生产品种人工牛黄甲硝唑胶囊，产品微生物限度检查项目为需氧菌总数、霉菌和酵母菌总数、以及大肠埃希菌检查和沙门菌检查。
参照《中国药典》2015版四部附录1105:微生物计数法，以及1106：控制菌检查法的规定，本公司对该产品的微生物限度检查方法予以验证。
通过验证以确认所采用的微生物限度检查方法适用。
人工牛黄甲硝唑胶囊处方中含有甲硝唑、人工牛黄以及常用辅料成分，文献资料介绍甲硝唑对细菌有抑菌特性，对霉菌和酵母菌无抑菌活性。
甲硝唑在水中微溶，可以通过离心沉淀-薄膜过滤法去除其对微生物生长的影响。
本验证方案通过试验菌株的回收率测试，首先确认常规倾注平皿法是否适用于本品的微生物限度检查；如常规倾注平皿法不适用，则进一步验证可去除供试品抑菌物质的离心沉淀-薄膜过滤法是否适用于本品的微生物限度检查。
本验证方案根据样品特性制定微生物限度检查方法和检验条件，按制定的方法进行试验，根据验证结果判断是否符合验证标准。
2. 验证目的和范围验证该产品的微生物限度检查方法的适用性，对其有效性进行评价，保证检验结果的可靠性。
本验证方案采用3批按GMF要求组织生产的人工牛黄甲硝唑胶囊，进行微生物限度检查方法的验证。
3. 组织及职责验证方案和验证报告的起草、审核、批准验证方案由质量部QC组负责起草，由质量部审核，最终由质量负责人批准。
验证方案实施完成后，由QC组负责汇总微生物限度检查法验证的结果、撰写报告，由质量部审核，最终由质量负责人批准报告。
药品微生物检验及方法验证
药品微生物限度检查及方法验证从事药品微生物限度检查工作两年时间，从学做到承担工作到变得有点经验，经历了一个摸索、学习和积累的过程，回过头来做一个总结，把一些零散的经验和体会做一个梳理和归整，以供在此岗位工作的同仁参考。
第一部分：外围工作外围工作主要有器皿清洗、灭菌，培养基、试剂配制及灭菌，无菌室清洁消毒等。
器皿的清洗是每个实验室和每一个实验员必须要做的最起码的工作，工作要求简单，操作方便，把握一个原则：干净。
培养基、试剂配制后一般都要求调PH到7.20，因为高温灭菌之后PH值会下降0.2左右。
固体培养基在灭菌前要先加热煮沸，使琼脂均匀分散。
煮沸时要注意不要溢出容器，以免发生烫伤。
万一不小心溢出，可用一湿抹布盖住容器口，迅速将其从加热源上移开，不要在情急之下徒手去拿或者在容器侧面拿，那样容易被从容器口源源不断溢出的培养基烫伤。
液体物品灭菌后，不能立即打开放气阀放气，因为此时被灭菌物品的温度大于100℃，在压力等于常压时，液体会暴沸，造成液体喷出或容器炸裂，发生事故。
万级洁净度的无菌室应当每周进行一次消毒，消毒剂每月更换一次，防止长期使用同一种消毒剂而使微生物形成耐药性。
消毒范围包括墙壁，地面，天花板以及空气。
表面消毒可以用消毒剂擦拭，尤其注意门框边缘以及出风回风口，不能留有死角；空气消毒宜采用臭氧或者紫外灯。
可以使用专门的臭氧发生器产生臭氧进行消毒，也可以在每一个操作间包括净化台安装适宜功率的紫外灯，一方面紫外线可以对近距离的物体表面进行消毒，另一方面紫外线的作用也可以使空气中的氧气转换成臭氧，从而能够杀死空气中的微生物。
另外在每次做完实验之后，都应当对实验台面以及地面进行消毒处理。
第二部分：检验过程整个无菌室的检验操作过程应当有一个标准的操作规范，严格按照无菌操作的规定进行操作，包括进入无菌室的程序以及人员清洁消毒，都应当遵守标准来进行。
首先，进入无菌室应当严格按照洁净区（室）有关规定进行。
进入之前先进行洗手消毒，在一更换鞋，脱去外衣，进入二更，穿洁净工作服，注意穿戴洁净工作衣帽时必须做到衣服的任何部位不得拖地。
中国药典2019年版无菌、微生物限度及细菌内毒素检查方法学验证内容简介
菌名
分类
芽孢
对氧需求
铜绿假单胞菌 革兰氏阴性杆菌
无芽孢 需氧
枯草芽孢杆菌 革兰氏阳性杆菌
有芽孢 需氧
金黄色葡萄球菌 革兰氏阳性球菌
无芽孢 需氧
大肠埃希菌
革兰氏阴性短杆菌 无芽孢 需氧
生孢梭菌
梭菌
有芽孢 厌氧
2019年8月
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菌种的要求： 传代次数不得超过5代（从菌种保存中心获得的 冷冻干燥菌种为第0代），并采用适宜的菌种保 藏技术，以保证试验菌株的生物学特性。
