蛋白质的分离与纯化

蛋白质的分离与纯化

蛋白质分离纯化的基本流程

选择材料和预处理细胞的破碎及细胞器的分离蛋白质的抽提蛋白质的纯化浓缩、干燥和保存

一、材料的选择和预处理

微生物、植物和动物都可做为制备蛋白质的原材料，所选用的材料主要依据实验目

的来确定。

从工业生产角度考虑，注意选含量高、来源丰富及成本低的原料。

对动物组织，必须选择有效成份含量丰富的脏器组织为原材料，先除去结缔组织和

脂肪组织。

对预处理好的材料，若不立即进行实验，应冷冻保存，对于易分解的生物大分子应

选用新鲜材料制备。

二、细胞的破碎

（一）机械方法：主要通过机械切力的作用使组织细胞破坏。

高速组织捣碎机（转速可达10000rpm，具高速转动的锋利的刀片），适用于动物内脏组织的破碎。

玻璃匀浆器（用两个磨砂面相互摩擦，将细胞磨碎），适用于少量材料；也可用不锈钢或硬质塑料等，两面间隔只有十分之几毫米，对细胞破碎程度比高速捣碎机高，机械

切力对分子破坏较小。

小量的也可用乳钵与适当的缓冲剂磨碎提取，也可加氧化铝、石英砂及玻璃粉磨细。（二）物理方法：主要通过各种物理因素的作用，使组织细胞破碎。

反复冻融法：将细胞在-20度以下冰冻，室温融解，反复几次，由于细胞内冰粒形成和剩余细胞液的盐浓度增高引起溶胀，使细胞结构破碎。

超声波法：用一定功率的超声波处理细胞悬液，使细胞急剧震荡破裂，此法多适用于微生物材料；只要有设备，该法方便且效果也好，但一次处理量较小。应用超声波处理时应注意避免溶液中气泡的存在。处理一些超声波敏感的蛋白质酶时宜慎重。

（三）化学及生物化学法

有些动物细胞，例如肿瘤细胞可采用十二烷基磺酸钠（SDS）、去氧胆酸钠等使细胞膜破坏；细菌细胞壁较厚，采用溶菌酶处理效果更好。此外一些细胞膜较脆弱的细胞，可把它们置于水或低渗缓冲剂中透析将细胞胀破。

细胞器的分离

制备某一种生物大分子需要采用细胞中某一部分的材料，或者为了纯化某一特定细胞器上的生物大分子，防止其他细胞组分的干扰，细胞破碎后常将细胞内各组分先行分离，以便于获得更好的分离效果。

细胞器的分离一般采用差速离心法

细胞经过破碎后，在适当介质中进行差速离心。利用细胞各组分质量大小不同，沉降于离心管内不同区域，分离后即得所需组分。

细胞器的分离制备，介质的选择现一般用蔗糖、Ficoll或葡萄糖-聚乙二醇等溶液。

三、蛋白质的提取

提取是将经过预处理或破碎了的细胞或组织置于一定条件下的溶剂中，让被提取的蛋白质以溶解状态充分地释放出来，并尽可能保持原来的天然状态，不丢失生物活性的过程。

大部分蛋白质都可溶于水、稀盐、稀酸或碱溶液，少数与脂类结合的蛋白质则溶于乙醇、丙酮、丁醇等有机溶剂中，因些，可采用不同溶剂提取分离和纯化蛋白质。

抽提所用缓冲液的pH、离子强度、组成成分等条件的选择应根据欲制备的蛋白质的性质

膜蛋白的抽提，抽提缓冲液中一般要加入表面活性剂，使膜结构破坏，利于蛋白质

与膜分离。

在抽提过程中，应注意温度，避免剧烈搅拌等，以防止蛋白质的变性。

水溶液提取法

大部分蛋白质均溶于水、稀盐、稀碱或稀酸溶液中，因此蛋白质的提取一般以水为主。稀盐溶液和缓冲溶液对蛋白质稳定性好、溶度大，也是提取蛋白质的最常用溶剂。

注意事项

温度：一般采用低温（4℃以下）操作

盐浓度：等渗盐溶液以0.02～0.05mol/L磷酸盐缓冲液和碳酸盐缓冲液常用；0.15mol/L 氯化钠溶液应用也较多。

pH：提取液的pH值应选择在偏离等电点两侧的pH 范围

有机溶剂提取法

一些和脂质结合比较牢固或分子中非极性侧链较多的蛋白质和酶，不溶于水、稀盐溶液、稀酸或稀碱中，可用乙醇、丙酮和丁醇等有机溶剂提取；这些有机溶剂具有一定的亲水性，还有较强的亲脂性，是理想的脂蛋白提取液。

