植物叶绿体DNA的提取
叶绿体
叶绿体是植物细胞中由双层膜围成，含有叶绿素能进行光合作用的细胞器。
叶绿体基质中悬浮有由膜囊构成的类囊体，内含叶绿体DNA 。
[1] 是一种 质体。
质体有圆形、卵圆形或盘形3种形态。
叶绿体含有的 叶绿素a 、b 吸收绿光最少，绿光被反射，故叶片呈绿色。
容易区别於另类两类质体──无色的 白色体和黄色到红色的 有色体。
叶绿素a 、b 的功能是吸收 光能，少数特殊状态下的叶绿素a 能够传递电子，通过光合作用将光能转变成化学能。
叶绿体扁球状，厚约2.5微米，直径约5微米。
具双层膜，内有间质，间质中含呈 溶解状态的酶和 片层。
片层由闭合的中空盘状的 类囊体垛堆而成，类囊体是形成 高能化合物 三磷酸腺苷(ATP)所必需。
是植物的“养料制造车间”和“能量转换站”。
能发生碱基互补配对。
中文学名叶绿体 界植物界 长 径视情况而定 5~100μm 不等 主要作用 进行光合作用 拉丁学名 chloroplast 分布区域 植物茎叶 主 要 叶绿素和细胞素目录•1简介 •2形态与结构 •形态总述 •外被 • 类囊体•基质•3光合作用•光反应与电子传递•光合磷酸化•碳反应•4半自主性•5叶绿体与质体的区别•6增殖•7发现1简介大部分高等植物和藻类微[2]生物的叶绿体内类囊体紧密堆积。
主要含有叶绿素（叶绿素a和叶绿素b）、类胡萝卜素（胡萝卜素和叶黄素），叶绿素a和叶绿素b主要吸收蓝紫光和红光，胡萝卜素和叶黄素主要吸收蓝紫光。
这些色素吸收的光都可用于光合作用，叶绿素在色素所占比例最大，且吸收绿光最少，因此绿光被反射，细胞呈现绿色。
叶绿体( chloroplast）存在于藻类和绿色植物中的色素体之一，光合作用的生化过程在其中进行。
因为叶绿体除含黄色的胡萝卜素外，还含有大量的叶绿素，所以看上去是绿色的。
褐藻和红藻的叶绿体除含叶绿素外还含有藻黄素和藻红蛋白，看上去是褐色或红色[有人分别称为褐色体（phacaplost）、红色体（rhodoplast）]。
DNA和RNA提取原理及常见问题分析
硅质材料的吸附 或用异丙醇沉淀浓缩RNA。 经DEPC 处理的水溶解RNA
材料准备及裂解
RNA的提取
尽量使用新鲜材料，条件允许的情况下现取现提 组培细胞及血液应尽量离心去除培养液和上清，消化系统的组 织选取杂质少的部位, 细菌和酵母需要匀浆处理。 对不能马上提取的样品切成小块后立即投入液氮冷冻，或投入 专门的RNA样品储存液中保存（动物的脾脏及消化系统中RNA 非常容易降解，同时DNA的含量丰富，操作应格外的快速小 心）。 液氮研磨时不要使液氮挥发净，随时补充；加入裂解液并且彻 底而迅速地匀浆。
杂质的抽提
RNA的提取
采用有机（酚/氯仿）抽提时应充分混匀 离心分离两相时，应保证一定的转速和时间，使蛋白质、多糖 和DNA分布到中间层和有机相中，RNA留在水相中 对脂肪含量较多的样品注意不要吸入油质层，可以再次用有机 溶剂抽提
RNA的沉淀和溶解
RNA的提取
含RNA的水相过吸附柱，通过去蛋白液和漂洗液去除蛋白多糖 等杂质 或使用异丙醇沉淀RNA应充分的混匀并放置10min左右离心收集 沉淀，70％乙醇洗涤，晾干 用经DEPC处理过的水或专门的试剂来洗脱或溶解RNA 样品收集后或需长期保存时应置于－70℃ 或加入RNase抑制 剂，分装使用
提取RNA的注意事项
经常更换新手套。因为皮肤和实验室用品上可能有 RNase，会导致RNase污染。 使用灭过菌的塑料制品和枪头避免交叉污染。 应使用不含RNase的塑料和玻璃器皿。玻璃器皿可在 150℃烘烤4小时，塑料器皿可在0.5M NaOH中浸泡10 分钟，然后用水彻底清洗，再灭菌，即可去除RNase。 使用有效的RAase抑制剂
DNA提取常见问题
问题二：DNA降解。 原因
1.
