免疫扩散试验
免疫学实验 对流免疫电泳 (2)
电泳
将加好样品的板置于电泳槽上，抗原孔置 负极端，抗体孔置正极端。琼脂板两端分 别用四层纱布与0.05mol/L、PH8.6的缓 冲液相连，接通电源。电流以玻片的宽度 计算，为4mA/cm；电压以玻片的长度计 算，为6V/cm；通电30-60min后，切断 电源，观察结果
结果和讨论
将玻片对着光，先观察AFP阳性血清孔与 抗体孔之间的白色沉淀线，然后再观察待 检血清孔与抗体孔之间是否也有沉淀线出 现，如有沉淀线，则表示AFP试验阳性， 否则AFP试验为阴性。如沉淀线不清晰， 可把琼脂板放在湿盒中37℃数小时或置电 泳槽过夜再观察。
免疫电泳技术
免疫电泳技术
是将电泳与免疫扩散相结合的一种常 用的免疫学实验方法 。
沉淀反应
是可溶性抗原与相应抗体在适当 条件下发生特异性结合所出现的沉 淀现象。
分类
絮状沉淀试验 液体内沉淀试验 环状沉淀试验
沉
免疫浊度测定
淀
ห้องสมุดไป่ตู้
反 应
单向琼脂扩散试验 免疫扩散
双向琼脂扩散试验
凝胶内沉淀试验
免疫电泳
火箭免疫电泳 对流免疫电泳
注意事项
1. 电泳时电流不宜过大，以免蛋白质变性。
2. 抗原、抗体的电极方向不能放反。
3. 电泳所需时间与孔间距离有关，距离越大，电泳 时间越长。
4.抗原抗体浓度的比例：当抗原抗体比例不适合时， 均不能出现明显可见的沉淀线。抗原太浓太稀时 都不易出现沉淀线。所以除了应用高效价的血清 外，每份待测样品均可做几个不同的稀释度来进 行检查。
思考题
抗原、抗体的电极反向放反了，会出现什 么结果？？
为什么对流免疫电泳试验的敏感性要比双 向扩散高8-10倍？
在电泳过程中，可见抗原抗体孔均出现色 带泳向阳极，为什么？
第二单元 免疫沉淀类实验汇总
北华大学
王雪松
实验二 单向免疫扩散试验
实验原理
将一定量的羊抗人 IgG 抗血清成分混合于琼脂凝胶 中，制成含有特异性羊抗人IgG抗血清的琼脂板，待凝 固后打孔，并在相应孔中加入待检人血清IgG。使待检 血清在琼脂板中向四周呈环状扩散，在两者浓度比例恰 当处形成肉眼可见的白色沉淀环，沉淀环的直径或面积 与待检人血清浓度呈正相关。同时用标准免疫球蛋白或 国际参考蛋白制成标准曲线，即可用以定量检测人血清 IgG浓度。
温育
结果判断
以出现沉淀线的正常人血清最高稀释度为
人血清IgG的扩散效价。
实验讨论
该方法简便易行，结果稳定可靠。根据抗原抗体相遇 后所出现沉淀线的特征，对其进行定性分析。若相邻两孔 内抗原成分完全相同，则形成完全相连的两条沉淀线；若 抗原完全不同，则形成交叉的两条沉淀线；若抗原部分相 同，则形成部分相连的两条沉淀线；当抗原存在多种成分 时，则呈现多条沉淀线以至交叉反应线，因此可根据沉淀 线的位置、形状、数目等，初步分析抗原和抗体的纯度、 浓度、扩散速度等理化性状。该方法除用于血清IgG的检 测以外，还曾用于诊断和分析某些疾病，如检测AFP、 HBsAg等，但敏感度低所需时间长。
实验方法
制备抗体琼脂凝胶:用生理盐水配置10～15g/L琼脂，加 0.01%（0.1g/L）NaN3，隔水加热煮沸琼脂，置56℃水浴 中备用。吸取99ml已融化的琼脂于三角烧瓶中，置56℃水 浴中保温，将预温的羊抗人IgG抗血清1ml与琼脂充分混合， 继续保温于56℃水浴中备用。 浇板:将清洁干燥的载玻片置于水平台上，用吸管吸取充分 混匀的抗体琼脂4~4.5ml倾注于玻片上，置室温冷却凝固。 要求浇板时要均匀、平整、无气泡、薄厚均匀。 打孔:待琼脂凝固后，用打孔器打孔，孔径3mm，孔距 10~12mm。要求孔打得圆整光滑，孔缘不能破裂，底部勿 与玻片分离。