必须在低温下操作。

丁醇提取法对提取一些与脂质结合紧密的蛋白质和酶特别优越

丁醇亲脂性强，特别是溶解磷脂的能力强。

丁醇兼具亲水性，在溶解度范围内不会引起酶

的变性失活。

丁醇提取法的pH及温度选择范围较广，也适用于动植物及微生物材料。

表面活性剂的利用

对于某些与脂质结合的蛋白质和酶，可以采用表面活性剂如胆酸盐及十二烷基磺酸

钠等处理。

表面活性剂有阴离子型（如脂肪酸盐、烷基苯磺酸盐及胆酸盐等），阳离子型（如氧化苄烷基二甲基铵等）及非离子型（Triton X-100 、Tirton X-114、吐温60 及吐温80）等。非离子型表面活性剂比离子型温和，不易引起酶失活，使用较多。

对提取物的保护

无论用哪一种方法破碎组织细胞，都会使细胞内蛋白质或核酸水解酶释放到溶液中，使生物大分子降解，导致天然产物的量减少。

二异丙基氟磷酸（DFP）可以抑制或减慢自溶作用；

碘乙酸可以抑制活性中心有巯基的蛋白水解酶的活性

苯甲磺酰氟化物（PMSF）能清除蛋白水解酶活力

还可通过选择pH、温度或离子强度等，使反应条件适合于目的蛋白的提取。

四、蛋白质的纯化

做纯化前应做的工作：

了解目标物质的特性

必须建立可靠的活性测定的方法纯化流程蛋白质的粗提纯纯化纯度鉴定活性测定

（一）蛋白质的粗提纯

选用适当的方法将所要的蛋白质与其它杂蛋白分离开来。比较方便的有效方法是根据蛋白质溶解度的差异进行的分离。

常用方法：盐析法、等电点沉淀、有机溶剂沉淀法

向蛋白质溶液中加入中性盐，在低盐浓度下随着盐浓度升高，蛋白质的溶解度增加，此称盐溶；当盐浓度继续升高时，蛋白质的溶解度不同程度下降并先后析出，这种现象称盐析。

由于各种蛋白质分子颗粒大小、亲水程度不同，故盐析所需的盐浓度也不一样，因此调节混合蛋白质溶液中的中性盐浓度可使各种蛋白质分段沉淀。

影响盐析的因素

温度：一般室温操作，对温度敏感的蛋白可在低温下操作。

pH：大多数蛋白质在等电点时在浓盐溶液中的溶解度最低。

蛋白质浓度：蛋白质浓度高时，欲分离的蛋白质常常夹杂着其他蛋白质地一起沉淀出来（共沉现象）。

盐析中常用的中性盐：硫酸铵

盐析后除盐的方法：常用的办法是透析，即把蛋白质溶液装入透析袋内用缓冲液进行透析，并不断的更换缓冲液，因透析所需时间较长，所以最好在低温中进行；也可用葡萄糖凝胶G-25或G-50过柱的办法除盐，所用的时间就比较短。

等电点沉淀法

蛋白质在表面静电荷为零状态时颗粒之间的静电斥力最小，因而溶解度也最小，利用各种蛋白质等电点的差别，可通过调节溶液的pH达到某一蛋白质的等电点使之沉淀，但此法很少单独使用，可与盐析法结合用。

低温有机溶剂沉淀法

有机溶剂能降低溶液的介电常数，从而增加蛋白质分子上不同电荷的引力，导致溶解度降低；有机溶剂与水作用能破坏蛋白质的水化膜，使蛋白质在一定浓度的有机溶剂中沉淀析出。

常用的有机溶剂是乙醇和丙酮，一般宜在低温下进行，且在加入有机溶剂时注意搅拌均匀以免局部浓度过大。

（二）蛋白质粗品的纯化

常用的纯化方法有：凝胶过滤层析、离子交换纤维素层析、亲和层析等。

通常几种方法联合使用来获得较高纯度的蛋白质样品。

凝胶过滤（分子筛）

是利用具有网状结构的凝胶作分离介质，根据被分离物质的分子大小不同对混合物进行分离的技术。

层析柱中的填料是某些惰性的具有多孔网状结构的物质，多是交联的聚糖(如葡聚糖或琼脂糖)类物质，小分子物质能进入其内部，流下来速度慢，而大分子物质却被排除在外部，流下来的速度快，当混合物通过凝胶过滤层析柱时，溶液中的物质就按不同的分子量筛分开了。

凝胶过滤的优点

所用的凝胶属于惰性载体，不带电荷，吸附力弱，操作条件比较温和，可在相当广的温度范围下进行，不需要有机溶剂，并且对待分离成分理化性质的保持有独到之处。对于高分子物质有很好的分离效果。

凝胶过滤的基本实验流程

凝胶的选择凝胶的预处理装柱层析柱的选择，填装的注意事项，平衡，使用前的检查上样及洗脱样品的预处理凝胶柱的重复使用，凝胶的回收和保存

凝胶层析的应用

脱盐分离提纯测定高分子物质的分子量：用一系列已知分子量的标准品放入同一凝