1.
实验五 叶绿体的分离
山东大学实验报告2013年3月12 日姓名李某某系年级同组者科目细胞生物学实验题目叶绿体的分离、纯化与荧光观察学号201100140000【实验目的】1、通过植物细胞叶绿体的分离，了解细胞器分离的一般原理和方法；2、观察叶绿体的自发荧光和次生荧光，并熟悉荧光显微镜的使用方法。
【实验原理】1.叶绿体分离原理匀浆破碎细胞，利用差速离心方法分离等渗介质中的悬浮颗粒，收集类叶绿体大小的颗粒，得到叶绿体。
差速离心：颗粒在离心场中的沉降速度取决于颗粒的大小、形状和密度，也同离心力以及悬浮介质的密度有关。
在一给定的离心场中，同一时间内，密度和颗粒大小不同的颗粒其沉降速度不同，先后分批沉降在离心管底部，分批收集即可获得各种亚细胞组分。
叶绿体的分离应在等渗溶液中（0.35mol/L的氯化钠或0.4mol/L的蔗糖溶液）进行，以免渗透压的改变使叶绿体受到损伤。
分离过程最好在0~5℃的条件下进行，如果在室温下，要迅速分离和观察。
2、差速离心特点：1.介质密度均一；2.速度由低到高，逐级离心。
用途：分离大小相差悬殊的细胞核、细胞器。
沉降顺序：细胞核—线粒体—溶酶体与过氧化物酶体—内质网与高尔基体—核蛋白体。
可将细胞器逐步分离，常需进一步通过密度梯度离心再行分离纯化。
3、密度梯度离心密度梯度离心是用一定的介质在离心管内形成连续的密度梯度，将细胞悬浮液或匀浆置于介质的顶部，通过离心力的作用使细胞或细胞器分层、分离，最后不同密度的细胞或细胞器位于与自身密度相同的沉降区带中，这种离心技术又可分为速度沉降和等密度沉降两种，速度沉降主要用来分离密度相近而大小不同的物体，而等密度沉降用于分离密度不同的物体。
叶绿体是植物细胞所特有的能量转换细胞器，光合作用就是在叶绿体中进行的，由于具有这一重要功能，所以它一直是植物生物学、细胞生物学和分子生物学的重要研究对象，叶绿体是一种比较大的细胞器，利用差速离心即可分离收集，然后用密度梯度离心纯化，便可用于各种研究。
人教版选修一高中生物5.1《DNA的粗提取与鉴定》教案
DNA的粗提取与鉴定【课堂活动】［基础回顾］一、实验原理1．DNA的溶解性DNA和蛋白质等其他成分在不同浓度的NaCl溶液中溶解度不同，利用这一特点，选择适当的盐浓度（如2mol/L）就能使DNA充分溶解，而使杂质沉淀，或者相反(DNA在浓度为0.14mol/L的NaCl溶液中，溶解度最小)，以达到分离目的。
此外，DNA不溶于酒精溶液，但是细胞中的某些蛋白质则溶于酒精。
利用这一原理，可以将DNA与蛋白质进一步的分离。
2．DNA对酶、高温和洗涤剂的耐受性蛋白酶能水解蛋白质，但是对DNA没有影响。
大多数蛋白质不能忍受60—80o C的高温，而DNA在80o C以上才会变性。
洗涤剂能够瓦解细胞膜，但对DNA没有影响。
3．DNA的鉴定在沸水浴条件下，DNA遇二苯胺会被染成蓝色，因此二苯胺可以作为鉴定DNA的试剂。
二、实验材料的选取凡是含有DNA的生物材料都可以考虑，但是使用DNA含量相对较高的生物组织，成功的可能性更大，如鸡血（原因：DNA含量丰富，材料易得，鸡血细胞吸水易胀破）。
若用动物组织如猪肝，则需研磨。
三、过程1．破碎细胞，获取含DNA的滤液动物细胞的破碎比较容易，以鸡血细胞为例，在鸡血细胞液中加入一定量的蒸馏水，同时用玻璃棒搅拌，过滤后收集滤液即可。
如果实验材料是植物细胞，需要先用洗涤剂溶解细胞膜。
例如，提取洋葱的DNA时，在切碎的洋葱中加入一定的洗涤剂和食盐，进行充分的搅拌和研磨，过滤后收集研磨液。