1.单向免疫扩散
第二十四章免疫诊断免疫学检测技术已广泛应用于医学和生物学领域的研究。
在临床医学中，免疫学检测可用于免疫相关疾病的诊断、发病机制的研究，病情监测与疗效评价等。
如传染病、免疫缺陷病、自身免疫病、肿瘤、移植排斥反应、超敏反应等。
随着免疫学理论的进展和相关技术的发展，检测技术也不断发展和更新，新方法层出不穷。
本章仅介绍免疫诊断常用技术的原理、基本步骤及其应用。
第一节抗原或抗体的检测一、抗原抗体反应的原理抗原与抗体发生结合反应的物质基础是抗原的抗原决定基与抗体的抗原结合部位之间的结构互补性，二者相互结合，在经典的凝集试验及沉淀试验中，有盐离子存在时，多分子聚合，如分子比例恰当出现肉眼可见反应。
（一）抗原抗体反应的特异性一种抗原一般只能与由它刺激所产生的抗体结合，这种抗原抗体结合反应的专一性即特异性。
抗原抗体结合力的大小，常用亲和力（affinity）或亲合力（avidity）来表示，前者指抗体分子上一个抗原结合部位与相应的抗原决定基之间的结合强度，后者指一个抗体分子与整个抗原之间的结合强度。
抗原与抗体的结合为非共价的可逆结合，它们空间构象的互补程度不同，结合力强弱也不同，互补程度越高，亲和力越高。
此外，反应的条件与抗原抗体的结合力也有关系。
例如适宜的温度、酸碱度、离子强度等能促进抗原抗体分子的紧密接触，增强分子间引力，促进分子间相互结合。
用已知抗原免疫人或动物后，机体会产生特异性抗体存在于血清中，这种抗体在实验中常称为第一抗体（简称一抗）。
由于Ig有同种型抗原特异性，将人Ig免疫动物，或将动物Ig免疫异种动物可制备出抗抗体，又称第二抗体（简称二抗）。
用上述免疫接种方法制备的血清习惯上称为抗血清(antiserum)。
抗血清在免疫学检测中十分常用。
例如，用某种细菌免疫家兔制备的抗血清含有一抗，而将兔血清Ig免疫绵羊可制备出羊抗兔Ig血清，即二抗。
在检测标本中的某种细菌时，可单独使用一抗，因为一抗与该细菌的结合是特异的；也可在使用一抗后再加用二抗，通过二抗与一抗特异性结合，来检测一抗所识别的细菌。
高中二年级生物抗原或抗体的检测
抗原或抗体的检测一、检测的原理借助抗原和抗体在体外特异结合后出现的各种现象，对样品中的抗原或抗体进行定性、定量、定位的检测。
1．抗原与抗体的亲和力(affinity)抗原抗体的结合就像酶与底物的结合，激素与其受体的结合一样不是化学的反应，而是非共价键的可逆的结合。
抗原决定簇和抗体分子可变区互补构型，造成两分子间有较强的亲和力。
空间构型互补程度不同，抗原和抗体分子之间结合力强弱也不同。
互补程度高，则亲和力强。
此外，反应温度、酸碱度和离子浓度对抗原和抗体分子上各基因的解离性和电荷特性也有重要的影响，抗体与抗原决定簇之间的结合力大小可用亲合力来表示。
高亲合力的抗体与抗原的结合力强，即使抗原浓度很低时也有较多的抗体结合抗原形成免疫复合物。
2．抗原或抗体外检测原理根据抗原抗体结合形成免疫复合物的性状与活性特点，对标本中的抗原或抗体进行定性、定位或定量的检测。
定性和定位检测比较简单，即用已知的抗体和待检样品混合，经过一段时间，若有免疫复合物形成的现象发生，就说明待检样品中有相应的抗原存在。
若无预期的现象发生，则说明样品中无相应的抗原存在。
同理也可用已知的抗原检测样品中是否有相应抗体。
对抗原或抗体进行定量检测时，以反应中加入抗原和抗体的浓度与形成免疫复物的浓度呈函数关系。
