ESI-MS及其原理.
多糖结构分析
多糖结构研究方法多糖及其复合物是来自于高等动、植物细胞膜和微生物细胞壁中的天然大分子物质之一，自然界含量丰富，与人类生活紧密相关，对维持生命活动起至关重要的作用。
多糖和核酸、蛋白质、脂类构成了最基本的4类生命物质。
由于多糖的生物活性与多糖的结构关系密切，因此清楚认识多糖的结构是进行多糖研究和利用的基础。
多糖结构比蛋白质和核酸的结构更加复杂，可以说是自然界中最复杂的生物大分子。
从化学观点来看，多糖结构解析最大的难点就在于其结构的复杂性。
糖的结构分类可沿用蛋白质和核酸的分类方法，即多糖的结构也可分为一级、二级、三级和四级结构。
与蛋白质或核酸大分子相比，糖链的一级结构“含义”要十分丰富。
测定糖链的一级结构，要解决以下几个问题：(1)相对分子质量；(2)糖链的糖基组成，各种单糖组成的摩尔比；(3)有无糖醛酸及具体的糖醛酸类型和比例；(4)各单糖残基的D-或L．构型，毗喃环或呋喃环形式；(5)各个单糖残基之间的连接顺序；(6)每个糖苷键所取的a-或B．异头异构形式；(7)每个糖残基上羟基被取代情况：(8)糖链和非糖部分连接情况；(9)主链和支链连接位点：（10)糖残基可能连接硫酸酯基、乙酰基、磷酸基、甲基的类型等。
多糖的二级结构是指多糖主链间以氢键为主要次级键而形成的有规则的构象，与分子主链的构象有关，不涉及侧链的空间排布；多糖的三级结构和四级结构是指以二级结构为基础，由于糖单位之间的非共价相互作用，导致二级结构在有序的空间里产生的有规则的构象四。
多糖结构的分析手段很多。
不仅有仪器分析法，如红外、核磁共振、质谱等，还有化学方法，如完全酸水解、部分酸水解、高碘酸氧化、Smith降解、甲基化反应等，以及生物学方法，如特异性糖苷酶酶切、免疫学方法等。
1质谱(MS)由于MS法在糖链结构分析中具有快速灵敏，样品用量少、结构信息直观的特点而得到越来越广泛的应用。
近年来各种软电离技术的诞生，如快原子轰击质谱(FAB—MS)，电喷雾质谱(ESI—MS)，基质辅助激光解析离子化质谱(MALDI-MS)等，使得糖结构分析的研究取得了日新月异的发展。
ESI源
电喷雾电离源（ESI源）原理：电喷雾电离源（ESI）作为一种常用的大气压电离源，是基于采用静电场来产生带电液滴，然后通过离子蒸发将被测物离子送入质谱分析的机理，实现被测样品分析的目的。
通过采用强静电场（3-4KV），形成高密度荷电雾状小液滴，在逆向N2气流的作用下，液滴溶剂蒸发，表面积缩小，液滴表面的电荷密度不断增加，直至产生的库伦斥力与液滴本身的表面张力达到瑞利限度（Rayleigh light），液滴裂解形成更小的带电液滴，经过多次的溶剂挥发-雾状液滴裂解后，产生单个的样品气相离子，并以单电荷或多电荷的离子形式经离子光学传输系统聚焦传输后进入质量分析器。
作为一种软电离技术，ESI源能直接分析溶液样品，而不需要像电子轰击、化学电离等常规电离技术存在着对分析样品的加热气化过程，适用于难挥发或热不稳定的化合物。
在过去的几十年间，ESI源已经发展成为一种通用的质谱技术，涵盖的分析应用领域极其广泛，可以分析不挥发和热不稳定的化合物、分子质量范围从10u的小分子到分子量超过106u的生物大分子。
结构：ESI源结构简单，主要由大气压离子化室和离子聚焦透镜构成。
雾化口由双层同心管组成，外层通氮气作为喷雾气体，内层输送流动相机样品溶液，管的材质通常为不锈钢。
雾化口与相距约1cm左右的接地电极之间施加3-4KV的高压，被分析样品溶液从毛细管流出时在高电场及雾化气体的作用下形成高密度电荷的雾状小液滴，在加热氮气的作用下，液滴中的溶剂快速蒸发，直到表面电荷增大到库伦斥力大于表面张力后，小液滴裂解形成更小的子液滴，子液滴中溶剂继续蒸发并再次裂解，此过程循环往复，直至将分析物离子也液态变化成气相状态，在高电场及真空梯度的作用下经传输毛细管进入聚焦传输装置聚焦传输后进入质量分析器分析检测。
但是在其发展的过程中出现过多种接口，代表着发展的各个阶段及技术上的各自特点。
电喷雾电离：在雾化口（喷口）与相距约1cm左右的接地电极之间施加3-4KV的高电压形成强的静电场，此高电压是起关键的离子化条件，ESI接口也因此而得名，早期的接口仅靠此高电压产生喷雾液滴，并进一步分散完成离子化过程，没有使用辅助气体。
液相色谱质谱联用的原理及应用解读
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100
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50
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Mass, amu
质谱原理简介：
质谱分析是先将物质离子化，按离子的质荷比 分离，然后测量各种离子谱峰的强度而实现分 析目的的一种分析方法。以检测器检测到的离 子信号强度为纵坐标，离子质荷比为横坐标所 作的条状图就是我们常见的质谱图。
常见术语:
质荷比: 离子质量(以相对原子量单位计)与它所带电 荷(以电子电量为单位计)的比值,写作m/Z.