注意：①为什么加入蒸馏水能使鸡血细胞破裂？蒸馏水对于鸡血细胞来说是一种低渗液体，水分可以大量进入血细胞内，使血细胞胀裂，再加上搅拌的机械作用，就加速了鸡血细胞的破裂(细胞膜和核膜的破裂)，从而释放出DNA。
②加入洗涤剂和食盐的作用分别是什么？洗涤剂是一些离子去污剂，能溶解细胞膜，有利于DNA的释放；食盐的主要成分是NaCl，有利于DNA 的溶解。
③如果研磨不充分，会对实验结果产生怎样的影响?研磨不充分会使细胞核内的DNA释放不完全，提取的DNA量变少，影响实验结果，导致看不到丝状沉淀物、用二苯胺鉴定不显示蓝色等。
实验1蔗糖密度梯度离心法提取叶绿体
蔗糖密度梯度离心法提取叶绿体一实验目的掌握手工制作密度梯度的技术，了解蔗糖密度梯度离心的原理及优缺点。
二实验原理2.1 概述密度梯度区带离心法（简称区带离心法）：是将样品加在惰性梯度介质中进行离心沉降或沉降平衡，在一定的离心力下把颗粒分配到梯度中某些特定位置上，形成不同区带的分离方法。
此法的优点是：①分离效果好，可一次获得较纯颗粒；②适应范围广，能像差速离心法一样分离具有沉降系数差的颗粒，又能分离有一定浮力密度差的颗粒；③颗粒不会挤压变形，能保持颗粒活性，并防止已形成的区带由于对流而引起混合。
此法的缺点是：①离心时间较长；②需要制备惰性梯度介质溶液；③操作严格，不易掌握。
密度梯度区带离心法又可分为两种：（1）差速区带离心法：当不同的颗粒间存在沉降速度差时（不需要像差速沉降离心法所要求的那样大的沉降系数差）。
在一定的离心力作用下，颗粒各自以一定的速度沉降，在密度梯度介质的不同区域上形成区带的方法称为差速区带离心法。
此法仅用于分离有一定沉降系数差的颗粒（20% 的沉降系数差或更少）或分子量相差3 倍的蛋白质，与颗粒的密度无关，大小相同，密度不同的颗粒（如线粒体，溶酶体等）不能用此法分离。
离心管先装好密度梯度介质溶液，样品液加在梯度介质的液面上，离心时，由于离心力的作用，颗粒离开原样品层，按不同沉降速度向管底沉降，离心一定时间后，沉降的颗粒逐渐分开，最后形成一系列界面清楚的不连续区带，沉降系数越大，往下沉降越快，所呈现的区带也越低，离心必须在沉降最快的大颗粒到达管底前结束，样品颗粒的密度要大于梯度介质的密度。
梯度介质通常用蔗糖溶液，其最大密度和浓度可达 1.28 kg/cm 3和60 ％。
此离心法的关键是选择合适的离心转速和时间（2）等密度区带离心法：离心管中预先放置好梯度介质，样品加在梯度液面上，或样品预先与梯度介质溶液混合后装入离心管，通过离心从而形成梯度，这就是预形成梯度和离心形成梯度的等密度区带离心产生梯度的二种方式。
人教版高中生物选修一全册ppt课件dna的粗提取与鉴定
2.实验现象不明显的原因分析 (1)材料中核物质没有充分释放出来,如研磨不充分或蒸馏水的量 不够。 (2)加入酒精后摇动或搅拌时过猛,DNA 被破坏。 (3)二苯胺配制时间过长,变成浅蓝色,影响鉴定效果。 (4)析出含 DNA 的黏稠物时,蒸馏水一次快速加入,影响实验结果。 (5)实验中有多次搅拌,但是其目的及操作方法是不同的,操作时不 注意区分,影响实验结果。
(4)实验中有两次使用蒸馏水。第一次加水是在获取 DNA 滤液时, 是为了使血细胞吸水膨胀破裂,加水后必须充分搅拌,应不少于 5 min,使 血细胞充分破裂;第二次加蒸馏水是在去除滤液中杂质时,加水是为了 稀释氯化钠溶液,使 DNA 逐渐析出。