（1）根据免疫复合物产生的多少来推算样品中抗原（或抗体）的含量：在一定的反应条件下，加入的已知抗体（或抗原）的浓度一定，反应产生的免疫复合物多少与待检样品中含有相应抗原（或抗体）量成正比。
也就是抗体浓度一定时，免疫复合物越多则样品中的抗原量也越多。
可用实验性标准曲线推算出样品中抗原（或抗体）的含量。
如免疫单向扩散试验、免疫比浊试验和酶联免疫检测等都属于这类方法。
（2）抗原或抗体效价滴定的原理：当抗原抗体复合物形成多少不能反应抗原抗体反应强弱时，就不能以检测反应强度来对抗原或抗体进行定量。
在实际工作中，把浓度低的反应成分（抗原或抗体）的浓度固定，把浓度高的另一种反应成分作一系列稀释。
琼脂扩散试验
琼脂扩散试验琼脂扩散试验介绍：琼脂扩散试验为可溶性抗原与相应抗体在含有电解质的半固体凝胶(琼脂或琼脂糖)中进行的一种沉淀试验。
琼脂在实验中只起网架作用，含水量为99%，可溶性抗原与抗体在其间可以自由扩散，若抗原与抗体相对应，比例合适，在相遇处可形成白色沉淀线，是为阳性反应。
沉淀线在凝胶中可长时间保持固定位置并可经染色后干燥保存。
沉淀线(带)对抗原与抗体具有特异的不可透性，而非特异者则否。
所以一个沉淀线(带)即代表一种抗原与抗体的沉淀物，因而本试验可对溶液中不同抗原抗体系统进行分析研究。
琼脂扩散试验正常值：检查结果呈阴性。
琼脂扩散试验临床意义：异常结果：增高：胎儿宫内感染，新生儿TORCH症群，慢性或亚急性感染，疟疾，传染性单核细胞增多症，支原体肺炎，肝病，结缔组织疾病，巨球蛋白血症，无症状性单克隆IgM病等。
降低：遗传性或获得性抗体缺乏症，混合性免疫缺陷综合症，选择性IgM缺乏症，蛋白丢失性肠病，烧伤，抗Ig抗体综合症(混合性冷球蛋白血症)，免疫抑制剂治疗等。
需要检查的人群：新生儿和有相关疾病和症状的患者均要检查。
琼脂扩散试验注意事项：不合宜人群：无特殊要求。
检查时的禁忌：禁忌暴饮暴食，和剧烈运动，适宜在早晨空腹检测。
检查时要求：试验前应做预试验，确定抗体的稀释度。
加样时不要将琼脂划破，以免影响沉淀线的形成。
加样时不同浓度抗体和抗原不要混淆，影响试验结果。
琼脂扩散试验检查过程：双向琼脂扩散试验是在含有电解质的半固体琼脂板上，将可溶性抗原和抗体分别加入具有一定距离和孔径的小孔内，使其在一定条件下相互扩散，两者在比例合适处相遇，形成白色沉淀线(带)。
当存在多种抗原抗体系统时可出现多条沉淀线，然后可根据沉淀线的数目、位置、形状对抗原抗体系统进行分析。
单向琼脂扩散又称单向环状免疫扩散，是一种定量测定抗原的方法。
常用来检测标本中各种免疫球蛋白及血清中各种补体成分的含量。
灵敏度高，可对免疫性疾病作辅助诊断。
免疫实验报告2
沉淀反应—双向扩散【实验原理】在一定条件下，抗原能与相应的抗体相互作用，发生免疫沉淀反应。
免疫扩散就是使抗原与抗体在琼脂糖凝胶中自由扩散而相遇，从而形成抗原抗体复合物，由于此复合物分子量增大并产生聚集，不再继续扩散而形成肉眼可见的带状或线状沉淀带。
利用琼脂糖凝胶作为扩散介质是因为一定浓度的琼脂糖凝胶，其内部为多孔网状。
而且孔径很大，可以允许大分子物质（分子量自十几万到几百万以上）自由通过。
因为大多数抗原和抗体的分子量都在20万以上，所以它们在琼脂糖凝胶中几乎可以自由扩散。
而且琼脂糖凝胶又具有良好的化学稳定性、含水量大、透明度好、来源方便、处理容易等优点，因此是免疫沉淀检测技术中最理想的扩散介质。
双向琼脂扩散试验是定性实验。
本实验测定时将加热溶化的琼脂或琼脂糖浇至玻片上，等琼脂凝固后，打多个小孔，将抗原和抗体分别加入小孔内，使抗原和抗体在琼脂板上相互扩散。