2019年8月
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接种黑曲霉的新鲜培养物至改良马丁琼脂斜 面培养基上，23~28℃培养5～7天，加入3～ 5ml0.9％无菌氯化钠溶液，将孢子洗脱，然 后，吸出孢子悬液(用管口带有薄的无菌棉 花或纱布能过滤菌丝的无菌毛细吸管)至无 菌试管内，用0.9％无菌氧化钠溶液制成每 lml含孢子数小于100cfu的孢子悬液。
2019年8月
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无菌检查验证用菌株：
金黄色葡萄萄球菌 (Staphylococcus aureus) [CMCC(B) 26 003]
铜绿假单胞菌 (Pseudomonas aeruginosa) [CMCC(B) 10 104] **拟修订为大肠埃希菌
枯草芽孢杆菌 (Bacillus subtilis) [CMCC(B) 63 501]
2019年8月
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举例说明上市抽验样品无菌检查方法学验证检验量（液 体制剂）
≤1ml
每个菌10支,共60支（全取样）
1＜V＜5 共30（取样量为半量）
5≤V＜20 建议30（取样量为2ml，建议全部过滤）
20≤V＜50 建议30（取样量为5ml，建议全部过滤）
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天麻丸新版药典微生物检验方法探究
作者：赵业辉 丁小玲
来源：《科学与财富》2019年第07期
摘 ;要：目的主要是在结合实际的基础上促使天麻丸的微生物限度检查方法得以顺利建
立。方法将中国药典2015年版四部非无菌产品微生物限度检查方法作为主要依据，促使方法
适用性试验得以顺利开展。结果其中两个企业在实际检查过程中使用的方法为常规检查，其余
两个企业主要是借助稀释法进行检查工作。结论在消除产品抑菌成分对微生物检验的影响方面
稀释法起着不可替代的重要作用。
关键词：微生物限度检查;天麻丸;中国药典
天麻丸在中成药品种涵盖范围之内，其中包含10味中药材，主要涉及到天麻、羌活、独
活、地黄等，在此基础上进行加工可实现对成水蜜丸，小蜜丸和大蜜丸的有效炼制，现阶段市
场内一般销售的品种为水蜜丸以及大蜜丸。加入适当的生药原粉是中成药丸剂的主要生产工
艺，这也是药品安全高度重视，微生物的负载和污染菌的状况的主要原因。最新版中国药典与
传统药典相比有相当大的变化，在实际试验过程注意对其进行科学借鉴。
一、仪器、材料与样品
1.仪器
Thermo1378生物安全柜;InterScienceS500自动菌落计数器;ThermoIGS180培养
箱;SanyoMIR254生化培养箱;TomySX-700高压灭菌器。
2.培养基
大豆酪蛋白胨琼脂培养基，大豆酪蛋白胨液体培养基，沙氏葡萄糖琼脂培养基，肠道菌增
菌液体培养基，麦康凯肉汤培养基等都可在这一试验中进行使用，注意结合实际与试验要求也
可科学选择，麦康凯琼脂培养基，紫红胆盐葡萄糖琼脂，RV沙门菌增菌肉汤培养基，木糖赖
氨酸脱氧胆酸盐琼脂，三糖铁琼脂等培养基。
需要注意的是上述培养基的提供单位都为广东环凯微生物科技有限公司生产。北京三药科
技开发公司所提供的培养基为沙氏葡萄糖液体培养基，4-甲基伞形酮葡糖苷酸培养基。在实际
使用之前我们必须针对培养基进行严格的适用性检查，检查结果符合相关标准与要求的才可以
真正投入使用。
3.菌种
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金黄色葡萄球菌（S.aureus）[CMCC（B）26003]、铜绿假单胞菌（P.aeruginosa）[CMCC
（B）10104]、枯草芽孢杆菌（B.subtilis）[CMCC（B）63501]大肠埃希菌（E.coli）[CMCC
（B）44102]白色念珠菌（C.albicans）[CMCC（F）98001]、黑曲霉（A.niger）[CMCC（F）
98003]、乙型副伤寒沙门菌（S.paratyphiB）[CMCC（B）50094]均来自中国食品药品检定研究