(5)实验中有三次加氯化钠溶液。第一次是在破碎植物细胞获取 DNA 滤液时,加入氯化钠溶液是为了提高 DNA 的溶解度。第二次和第 三次都是在去除滤液中的杂质的步骤中。第二次加入氯化钠溶液,是为 了调节氯化钠溶液物质的量浓度为 2 mol/L,过滤除去不溶的杂质。第三 次加入氯化钠溶液是为了将析出的 DNA 丝状物溶解。
DNA 不被蛋白酶水 解
DNA 不溶于酒精溶 液
DNA 可被二苯胺试 剂染成蓝色
加入嫩肉粉
加入冷却酒 精(体积分数 为 95%) 加入二苯胺 试剂并沸水 浴
嫩肉粉中含木瓜蛋白酶,水解蛋白质 DNA 析出,除去溶于酒精的蛋白质 鉴定 DNA
2.DNA 和蛋白质在不同的物质的量浓度的 NaCl 溶液中的溶解度
预习交流
——如何观察 DNA 和 RNA 在细胞中的分布? (1)你能总结一下 DNA、RNA 在细胞中的分布规律吗? 提示:对真核生物而言,DNA 主要存在于细胞核(染色质)中,线粒体、 叶绿体中也有少量的 DNA。RNA 主要存在于细胞质(细胞质基质、核 糖体、叶绿体、线粒体)中,细胞核中也有少量的 RNA。 (2)你能列举不能用来提取 DNA 的细胞吗?请给出必要的解释。 提示:哺乳动物成熟的红细胞、植物的筛管细胞等,因为它们失去了 细胞核,而 DNA 分子主要存在于细胞核中。 (3)观察 DNA、RNA 在细胞中分布实验的原理是什么? 提示:用吡罗红甲基绿的混合染色剂对细胞染色,然后用显微镜观 察。绿色区域代表 DNA 的分布区域,红色区域代表 RNA 的分布区域。
康测科技植物ATAC-seq技术劲爆来袭!
植物ATAC-seq劲爆来袭！基因转录调控顺式作用元件包括核心启动子和增强子；核心启动子在转录起始位点（TSS）上游25-30bp位置，比较保守；增强子序列能够招募转录因子，控制核心启动子的转录活性，在基因转录调控中具有重要的地位。
在植物中，顺式作用元件，尤其是增强子，在基因组上的分布是不清楚的。
ATAC-seq作为获取染色质开放区域强有力的新技术，能够在全基因组水平上研究植物的整体调控区域；相对于传统DNase-seq技术，ATAC-seq技术使用的细胞核数目少（最多5万个），操作简单，因此被广泛采用。
埃默里大学的Roger B. Deal课题组在Plant Cell杂志上发表植物ATAC-seq里程碑式的文章，开启了ATAC-seq技术在植物研究领域的应用。
文中作者使用ATAC-seq技术系统研究拟南芥、水稻、苜蓿、番茄的根尖组织染色质开发区域，发现开放染色质区域位于转录起始位点上游3kb内，并且鉴定到4个关键转录因子在根尖中调控一系列保守基因的表达；最后作者比较了拟南芥根毛细胞和非根毛表皮细胞染色质开放区域及根毛关键转录因子调控网络。
下面小编将详细对这篇文章进行讲解。
ATAC-seq实验设计1)拟南芥根尖组织ATAC-seq，使用链霉亲和素磁珠富集细胞核；2生物学重复；命名为：INTACT-ATAC-seq；2)拟南芥根尖组织ATAC-seq，蔗糖梯度密度离心富集细胞核；2生物学重复；命名为：Crude-ATAC-seq；3)拟南芥根尖组织DNase-seq，蔗糖梯度密度离心富集细胞核；2生物学重复；命名为：DNase-seq；4)苜蓿根尖组织ATAC-seq，使用链霉亲和素磁珠富集细胞核；2生物学重复；5)番茄根尖组织ATAC-seq，使用链霉亲和素磁珠富集细胞核；2生物学重复；6)水稻根尖组织ATAC-seq，使用链霉亲和素磁珠富集细胞核；2生物学重复；7)拟南芥根毛细胞ATAC-seq，使用链霉亲和素磁珠富集细胞核；2生物学重复；8)拟南芥非根毛表皮细胞ATAC-seq，使用链霉亲和素磁珠富集细胞核；2生物学重复；注：所有植物株系都为表达生物素连接酶- NTF（定位于细胞核核膜）融合蛋白的转基因材料，因此可以使用链霉亲和素磁珠富集细胞核。
