干细胞定向分化

影响胚胎干细胞定向分化的因子包括转录因子、细 胞因子以及化学诱导剂的体外诱导，同时也包括通过共 培养和表观遗传修饰进行的诱导[27]。这其中对于细胞因 子领域研究较多。最新研究表明，Jumonji能够通过调节 Polycomb抑制复合物2(PRC2)的功能，从而维持胚胎干细 胞自我更新和分化间的平衡，一旦Jumonji缺失，便会抑 制胚胎干细胞的分化[28,29]。而对于PRC对胚胎干细胞分化 的调节机制，研究人员发现PRC复合体的重要成分Ezh2是 通过抑制Ink4A-Ink4B位点，从而调节细胞的分化率[30]。 此外，还有研究发现，Chd1基因能够通过控制核染色质 的开放从而调节胚胎干细胞的分化[31]。美国、加拿大和英国的科研 人员在2008年发现了一种“干细胞自我维持稳态”，这 种理论与现行的主流观点相反，认为胚胎干细胞的增殖 和多能性并不依赖于外界刺激，而是自身固有一套自我 更新和分化的程序[32] 目前，大部分关于胚胎干细胞的研究均以小鼠作为 研究对象，因此，对于胚胎干细胞定向分化的研究所得 到的有效诱导因子大部分是针对小鼠的。然而，研究发 现，用于诱导小鼠胚胎干细胞定向分化的因子对于诱导 人类胚胎干细胞向特定细胞的分化并不是都有效，比如 在人类胚胎干细胞中，苯丙酸诺龙(activin-A)和转化生长 因子(transforming growth factor，TGF)只能诱导中胚层的 形成，视黄酸(retinoic acid，RA)、表皮生长因子(epidermal growth factor，EGF)、骨形成蛋白4(bone morphogenetic protein，BMP-4)和碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor，bFGF)促使细胞向外胚层和中胚 层分化，然而神经生长因子(nerve growth factor，NGF)和 肝细胞生长因子(hepatocyte growth factor，HGF)促使人类 ESC向三个胚层的细胞分化，BMP-4还能诱导人类ESC发 育为滋养层的细胞[33] 间充质干细胞最初是从骨髓中分离获得，随着研究 的不断深入，目前从脂肪组织、骨外膜、滑膜、骨骼 肌、表皮、血液、骨小梁、人脐带、肺、牙髓、牙周膜 等组织中均能够分离获得间充质干细胞。骨髓间充质干 细胞具备易于分离、培养、扩增和纯化，多次传代扩增 后仍具有干细胞特性，不存在免疫排斥，体外基因转染 率高并能稳定高效表达外源基因等优点，因此骨髓间充 质干细胞成为近年干细胞研究的热点。 自从2001年首次成功分离脂肪来源间充质干细胞以 来，由于其不仅与骨髓间充质干细胞的生物学特性相 似，具有很强的体外扩增能力和多向分化潜能，经过多 次传代后细胞增殖能力没有明显的降低，最重要的是其 来源充足、易于分离培养，使其成为继骨髓间充质干细 胞之后的研究新热点，并呈现出良好的发展前景[34]。此外，近年来，脐带组织在间充质干细胞领域的潜 力得到许多科研人员的重视。脐带血中的间充质干细胞 与骨髓间充质干细胞一样，也能够在体外分离、培养、 扩增，而且同样具有多项分化潜能，可诱导为脂肪细胞 和成骨细胞[35]；还有科研人员比较了骨髓来源和脐带组 织来源的间充质干细胞在体外造血能力的差异，发现脐 带间充质干细胞也能够在体外支持长期的造血，但是其 造血能力要弱于骨髓间充质干细胞[36]。脐带组织来源的 间充质干细胞还具有细胞较原始、污染较少、免疫原性 低、外源基因易表达等优点，在间充质干细胞的临床应 用中具有广阔的发展前景。 [ 2 7 ] 梁贺, 等. 胚胎干细胞及诱导多能干细胞向心肌 细胞分化和调控的研究进展. 生命科学, 2 0 0 9 , 2 1 ( 5 ) : 663-668. [28]Peng JC, et al. Jarid2/Jumonji Coordinates Controlof PRC2 Enzymatic Activity and Target Gene Occupancy in Pluripotent Cells. Cell, 2009. 139:1290-1302. [29]Shen XH, e t a l . Jumonj i Modul a t e s Polycomb Activity and Self-Renewal versus Differentiation of Stem Cells. Cell, 2009, 139:1303-1314. [ 3 0 ] E z h k o v a E , e t a l . E z h 2 Or c h e s t r a t e s Ge n e Expression for the Stepwise Differentiation of Tissue- Specific Stem Cells. Cell, 2009, 136: 1122-1135. [ 3 1 ]Ga s p a r -Ma i a A, e t a l . Ch d 1 r e g u l a t e s o p e n chromatin and pluripotency of embryonic stem cells. Nature, 2009, 460(13):863~868. [32]Ying QL, et al. The ground state of embryonic stem cell self-renewal. Nature, 2008, 453(22):519-523. [33]葛秀国, 李吉霞, 窦忠英. 胚胎干细胞体外分化研究进展.天津农学院学报, 2009, 16(3): 47-51. [34]薛君, 边云飞, 郭泽君. 人脂肪来源的间充质干细胞 的生物学研究.中国药物与临床, 2009, 9(3): 185-186. [35]于海微, 等. 人脐带血和骨髓来源间充质干细胞的体 外分离、培养、分化及生物学特性比较. 中国组织工程 研究与临床康复, 2009, 13(6): 1021-1024. [36]刘蒙, 等. 人骨髓和脐带来源间充质干细胞体外支 持造血能力的比较研究. 中国实验血液学杂志, 2009, 17(5): 1294-1300. DAC处于一个更为“年轻”的微环境中，这种微环境包括细胞、细胞外基质、微血管系统、细胞因子、信号分子、细胞表面分子以及细胞间相互作用等因素，类似于干细胞“龛”的结构[30]。如DAC呈现出的细胞浓聚现象有利于广泛的细胞-细胞、细胞-基质间的相互作用，从而在这个微环境中产生更多的信号分子及成分促进细胞间的交通。而由信号分子及细胞外基质介导的细胞间的交通被认为在牙齿形态发生的时间、空间调节上起关键作用[31-33]。此外，Tsukada等[34]发现在牙根延伸过程中，根端组织中持续存在大量血管网，丰富的血液供应可能提供更多的原始细胞和营养物质。DAC不仅是牙根和牙周组织发育的生长控制中心，也是牙根和牙周组织发育的干细胞龛，为牙根和牙周组织的发育持续不断地提供相应的干细胞以及必备的微环境。