院医学菌种保藏中心，试验菌为第3代菌株。
二、方法与结果
1.菌液制备
大豆酪蛋白胨液体培养基主要接种对象为金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、大肠埃希菌、
乙型副伤寒沙门菌，注意将温度控制在30-35℃范围之间，培养时间为18-24h。沙氏葡萄糖液
体培养基接种对象为白色念珠菌接种，需要在20-25℃的范围之内培养2-3d。
黑曲霉主要是在沙氏葡萄糖琼脂培养基中进行接种，其温度也需要控制在20-25℃之间，
但其培养时间较长，需要5-7d。在实际针对孢子进行洗脱工作的过程当中我们需要借助0.05%
的聚山梨酯80的0.9%无菌氯化钠溶液。最后将上述菌株制成菌液备用，注意起级别为稀释
级，这一过程中所使用的溶液为0.9%无菌氯化钠溶液。
2.实验方法
（1）微生物计数方法适用性试验-平皿法
取供试品10g，加大豆酪蛋白胨液体培养基至100mL，匀浆，静置约5min，取上层液体
即为1∶10供试液，取1mL注皿，分别倾注大豆酪蛋白胨琼脂培养基及沙氏葡萄糖琼脂培养
基，作为供试品对照组。
另取铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、白色念珠菌、黑曲霉菌液0.1mL加
至9.9mL上述供试液，混匀，使每毫升混合液含菌量不大于100cfu，取上述混合液1mL注入
平皿，倾注大豆酪蛋白胨琼脂培养基，每个菌株分别制备2个平板，取白色念珠菌、黑曲霉菌
液0.1mL加至9.9mL上述供试液，混匀，使每毫升混合液含菌量不大于100。
（2）微生物计数方法适用性试验———稀释法
制作供试品对照组及菌液组，培养，计数，计算回收比值。2.2.3控制菌检查方法适用性
试验耐胆盐革兰阴性菌检查：按照“2.2.1”方法制备1∶10供试液，置20～25℃培养约2h，取
相当于供试品0.1、0.01、0.001g的预培养物分别加至10mL的肠道菌增菌液体培养基中，一式
2份，其中1份3管每管中加入不大于100cfu的大肠埃希菌，另1份3管每管中加入不大于
100cfu的铜绿假单胞菌，按照药典规定方法培养后，每管分别划线接种到紫红胆盐葡萄糖琼脂
平板上，培养后观察结果。
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三、讨论
考察了4个厂家5个品种的天麻丸的微生物限度检查方法，虽然都是按照中国药典2015
年版的处方进行生产，但其产品对微生物的检出有不同程度的干扰现象，部分产品应采用稀释
法进行检查，才能顺利检出样品中可能污染的微生物，究其原因，可能与原药材产地、炮制方
法、不同辅料对微生物生长环境的影响、还有生产工艺有一定的关系。
说明同一品种不同企业生产的产品不能死搬硬套同一种微生物限度检查法，而应该经过方
法适用性确定其可行性;企业生产的同一个品种，在原药材产地、批次、炮制方法以及生产工
艺发生改变的时候，也应该进行方法确认其检查方法的可行性;药检所对抽验药品进行检验
时，遇到不同企业的产品，在条件许可的情况下，也应尽可能获取相应的检验方法资料。
关于稀释法的操作，本试验中菌落计数方法采用了取1∶50供试液1mL注皿的稀释法
（最后5皿合并计数），与采用中国药典2010年版收载的培养基稀释法（取1∶10供试液
1mL分注5皿，每皿0.2mL），在每皿中的供试液浓度是一样的，但在方法适用性试验加菌的
操作中，提前加到稀释液中，制成的最终浓度供试液就和菌液混合，更实际模拟检验过程中微
生物的生长环境特性，而后者是在倾注培养基的时候供试液才与菌液混合，使抑菌成分对微生
物的作用可能被培养基部分稀释掩盖了，过程试验对抑菌成分的模拟效果有一定的试验偏差。
结语
新版药典与以往版本的药典相比，计数方法限度采用了指数方式来表示，引入了可接受的
最大菌数的概念，针对微生物试验的特性，用数理统计的方法，从给药途径、药品特性、使用
方法方面对药品进行风险评估，提高用药的安全性保障。
参考文献
[1]管中玉，赵吉平，马则秀.HPLC法测定天麻丸中天麻素的含量[J].湖南中医杂志，
2010，26（4）：121-122.
[2]张金恒.天麻素定量方法概况[J].山西医药杂志（下半月刊），2012，41（1）：20-21.