Ionic
IonSpray
APCI
Analyte Polarity
GC/MS
Neutral
101
102
103
104
105
Molecular Weight
现代有机和生物质谱进展
在20世纪80及90年代，质谱法经历了两次飞跃。 在此之前，质谱法通常只能测定分子量500Da以 下的小分子化合物。20世纪70年代，出现了场解 吸（FD）离子化技术，能够测定分子量高达 1500~2000Da的非挥发性化合物，但重复性差。 20世纪80年代初发明了快原子质谱法（FABMS），能够分析分子量达数千的多肽。
峰: 质谱图中的离子信号通常称为离子峰或简称峰. 离子丰度: 检测器检测到的离子信号强度. 基峰: 在质谱图中，指定质荷比范围内强度最大的
离子峰称作基峰. 总离子流图；质量色谱图；准分子离子；碎片离子；
多糖结构分析
多糖结构研究方法多糖及其复合物是来自于高等动、植物细胞膜和微生物细胞壁中的天然大分子物质之一，自然界含量丰富，与人类生活紧密相关，对维持生命活动起至关重要的作用。
多糖和核酸、蛋白质、脂类构成了最基本的4类生命物质。
由于多糖的生物活性与多糖的结构关系密切，因此清楚认识多糖的结构是进行多糖研究和利用的基础。
多糖结构比蛋白质和核酸的结构更加复杂，可以说是自然界中最复杂的生物大分子。
从化学观点来看，多糖结构解析最大的难点就在于其结构的复杂性。
糖的结构分类可沿用蛋白质和核酸的分类方法，即多糖的结构也可分为一级、二级、三级和四级结构。
与蛋白质或核酸大分子相比，糖链的一级结构“含义”要十分丰富。
测定糖链的一级结构，要解决以下几个问题：(1)相对分子质量；(2)糖链的糖基组成，各种单糖组成的摩尔比；(3)有无糖醛酸及具体的糖醛酸类型和比例；(4)各单糖残基的D-或L．构型，毗喃环或呋喃环形式；(5)各个单糖残基之间的连接顺序；(6)每个糖苷键所取的a-或B．异头异构形式；(7)每个糖残基上羟基被取代情况：(8)糖链和非糖部分连接情况；(9)主链和支链连接位点：（10)糖残基可能连接硫酸酯基、乙酰基、磷酸基、甲基的类型等。
多糖的二级结构是指多糖主链间以氢键为主要次级键而形成的有规则的构象，与分子主链的构象有关，不涉及侧链的空间排布；多糖的三级结构和四级结构是指以二级结构为基础，由于糖单位之间的非共价相互作用，导致二级结构在有序的空间里产生的有规则的构象四。
多糖结构的分析手段很多。
不仅有仪器分析法，如红外、核磁共振、质谱等，还有化学方法，如完全酸水解、部分酸水解、高碘酸氧化、Smith降解、甲基化反应等，以及生物学方法，如特异性糖苷酶酶切、免疫学方法等。
1质谱(MS)由于MS法在糖链结构分析中具有快速灵敏，样品用量少、结构信息直观的特点而得到越来越广泛的应用。
近年来各种软电离技术的诞生，如快原子轰击质谱(FAB—MS)，电喷雾质谱(ESI—MS)，基质辅助激光解析离子化质谱(MALDI-MS)等，使得糖结构分析的研究取得了日新月异的发展。
HPLC-ESI-MS测定冬虫夏草和蚕蛹虫草中腺苷和虫草素含量
溶剂 采用选择性离子检测 ≥ 和电喷雾离子化 ∞≥ 色谱条件 ≥
∏ ∂ °2 ⁄≥ 色谱柱 流动相水2甲醇2甲酸
Β Β 以 2氯腺苷为内标 ∀ 结果 腺苷回归方程 Ψ
Ξ
ρ
线性范围 ∗
#
虫草素回归方程 Ψ
Ξ
ρ
线性范围 ∗
# 腺苷和虫草素加样回收率
分别为