DNA简介
ＤＮＡ（脱氧核糖核酸）是核酸的一类，因分子中含有脱氧核糖而得名。
ＤＮＡ分子极为庞大（分子量一般至少在百万以上），主要组成成分是腺嘌呤脱氧核苷酸、鸟嘌呤脱氧核苷酸、胞嘧啶脱氧核苷酸和胸腺嘧啶脱氧核苷酸。
ＤＮＡ存在于细胞核、线粒体、叶绿体中，也可以以游离状态存在于某些细胞的细胞质中。
大多数已知噬菌体、部分动物病毒和少数植物病毒中也含有ＤＮＡ。
除了ＲＮＡ（核糖核酸）和噬菌体外，ＤＮＡ是所有生物的遗传物质基础。
生物体亲子之间的相似性和继承性即所谓遗传信息，都贮存在ＤＮＡ分子中。
１９５３年，詹姆斯·沃森和弗朗西斯·克里克描述了ＤＮＡ的结构：由一对多核苷酸链相互盘绕组成双螺旋。
他们因此与伦敦国家工学院的物理学家弗雷德里克·威尔金斯共享了１９６２年的诺贝尔生理学或医学奖。
丰富多彩、引人入胜的生命现象，历来是人们最为关注的课题之一。
在探索生物之谜的历史长河中，一批批生物学家为之奋斗、献身，以卓越的贡献扬起生物学“长风破浪”的航帆。
今天，当我们翻开群星璀璨的生物学史册时，不能不对J·沃森（JinWatson）、F·克里克（FrancisCrick）的杰出贡献，予以格外关注。
50年前，正是这两位科学巨匠提出了DNA 双螺旋结构模型的惊世发现，揭开了分子生物学的新篇章。
如果说十九世纪达尔文进化论在揭示生物进化发展规律、推动生物学发展方面，具有里程碑意义的话，那么，DNA双螺旋结构模型的提出，则是开启生命科学新阶段的又一座里程碑。
由此，人类开始进入改造、设计生命的征程50年前发现DNA双螺旋结构的功臣1953年2月28日中午，剑桥大学的两位年轻的科学家弗朗西斯·克里克和詹姆斯·沃森步入老鹰酒吧，宣布他们的发现：DNA是由两条核苷酸链组成的双螺旋结构。
这家著名的酒吧位于剑桥大学国王学院斜对面，酒吧的标志是一只展开翅膀的老鹰，英文名字就叫The Eagle Pub。
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实验1 植物叶绿体DNA的提取、PCR扩增与电泳观察
【实验目的】
1、学习从新鲜的绿色叶片中提取叶绿体DNA的方法
2、学习和掌握琼脂糖凝胶电泳观察DNA的操作方法
3、学习和掌握PCR实验的原理和操作方法
【实验原理】
叶绿体是绿色植物进行光合作用的细胞器，具有相对独立的遗传物质——叶绿体基因组
DNA（ctDNA），大小在120～160 kb，其DNA分子都是以共价、闭合、环状双链形式存在。由
于cpDNA相对保守及其重要功能，已被广泛用于细胞质遗传、植物的系统发育、遗传多样性
和亲缘关系等多方面的研究，而获得纯度高、产量好的、结构完整的ctDNA是开展相关研究
的前提条件。然而ctDNA的提取是限制深入研究的重要因素，传统的提取方法包括梯度离心
提取ctDNA的方法，对设备要求高，成本高，耗时长．产率低。因此，我们要尽可能快速、
简便地获得质纯、量大的ctDNA．一般来说获得纯度高、浓度大的叶绿体DNA很难，主要是因
为叶绿体DNA含量太少同时在提取中有诸多因素干扰(如：核DNA、RNA、蛋白质等)。本实验
通过改进部分传统操作，提取叶绿体基因组DNA，同时利用琼脂糖凝胶电泳及PCR实验检验提
取效果。
【实验仪器与试剂】
1、 器材：
