2006-基于核酸适配体的新型荧光纳米生物传感器用于凝血酶的测定_徒永华

Vo.l27高等学校化学学报No.12
2006年12月 CHEMICALJOURNALOFCHINESEUNIVERSITIES 2266~2270

基于核酸适配体的新型荧光纳米生物
传感器用于凝血酶的测定

徒永华
1,程圭芳1,林 莉1,郑 静1,吴自荣2,何品刚1,方禹之1
(1.华东师范大学化学系,2.生命科学学院,上海200062)

摘要 利用凝血酶的两条核酸适配体与凝血酶的高亲和力构建了三明治结构,利用磁性纳米颗粒的磁性分
离技术,设计并制作了一种新型的荧光纳米生物传感器,用其检测凝血酶.此法对凝血酶的响应线性范围为
2124@10-11~4103@10-9mol/L,其线性方程为I=019758@1011c-21628,检出限为110@10-11mol/L,对
浓度为2168@10
-10
mol/L的凝血酶检测10次,其RSD为2156%,测得的荧光信号稳定,24h后测定并无衰

减,具有很高的检测特异性和灵敏度.
关键词 核酸适配体;凝血酶;磁性纳米颗粒;荧光
中图分类号 O652 文献标识码 A 文章编号 025120790(2006)1222266204

收稿日期:2005211225.
基金项目:国家自然科学基金(批准号:20675031)资助.
联系人简介:方禹之(1931年出生),男,教授,博士生导师,主要从事化学传感器、生物传感器、电化学及光谱电化学等方面的研
究.E2mai:lyzfang@chem.ecnu.edu.cn

肿瘤组织对周围组织的侵袭、转移的形成以及肿瘤组织和肿瘤患者血液本身的变化均可导致病人
凝血机制的改变,产生不同程度的出血倾向.凝血酶是一种重要的生理蛋白酶,在血液凝固、炎症和
创伤愈合等生理及病理过程中发挥重要作用,因此检测凝血酶在医学上具有重要意义.凝血酶
(Thrombin)的浓度及活性是衡量凝血机制的重要指标,对揭示肿瘤的发生机制,或作为早期诊断、分
子分型、疗效及预后判断具有重大意义
[1]
.

传统上直接测定凝血酶的方法主要有发色底物法[2]和荧光法
[3]
.发色底物法利用凝血酶切断其与

发色肽的作用点精氨酰与对硝基苯胺相连的肽键,使对硝基苯胺游离出来.当对硝基苯胺与肽链相连
时,其溶液为无色液体,当它游离存在时,显浅黄色,溶液在405~410nm波长处对光有最大吸收,据
此可进行定量测定
[4]
.该法简单易行,但灵敏度不高,不宜进行微量分析.荧光法是将荧光底物与凝

血酶结合,通过测定荧光强度可以得出凝血酶的含量.单纯使用荧光法需要用荧光底物标记凝血酶,
操作步骤繁琐,荧光背景不易降低,灵敏度低.
核酸适配体(Aptamer)是通过SELEX技术[5]筛选出来的,可以特异性结合目标分子如蛋白质、氨
基酸、有机小分子及一些无机离子的核酸序列片断.核酸适配体和蛋白质等目标分子的结合与抗体和
抗原结合相类似
[6],具有很强的专一性和选择性[7~10]
.

由于不是所有的蛋白都能找到与之一一对应的抗原或抗体,而标记蛋白往往会造成蛋白的活性降
低甚至失活,传统的免疫蛋白分析不能适应发展需要.而由人工合成的核酸适配体不依赖于动物或细
胞,容易获得,可方便地在适配体的特定位置用荧光、酶或生物素分子等功能团加以标记.相对抗原
或抗体来说,适配体的稳定性和耐受变性好,且其变性是可逆的,并可长期贮存和在常温下运输
[11]
.

