Apoptin原核表达载体的构建及在大肠杆菌中的表达

第29卷第5期2008年10月西安交通大学学报(医学版)JournalofXi󰀁anJiaotongUniversity(MedicalSciences)Vol.29No.5Oct.2008

Apoptin原核表达载体的构建及在大肠杆菌中的表达

王健生1,张明鑫1,段小艺2,王󰀁峥4,周苏娜1,张广健3,王全颖5,杨广笑5

(1.西安交通大学医学院第一附属医院肿瘤外科;2.西安交通大学医学院第一附属医院核医学科;

3.西安交通大学医学院第一附属医院胸外科,陕西西安󰀁710061;4.四川大学华西医院,四川成都󰀁610041;

5.西安华广生物工程公司,陕西西安󰀁710025)

摘要:目的󰀁构建Apoptin的原核表达载体,并制备抗原物质Apoptin融合蛋白。方法󰀁在获得Apoptin融合基因的

基础上,成功构建了Apoptin的高效原核表达载体pET󰀁28a(+)󰀁Apoptin,将该质粒转化至大肠杆菌E.coliBL21

(DE3)受体菌中,以IPTG对其进行诱导表达,聚丙烯酰胺凝胶电泳分析目的蛋白。结果󰀁转化有Apoptin的原核表

达载体pET󰀁28a(+)󰀁Apoptin的大肠杆菌E.coliBL21(DE3)经IPTG诱导后,经SDS󰀁PAGE分析,在相对分子质量

约17000的位置出现目的蛋白条带,大小与Apoptin融合蛋白一致。结论󰀁Apoptin原核表达载体pET󰀁28a(+)󰀁

Apoptin能够表达出Apoptin融合蛋白,为进一步的Apoptin研究和制备Apoptin抗体奠定了基础。

关键词:Apoptin;原核表达载体;pET󰀁28a(+);大肠杆菌

中图分类号:Q786󰀁󰀁󰀁文献标识码:A󰀁󰀁󰀁文章编号:1671󰀁8259(2008)05󰀁0496󰀁03

Constructionofaprokaryoticexpressionvectorfor

ApoptinandexpressioninE.coli

WangJiansheng1,ZhangMingxin1,DuanXiaoyi2,WangZheng4,ZhouSuna1,

ZhangGuangjian3,WangQuanying5,YangGuangxiao5

(1.DepartmentofOncologySurgery;2.DepartmentofNuclearMedicine;

3.DepartmentofThoracicSurgery,theFirstAffiliatedHospital,MedicalSchoolof

Xi󰀁anJiaotongUniversity,Xi󰀁an710061;4.WestChinaHospital,SichuanUniversity,

Chengdu610041;5.Xi󰀁anHuaguangBioengineeringCompany,Xi󰀁an710025,China)

ABSTRACT:Objective󰀁ToconstructanApoptinprokaryoticvector,aimingtoproduceantigenicfusionprotein

Apoptin.Methods󰀁TheApoptingenewasamplifiedfromthetemplateofplasmidpSSCHG/NT4󰀁Apoptin󰀁HA2󰀁

TATbyPCR.TheApoptinwassub󰀁clonedintothemultipleclonesitesofplasmidpET󰀁28a(+)togetthe

prokaryoticvectorofpET󰀁28a(+)󰀁Apoptin,whichwastransformedintoE.coliBL21(DE3).ExpressionofE.

coliBL21(DE3)wasinducedbyIPTG.ThespecificproteinexpressionwasdetectedbySDS󰀁PAGE.Results󰀁The

fusionproteinwasexpressedwithhighefficiencyinE.coliBL21(DE3)transformedbypET󰀁28a(+)󰀁Apoptinafter

inductionwithIPTG.Thespecificfusionproteinhadanapparentrelatedmolecularweightofabout17000kuas

indicatedbySDA󰀁PAGEanalysis.Conclusion󰀁TheApoptinprokaryoticexpressionvectorwithpET󰀁28a(+)󰀁

ApoptincaneffectivelyexpressApoptinfusionprotein,layingafoundationforfurtherstudyofApoptinand

preparationofantibodiesagainstApoptin.

KEYWORDS:Apoptin;prokaryoticexpressionvector;pET󰀁28a(+);E.coli

收稿日期:2008󰀁04󰀁16󰀁󰀁修回日期:2008󰀁06󰀁30基金项目:教育部博士点专项科研基金赞助项目(No.20060698055)作者简介:王健生(1970󰀁),男(汉族),教授,博士生导师.主要从事肿瘤临床与基础研究.E󰀁mail:wangjsh@mail.xjtu.edu.cn󰀁󰀁目的基因或载体对正常组织的毒性和肿瘤细胞