剪刀、烧杯、移液器、枪头、量筒、匀浆器、纱布、300目尼龙网、注射器、离心管、滤膜
2、试剂：
① 酶液：1%纤维素酶、0.6mM蔗糖、8mM CaCl2·2H2O、10mM NaH2PO4·2H2O，pH5.6
② 洗涤液：0.6mM蔗糖、8mM CaCl2·2H2O、2mM NaH2PO4·2H2O，pH5.6
③ 10%SDS
④ 溶液A：25mM EDTA，50mM Tris，pH=8.0
⑤ Tris饱和酚，氯仿，异丙醇，TE，琼脂糖，gold view，Loading buffer，DNA marker
⑥ 新鲜叶片
⑦ PCR Buffer、Mg2+、dNTP、上、下游引物、ddH2O、Taq DNA聚合酶
【实验步骤】
一、 叶片采集
采集适量新鲜绿叶（约10g）
二、 细胞破碎
首先利用剪刀将叶片剪碎，然后放于匀浆器中，先加入不含酶的酶液进行匀浆，弃渣，
将液体转移至烧杯中，加入纤维素酶至终浓度为1%后搅拌均匀，50度水浴约30分钟。
三、 叶绿体分离
将经酶液处理的液体取出，依次用纱布和300目尼龙网与大注射器过滤，取滤液。
1、 用电组：将上述滤液转移至50mL离心管中，3000rpm离心3分钟，弃上清。用10mL
洗涤液重悬洗涤后3000rpm离心3分钟，弃上清，洗涤两次后，即分离得到叶绿体。
2、 不用电组：利用大注射器及0.2μm滤膜过滤上述滤液后，将滤膜上的叶绿体刮下，
转移至1.5mL离心管中，即分离得到叶绿体。
四、 DNA提取
1、用电组：
① 向叶绿体中加入500μL溶液A把叶绿体悬浮，转移至1.5mL离心管中。
② 加入200μL10%SDS（裂解叶绿体膜，释放DNA），混匀后静置2min；
③ 加入350μL苯酚（使蛋白质变性）+350μL氯仿（与苯酚互溶，易于除去苯酚），混匀，
10000rpm离心2min；
④ 转移上层液体至新的离心管中，加入等体积氯仿（去除苯酚），混匀，10000rpm离心2min；
⑤ 转移上层液体至新的离心管中，加入0.6倍体积异丙醇（沉淀DNA）沉淀10min；
⑥ 10000rpm离心5min，弃上清；
⑦ 加入500μL70%乙醇（去除盐离子）洗涤沉淀，10000rpm离心5min，晾干；
⑧ 30μL TE溶解DNA；
2、 不用电组：
① 向叶绿体中加入500μL溶液A把叶绿体悬浮；
② 加入200μL10%SDS，混匀后静置2min；
③ 加入适量KI固体至饱和后静置至出现明显分层；
④ 将下层透明液体转移至DNA吸附柱中，用洗耳球将液体吹出，DNA吸附于硅胶膜上，弃
液体；
⑤ 向吸附柱中加入500μL70%乙醇，用洗耳球吹出，弃液体，晾干；
⑥ 将吸附柱至于新的1.5mL离心管中，用30μL TE溶解DNA，用洗耳球将液体吹入离心
管中。
五、 PCR扩增特征条带
25μL体系：
PCR Buffer 2.5μL
Mg2+ 1.5μL
dNTP 2.0μL
上、下游引物 各2.5μL 加至PCR管中
ddH2O 8.0μL
Taq DNA聚合酶 1.0μL
DNA模板 5.0μL
PCR结束后，取5 μL在 O．8％的琼脂糖上电泳，观察。
六、 叶绿体DNA的电泳观察
取提取的叶绿体DNA 5 μL在 O．8％的琼脂糖上电泳，电泳1h后，使用自制的LED
灯进行观察。
【实验结果与讨论】
1、为保证叶绿体DNA的含量和纯度，在本实验操作中，样品前处理、抽提、纯化等操作中
应注意什么？
2、提取不同种植物的叶绿体DNA，比较、分析实验结果。