近年来,核酸适配体作为一种分子识别元件,越来越受到关注
[12,13]
.目前,应用核酸适配体荧光

检测蛋白主要是基于适配体与目标蛋白作用后产生的荧光偏振度[14~16]或荧光强度[17~21]的改变来检测
蛋白.核酸适配体荧光检测凝血酶也主要采用这两种方式.由于适配体与核酸作用结合后其分子量发
生变化,从而引起偏振角度变化,用其检测蛋白,其信号变化范围较小,线性范围较窄,并且荧光偏振
对非均相溶液的测定存在一定的局限性.也有人设计分子信标[17~19]或分子开关[16,20,21]与核酸适配体
作用,其荧光强度在核酸适配体与目标蛋白结合前后产生变化(主要是由于分子间距离变化产生的荧
光猝灭或是分子开关微环境变化产生的自猝灭作用),通过荧光强度的改变量来测定蛋白.这类方法
也是通过荧光信号的改变量来测定目标蛋白的,荧光背景较大,线性范围不宽,对于低浓度的蛋白测
定存在一定困难.
本文将一条5c端带氨基修饰核酸适配体通过酰胺化反应固定于磁性纳米颗粒上,利用核酸适配体
与凝血酶的强结合作用捕捉凝血酶分子,通过磁性分离技术去除杂蛋白干扰.另一条带荧光标记的核
酸适配体结合凝血酶的另一位点,用以测定凝血酶的量.由于纳米颗粒载体有巨大的表面能,其表面
有多个结合位点,因此具有较强的DNA携带能力.
磁性纳米颗粒(MNPs)除了具有一般纳米颗粒的特性外,还具有超顺磁性.在外加磁场的作用下,
可较好地分离富集样品.选用无机材料制成的纳米颗粒作为基因载体
[22]
,对细胞毒性小,不易被体内

各种酶消化,是目前最有前景的基因载体材料之一.本文设计的类似三明治结构的传感器以凝血酶的
两条核酸适配体为目标分子识别元件,利用磁性纳米颗粒的磁性分离作用消除了共存蛋白的非特异性
吸附影响,在提高测定选择性和专一性的同时,降低了荧光背景,提高了测定的灵敏度,采集到的荧
光信号稳定,满足了微量分析的要求.

1 实验部分
1.1 试剂与仪器
5c端氨基修饰的核酸适配体Ñ(H2N2ataGGTTGGTGTGGGTTGG23c)和核酸适配体Ò(H2N2ctatc2
AGTCCGTGGTAGGGCAGGTTGGGGTGACT23c)购自上海申能博彩生物科技有限公司.其它化学试剂和
罗丹明B均购自国药集团化学试剂有限公司,所用试剂均为分析纯.EDAC[12Ethyl232(dimethylamin2
opropyl)2carbodiimidehydrochloride]购于瑞士Fluka公司.羧基修饰的磁性纳米颗粒参照文献[23]的方
法合成.凝血酶和牛血清白蛋白(BSA)购自北京鼎国生物技术有限公司.PBS生理缓冲液(011mol/L,
pH=713);Tris缓冲液(0102mol/L,pH=714),其中含01001mol/LMgCl2,01001mol/LCaCl2,
0114mol/LNaCl和01005mol/LKC.l实验用水为超纯水(艾科浦公司生产的实验室级超纯化水),比
电阻达到13M8#cm.
透析袋(MWCO7000,北京鼎国生物技术有限公司),Cary50紫外2可见分光光度计(美国瓦里安技
术中国有限公司),F24500荧光分光光度计(Hitach,日本).
1.2 实验过程
1.2.1 核酸适配体的固定及标记 将核酸适配体Ñ用EDAC经酰胺化反应共价键合到磁性纳米颗粒
表面.通过测定溶液在紫外光谱中的吸收来定量检测固定在磁颗粒表面的核酸适配体.同理,用罗丹
明B(RHB)通过酰胺化反应标记核酸适配体Ò.反应后用透析袋去除溶液中游离的罗丹明B,采用荧
光检测透析后留下的溶液,可观察到罗丹明B较强的荧光,表明此时核酸适配体Ò已标记了荧光分
子.
通过测定溶液中DNA在260nm处的吸光度可以确定已标记了罗丹明B的核酸适配体的浓度.