对治疗的耐受等是限制肿瘤基因治疗临床应用的瓶

颈。Apoptin(凋亡素)的发现突破了上述瓶颈,给抗

肿瘤的基因治疗带来了转机。Apoptin是鸡贫血病

毒(chickenanemiavirus,CAV)的vp3基因编码的蛋白质,体外合成或基因工程表达的Apoptin能特异

的引起多种人源性恶性肿瘤细胞凋亡,对正常二倍体

体细胞无作用;且这种选择性凋亡作用既不依赖于

p53的介导,也不被bcl󰀁2过表达所抑制[1],显示其可

能在肿瘤基因治疗中具有迷人的应用前景。本实验

在获得CAVApoptin基因的基础上,构建Apoptin

的原核表达载体(图1),为下一步表达特异性蛋白产

物、制备Apoptin抗体奠定基础[2]。5期王健生,张明鑫,段小艺,等.Apoptin原核表达载体的构建及在大肠杆菌中的表达

1󰀁材料与方法

1.1󰀁质粒、菌株、工具酶及试剂󰀁含Apoptin全基因

组序列的体外克隆NT4󰀁Apoptin󰀁HA2󰀁TAT重组腺

相关病毒由本课题组构建[2];大肠杆菌Top10、大肠

杆菌BL21均来自西安华广生物工程公司;质粒

pGEM󰀁TEasy购自Promega公司;质粒pET󰀁28a

(+)购自Novegen公司;限制性内切酶、Taq聚合酶

购自华美生物公司;T4DNA连接酶购自MBI公司;主要试剂为国产或进口分析纯。

图1󰀁Apoptin原核表达的构建图

Fig.1Theconstructionofprokaryoticexpressionvectorfor

Apoptin

1.2󰀁引物的设计和合成󰀁根据前期研究的Apoptin

基因序列的结果[2],按照载体上正确的插入方向和译

读框架设计一对引物。引物的5󰀂端分别添加了限制

性内切酶EcoR 和Xho 的酶切序列。扩增的片段

包括Apoptin完整的基因序列。上游引物:5󰀂󰀁

GGAATTCATGAACGCTCTCCAAGAAG󰀁3󰀂;下游

引物:5󰀂󰀁GCTCGAGTCACAGTCTTATACGCCT󰀁

TCTTG󰀁3󰀂(下划线处分别为EcoR 和Xho 的酶

切序列),由上海生工生物工程公司负责合成,用PAGE纯化。

1.3󰀁目的基因的扩增和纯化󰀁以含有Apoptin全基

因组序列的pSSCHG/NT4󰀁Apoptin󰀁HA2󰀁TAT为

模板,上下游引物各50pmol,10!PCR反应缓冲液

10󰀁L,10mmol/LdNTPs2󰀁L,加超净水至终体积

为49󰀁L。94∀预变性5min、94∀变性1min、50∀

退火1min后,再加入1󰀁LTaqDNA聚合酶。进行

94∀变性1min、50∀退火1min、72∀延伸1.5min30

个循环,72∀继续延伸5min。经酚/氯仿抽提,无水乙

醇沉淀,70%(体积分数)乙醇洗涤沉淀后用30󰀁LTE

充分溶解沉淀。取少量PCR产物进行10g/L的琼脂

糖凝胶电泳,并在紫外线测定A260值对产物进行定量。

1.4󰀁重组质粒pGEM󰀁TEasy/Apoptin(pT/Apoptin)

的构建与鉴定󰀁取上述PCR产物600ng(0.2g/L)、质

粒pGEM󰀁TEasy25ng(50g/L)、T4DNA连接酶5u

(5u/󰀁L)、10!T4DNA连接酶缓冲液2.5󰀁L以及

去离子水18󰀁L(总体积25󰀁L)建立连接反应体系,

23∀水浴1h。取10󰀁L连接产物转化100󰀁L感受

态大肠杆菌Top10,涂布LB(Amp+)平皿,37∀倒置

过夜。从LB平皿中挑选单菌落用碱裂解法,经

EcoR 酶切后琼脂糖凝胶电泳,筛选出正确重组质

粒进行大量制备。对含有目的基因的重组质粒进行

DNA测序(上海生工生物工程公司)。

1.5󰀁重组质粒pET󰀁28a(+)󰀁Apoptin的构建和鉴定

将测序正确的重组质粒pGEM󰀁TEasy/Apoptin、

pET󰀁28a(+)分别进行EcoR 和Xho 双酶切后,

各取1󰀁L酶切产物、1󰀁LT4DNA连接酶、10!

T4DNA连接酶缓冲液2.5󰀁L、去离子水18.5󰀁L(总

体积25󰀁L),16∀水浴过夜。取10󰀁L连接产物转

化100󰀁L感受态大肠杆菌Top10,涂布LB(Kan+)

平皿,37∀倒置过夜。从LB平皿中挑选单菌落用碱

裂解法,经EcoR 和Xho 酶切后琼脂糖凝胶电泳,

筛选出正确重组质粒进行大量制备。

1.6󰀁重组质粒pET󰀁28a(+)󰀁Apoptin在大肠杆菌中

的表达󰀁用重组质粒pET󰀁28a(+)󰀁Apoptin转化

E.coliBL21(DE3)受体菌,同时用质粒pET28a(+)转

化BL21菌作对照。分别挑取单个阳性菌落接种入

5mLLB培养液中,37∀振摇培养至培养液的A600达

0.4-0.6。各取2mL培养菌液加入200mLKan+的

LB培养液中,振摇培养3h,然后加入IPTG至终浓度

为1mmol/L,继续振摇培养8h,诱导蛋白表达。

1.7󰀁原核表达蛋白的分离和纯化󰀁收集细菌用裂解

缓冲液和超声细胞粉碎机裂解细菌,分别收集上清和

沉淀进行SDS󰀁PAGE分析,考马斯亮蓝染色,观察蛋

白表达。497