当二个扩散圈相遇，如抗原和抗体呈特异性的结合且比例适当时，将会形成抗原抗体复合物的沉淀，该沉淀可在琼脂中呈现一条不透明的白色沉淀线。
如果抗原与抗体无关，就不会出现沉淀线，因此可以通过该试验，用特异性抗体鉴定抗原。
【实验方法】❶制备琼脂玻片：将已加热溶化的1%琼脂5mL，迅速倾入洁净干燥的载玻片上，室温自然冷却凝固。
❷打孔：在凝固的琼脂糖胶上用打孔器或吸嘴按左图所示打梅花孔（孔径约3mm，孔距4mm），用针头小心挑去琼脂。
为便于识别加样方向或区分不同的组，可在琼脂糖胶边缘打上小孔或切角标记。
打孔完毕，将载玻片在酒精灯火焰上方过几遍，可防止漏液。
❸加样：在中央孔加抗体，上下孔加抗原1（Ag1），左右孔加抗原2（Ag2），每孔约10μL。
❹温育：将琼脂糖胶置于湿盒（饭盒垫上纱布，加蒸馏水润湿）中，37℃温育12-24h。
❺结果观察：观察抗原抗体产生的白色沉淀线。
免疫血清的滴度以一定抗原浓度下出现白色沉淀线的最高稀释度来表示。
【实验结果】实验结果如上图所示，红线箭头所示部分为沉淀线。
单向、双向免疫琼脂扩散和免疫电泳(Single Immunodiffusion and
单向、双向免疫琼脂扩散和免疫电泳（Single Immunodiffusion and可溶性抗原与相应抗体以合适的比例发生特异反应时，在一定温度和电解质存在的条件下，形成肉眼可见的沉淀物，称为沉淀反应。
沉淀反应的抗原可以是多糖、蛋白质、脂类等。
根据抗原与抗体的不同条件及其它因素，沉淀反应可以分为以下三种主要形式。
即：环状沉淀反应(ring precipitation reaction)，凝胶中沉淀反应(precipitation reaction in gel)，如单向扩散、双向扩散、对流电泳、免疫电泳以及微生物学实验中的絮状沉淀反应(floccu lation precipitation reaction)，如梅毒血清检验中的康氏（Kahn）及克莱氏（Kline）试验以及检测白喉杆菌毒力的体外试验-Elek 氏试验，检测毒素或类毒素的絮状沉淀单位测定等。
本实验主要介绍凝胶中的沉淀反应。
（一）单向免疫扩散(Single immunodiffusion)—人群血清IgG 正常值测定一、基本原理在含有特异抗体的琼脂板中打孔，并在孔中加入定量的抗原，当抗原向周围扩散后与琼脂中抗体相结合，即形成白色沉淀环，其直径或面积与抗原浓度呈正相关。
同时用标准抗原或国际参考蛋白制成标准曲线，即可用以定量检测未知标本的抗原浓度(mg/ml 或U/ml)。
应用这一实验方法可检测正常人群或患者血清中IgG、IgA 及IgM 的水平。
二、实验材料2%离子琼脂或生理盐水琼脂（内含2%NaN3）。
标准马抗人IgG 血清（抗体）（北京生物制品研究所生产）工作标准参考蛋白（北京生物制品研究所生产）pH7.2 PBS.打孔器（孔径3mm）及打孔模板微量加样器湿盒（容器内加湿纱布或泡沫塑料）已制备好的含有1%马抗人IgG 抗体的琼脂板1/50 稀释的单人份待检血清标本三、实验方法（一）标准曲线的制备：1．按照玻片的大小，准备制做琼脂板所需要的1%离子琼脂。
鉴别试验(免疫双扩散法)SOP
鉴别试验（免疫双扩散法）SOP1.目的为规范鉴别试验（免疫双扩散法）的操作，特制定本SOP。
2.范围本SOP适用于鉴别试验的操作。
3.定义无4.职责4.1QC负责本规程的起草、修订、培训及执行。
4.2QA、QC组长、质量管理部经理负责本规程的审核。
4.3质量总监负责批准本规程。
4.4QA负责本规程执行的监督。
5.引用标准《中华人民共和国药典》2020年版三部。