Fig.1 Schematicrepresentationoffluorescentdetectionforthrombin
1.2.2 荧光检测凝血酶 按图1所示的过程,先将固定了核酸适配体Ñ的磁性纳米颗粒与凝血酶在

2267 No.12 徒永华等:基于核酸适配体的新型荧光纳米生物传感器用于凝血酶的测定
Tris缓冲溶液中于37e恒温培育20min,然后进行磁性分离,洗涤磁性纳米颗粒3次,去除共存蛋白.
再将标记了罗丹明B的核酸适配体加入到溶液中恒温培育20min,然后洗涤5次,磁性分离未键合上
的带荧光标记的核酸适配体.通过检测洗涤后溶液的荧光强度,可对凝血酶进行定性和定量分析.

2 结果与讨论

2.1 检测条件优化
2.1.1 缓冲溶液的选择 凝血酶是一种重要的生理蛋白酶,保持其活性的介质环境为接近体液的生
理环境.保持凝血酶正常生理活性的温度为37e.PBS(011mol/L,pH=713)缓冲液及Tris
(0102mol/L,pH=714)缓冲液均可用作培育凝血酶与核酸适配体的介质环境[24].
如图2所示,凝血酶在PBS(其中含有和Tris缓冲液相同的Mg2+,Ca2+离子浓度)和Tris缓冲溶液
中与核酸适配体共同培育,都可产生相互的亲和作用.实验测得凝血酶在Tris缓冲液中的荧光信号更
强.凝血酶两条核酸适配体以G四分体结构特异性地与凝血酶不同作用位点结合
[18,21,25,26]
.缓冲溶液

中的Mg2+,Ca2+,Na+和K+等离子的浓度对G四分体结构的形成有影响
[24]
.

Fig.2 Theinfluenceofdifferentbuffesonthedetectionresultsofthrombinc(AptamerÑ)=2180@10-10mol/L;c(AptamerÒ)=2150@10-10mol/L.Fig.3 Selectivityofoptimumtimeforincubation
c(Thrombin)=1185@10-10mol/L;
c(AptamerÑ)=3130@10-10mol/L;
c(AptamerÒ)=2177@10-10mol/L.
据文献[22]报道,当缓冲溶液中含有01001mol/LMgCl
2,01001mol/LCaCl2
,0114mol/LNaCl和

01005mol/LKCl时,凝血酶结合核酸适配体的比例较大.由于PBS磷酸缓冲液中的HPO2-4会与Mg
2+

和Ca2+结合形成难溶的分子,造成缓冲溶液中的Mg2+和Ca2+离子浓度降低,使核酸适配体的G四分
体结构受到影响,凝血酶与核酸适配体键合量较少,测得的荧光信号较小.而Tris缓冲液不存在此问
题,溶液中的Mg2+和Ca2+离子浓度不受影响,则测得的荧光信号较大.因此,选择含01001mol/L
Mg
2+和Ca2+
离子的Tris缓冲液作为培育的介质环境.

2.1.2 培育时间的选择 以Tris缓冲液为培育介质进行最佳培育时间的选择试验,结果如图3所示.
在培育初期,随着培育时间的逐渐增加,荧光强度慢慢增强,说明凝血酶结合核酸适配体的量逐渐增
加.培育约20min后荧光强度趋于稳定,在该浓度下,荧光强度基本达到饱和状态,此时凝血酶与核
酸适配体的结合作用基本完成,因此选择20min为核酸适配体与凝血酶的培育时间.
2.2 凝血酶检测的选择性比较
蛋白质检测的选择性是衡量该检测方法优劣的重要因素之一.当以任意DNA系列代替检测中的
一条核酸适配体时,则不能形成三明治结构,在溶液中不能检测到荧光[图4(A)曲线b和c],仅当溶
液中存在与凝血酶两个作用位点特异性结合的两条核酸适配体时才能形成三明治结构[图4(A)曲线
a],这也说明了凝血酶与其特异性核酸适配体一一对应的关系.
当溶液中存在的是牛血清白蛋白时,不能观察到荧光[图4(B)a],即使在凝血酶溶液中共存
1000倍的牛血清白蛋白,也不影响凝血酶的测定,所检测到的荧光强度无明显变化[图4(B)b和c].
表明核酸适配体(Ñ和Ò)是特异性选择结合凝血酶,溶液中荧光强度的大小仅取决于凝血酶的浓度大
小,证明用此传感器检测凝血酶具有很高的选择性.

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