及
∀ 结论 方法灵敏 !快速和选择性好 可用于冬虫夏草及其代用品中腺苷和虫草素的分析及
虫草素平
∀ 证明此方法重现性良
2 8 选择性和检测限 由图 知 腺苷 !虫草素
和 ≥ 分离良好 由于使用选择性离子检测模式 在
腺苷和虫草素保留时间区域内没有干扰 故本法有
很高的专属性 ∀ 当信噪比为 Β 时 腺苷和虫草素
的检测限 ⁄ 均为
#∀
2 9 回收率实验 精密称取蚕蛹虫草 样品
份 分别加入与试样含量相当的腺苷和虫草素
# 腺苷和虫草素
对照品溶液 按上述 ° ≤2∞≥ 2 ≥ 条件连续测定
次 得腺苷和虫草素与 2氯腺苷峰面积比的平均值
和
≥⁄ 分别为
和
表明精
密度良好 ∀
2 7 重现性试验 以拟定提取方法平行提取 份
蚕蛹虫草 在拟定 ° ≤2∞≥ 2 ≥ 条件下测定 ∀ 结果
腺苷的平均值为
均值 Λ # 好∀
Λ# ≥⁄
≥⁄
ελεχτροπηορεσισ . Ελεχτροπηορεσισ
∆ετερµινατιον οφ αδενοσινε ανδ χορδψχεπιν ιν Χορδψχεπσ σινενσισ ανδ Χ . µιλιταρρισ ωιτη ΗΠΛΧ2ΕΣΙ2 ΜΣ
2
蛋白质质谱 - 丁香园—医学药学生命科学专业网站
缺点：
•可检测到的肽段少，对数据库检索是不利的。 • 肽段分子量精确度往往不够理想，影响鉴定结果。肽段分子质量在 2000以上时，在MALDI-TOF-MS中的分辨率会有所下降 。 •无法进行混合蛋白质鉴定 •翻译后修饰鉴定能力稍低
LTQ（ESI-MS/MS）
由于该质谱具有高效液相分离与MS/MS结构分析功能，可以获得检测到 的每一肽段的序列。根据一级质谱(MS)测得的精确分子质量和串联质谱 (MS/MS)所得的序列信息，通过蛋白质数据库的检索鉴定蛋白质种类。 优点：
总离子可信度
肽段序列
实际分子量 理论分子量
起始氨基酸位置 结束氨基酸位置
肽段离子得分
肽段固定修饰
分子量误差
肽段可信度
MS-MS (SeQuest)
BuildSummary
LTQ质谱（BuildSummary软件）结果说明
唯一肽段数 鉴定的肽段数 搜索到的蛋白 蛋白鉴定覆盖率 蛋白理论分子量 蛋白理论等电点 搜索到的蛋白可能有多个gi号，取最典型的gi号，选取次序为：sp > ref > first gi_number
• MALDI的原理是用激光照射样品与基质形成的共结晶薄膜，基质从激 光中吸收能量传递给生物分子，而电离过程中将质子转移到生物分子 或从生物分子得到质子，而使生物分子电离的过程。因此它是一种软 电离技术，适用于混合物及生物大分子的测定。
• TOF的原理是离子在电场作用下加速飞过飞行管道，根据到达检测器 的飞行时间不同而被检测即测定离子的质荷比（M/Z）与离子的飞行 时间成正比 ，检测离子。
压力差推动质子化样品进入质 量分析器进行检测 。
实验原理
适用样品
• 一般建议样品为溶液或考染胶。若为银染胶，需要采取快 速银染（即同质谱鉴定兼容）的方法染色。 • 溶液中一般不要有SDS、CHAPS、Triton X-100、NP40及 吐温 20、40等系列的去污剂。盐浓度小于50mM • 溶液样品蛋白浓度一般不小于1mg/ml，蛋白总量不小于 10ug。
第二章 有机质谱2
质谱图： ① 分子离子峰提供分子量， ② 碎片峰提供结构信息