6.材料6.1仪器设备：微波炉；电子天平。
6.2免疫血清（A、B、C）A、C群血清自中国药品检定研究院或其它检验机构购买的国家标准血清，按照标示量复溶，2～8℃保存。
B群血清是本单位自己免疫动物制备而得, 2～8℃保存。
6.3试剂与配制1.0%琼脂糖：称取琼脂糖1.0g，加入100ml 0.9%生理盐水，在微波炉上加热溶化。
6.4使用器材打孔器、三角瓶、量筒、刻度吸管等。
7.流程图无8.程序8.1原理：在琼脂糖凝胶介质中，在一定的离子强度下，可溶性的抗原和抗体在介质中相向扩散，至相对应性抗原与抗体适合比例时，则可出现免疫沉淀线，再根据沉淀线的种类及特点，鉴别抗原或抗体的性质异同。
8.2操作步骤8.2.1灌胶：将完全溶化的1%琼脂糖溶液趁热用10ml吸管加在载玻片上，每玻片加琼脂糖溶液6～7ml灌制琼脂玻片。
8.2.2打孔：待琼脂玻片凝固后，在玻片上中心打一孔，周围打六孔，各孔中心相距8mm。
8.2.3抗原稀释：取试管数支，将抗原按二倍稀释法用生理盐水连续4～8个稀释度。
8.2.4加样扩散：将稀释后的各抗原浓度依次加到梅花孔四周，抗体加到中心孔。
每孔加样 20～40μl，加样后置密封塑料盒内（盒内放置湿纱布），盖好盒盖，置37℃内水平扩散24小时。
8.2.5染色：用0.9%生理盐水溶液充分浸泡琼脂板，以除去未结合抗原及抗体，再将浸泡好的琼脂板放入0.3%考马斯亮蓝中染色1～3分钟，用脱色液脱至背景无色，沉淀线呈清晰为止。
8.3合格标准A群多糖抗原在抗A群脑膜炎球菌抗体存在下，扩散后应产生明显的沉淀线；C群多糖抗原在抗C群脑膜炎球菌抗体存在下，扩散后应产生明显的沉淀线；B群外膜蛋白抗原在抗B群脑膜炎球菌抗体存在下，扩散后应产生明显的沉淀线。
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免疫双向扩散试验
一原理
为免疫沉淀反应剂中的抗原和抗体在含有电解质的琼脂凝胶中扩散相遇，在二者比例合适的地方，生成肉眼可见的线状沉淀物，即特异性抗原-抗体复合物。
琼脂凝胶含水量为98-99%时，形成网状结构，允许分子量20kDa以下的大分子物质自由扩散。
因为大部分抗原、抗体的分子量在20kDa以下，所以在琼脂凝胶中基本上可以自由扩散。
因不同抗原的化学结构、分子量和带电情况不同，所以在琼脂凝胶中的扩散速度不同，因而将不同的抗原进行分离。
彼此分离的抗原与它们相应的抗体在不同的部位结合，二者在比例适当的地方，因抗原-抗体复合物是不溶性的而从溶液中析出，变成肉眼可见的沉淀物，称为沉淀线。
二实验材料
正常人血清，兔抗人抗血清
三试剂配制
●0.9%的生理盐水100ml
取0.9g氯化钠加水到100ml
● 1.5%琼脂糖（每实验台配制50ml即可）
取1.5g琼脂糖用100ml生理盐水溶解，微波炉（或电炉）加热融化
●抗血清每实验台一份
●制板（是本实验的关键）
取一清洁干燥的载玻片平放于清洁且水平处，做好标记后（姓名，浓度）将已经融化并冷却到30度左右的琼脂糖用小烧杯铺于载玻片上。
琼脂糖铺板后应该均匀，不能凸凹不平，注意胶的厚度。
四实验操作程序
用生理盐水配制1.5%琼脂糖
↓
加热，融化
↓
制板，厚2-3mm
↓
打孔（用吸管打孔），小孔分布形状如图
↓
10μl人血清（淡黄色）加入中央孔
（注意微量进样器的使用）
↓
不同稀释倍数（原倍、2、4、8、16、32倍）的兔抗人抗血清（色深）加入周围各孔20μl （用生理盐水在1.5ml小离心管倍比稀释即可，）
↓
置湿盒中37度过夜
↓
根据沉淀线得出抗体效价。