牙齿发育是一个连续的过程，其发育过程中各个阶段都受到上皮-间充质相互作用的调控[35-38]。由于HERS在牙根发育中是暂时性的结构，仅由两层上皮细胞构成，细胞数量少，且被外胚间充质细胞包绕，故从牙根中单独分离HERS细胞相当困难。迄今为止，关于HERS细胞分离培养的报道还很少，因此，HERS在牙根和牙周组织发育中的具体作用还不太清楚。一些研究发现，在牙根发育过程中HERS在根尖末端始终未断裂[9，39]。另外的研究也证实，HERS甚至是Malassez上皮剩余（epithelial rests of Malassez，ERM）中均存在丰富的神经分布[40]。对于DAC的研究也表明，在牙根发育的整个过程中，HERS在牙本质根尖末端和上皮隔的部位始终保持完整性，并且存在增殖，提示HERS仍然作为一个有活性的组织存在于DAC中的可能性。因而推测DAC中可能存在上皮-间充质的相互作用，从而促进DAC中牙根和牙周组织前体细胞的分化。

先前的研究将原代DAC细胞进行差别消化培养，获得了纯化的上皮细胞（HERS细胞）和间充质细胞，包含HERS的DAC细胞形成了形态良好的牙根和牙周组织样结构，包括牙本质、牙骨质、牙周膜和骨样组织。而不包含HERS细胞的DAC仅形成了没有牙本质小管结构的骨样牙本质和无规则排列的纤维样组织。提示HERS在牙根和牙周组织发育中起重要作用，DAC作为一个功能性的整体在牙根和牙周组织共同发育中起作用，DAC中每种细胞成分对于牙根-牙周复合体的形成都是必需的。

将DAC细胞培养后收集培养液制备成DAC条件培养液，观察DAC条件培养液对牙囊细胞增殖分化的影响。结果显示，经DAC条件培养液诱导后，牙囊细胞增殖受到抑制，碱性磷酸酶（alkaline phos-phatase，ALP）活性增强，表达矿化组织形成细胞和牙周膜成纤维细胞的相关蛋白，在牙本质载体中生成大量的骨样组织和纤维组织，免疫组化确定矿化组织为骨组织[41]。结果揭示在DAC条件培养液中含有多种与牙根和牙周组织发育相关的生物活性因子，DAC细胞条件培养液可以诱导牙囊细胞向成骨细胞、成纤维细胞分化。将DAC条件培养液作用于牙周膜干细胞，同样可以诱导牙周膜干细胞向成牙骨质细胞谱系和成骨细胞谱系分化，并且可在体内异位形成牙周膜牙骨质复合体样结构以及骨样结构。