复习质谱峰类型 分子在离子源中可产生各种电离，即同一分子可产生多种离子峰：分
子离子峰、同位素离子峰、碎片离子峰、重排离子峰、亚稳离子峰等。
设有机化合物由A，B，C和D组成，当蒸汽分子进入离子源，受到电
子轰击可能发生下列过程而形成各种类型的离子： 分子离子
2、重排（脱掉中性分子）
麦氏（Mclafferty）重排反应
具有以下结构通式的化合物，可进行γ－H重排到不饱和 基团上，并伴随发生β键断裂的麦氏重排反应：
H QZ CY
X
-e
H QZ
CY X
QH Z CY
X
Z
+ QH
C
Y
X
醛、酮、羧酸、酯都可发生麦氏重排，产生特征质谱峰。
OH R
γ
RC
α
β
OH R RC
HN(C2H5)2 73
① H
H3C
- CH2=CH2
②
H2
a
C
. N(C2H5)2
H2C
- CH3
N(C2H5)2
101
86
. ③ i - N(C2H5)2
④ i - CH2=NC2H5
+ C2H5 29
+ C2H5 29
第二章 有机质谱
➢质谱概述 ➢质谱仪及其原理 ➢有机化合物的质谱反应及机理 ➢各类化合物的质谱特征 ➢有机化合物质谱解析 ➢生物质谱技术及联用技术
R' CR Y
R + CR Y
c、含π键的化合物
R1 CH2 CH
CH2
－ e R1 CH2 CH
ms质谱法
质谱法（MS）：原理、应用与实践一、简介质谱法（Mass Spectrometry，简称MS）是一种用于测定物质分子质量和结构分析的实验方法。
它通过将物质转化为离子，并根据其质量/电荷比（m/z）进行分离和检测，实现对物质组成的定量和定性分析。
在这份文档中，我们将详细介绍质谱法的基本原理、仪器组成、不同类型的质谱法以及其在各个领域的应用。
二、质谱法的基本原理质谱法的工作原理可以概括为以下几个步骤：1. 电离：首先，待分析的物质被转化为离子。
这个过程可以通过各种方式实现，包括电子撞击、化学电离、光致电离等。
2. 分离：然后，离子根据其m/z进行分离。
这通常是通过磁场或电场实现的。
3. 检测：最后，分离后的离子被检测和量化。
这通常通过检测离子产生的电子或光子来实现。
三、质谱法的仪器组成质谱仪主要由以下几部分组成：1. 电离源：用于将待分析的物质转化为离子。
2. 质量分析器：用于根据离子的m/z进行分离。
3. 检测器：用于检测和量化离子。
4. 数据处理系统：用于处理检测器产生的信号，生成质谱图。
四、不同类型的质谱法根据不同的电离方法和质量分析器，质谱法可以分为多种类型，包括：1. 电子撞击质谱法（EI-MS）：在这种方法中，待分析的物质被电子撞击后转化为离子。
2. 磁扇质谱法（MASS）：在这种方法中，离子在磁场中运动，根据其m/z进行分离。
3. 飞行时间质谱法（TOF-MS）：在这种方法中，离子在电场中飞行，根据其m/z 和飞行时间进行分离。
4. 电喷雾质谱法（ESI-MS）：在这种方法中，待分析的物质在电喷雾作用下转化为离子。
五、质谱法的应用质谱法在许多领域都有广泛的应用，包括：1. 生物医学：在生物医学研究中，质谱法被用于蛋白质组学、代谢组学等领域的研究。
2. 环境科学：在环境科学中，质谱法被用于监测环境中的污染物。
3. 化学分析：在化学分析中，质谱法被用于确定化合物的结构和纯度。
4. 食品安全：在食品安全领域，质谱法被用于检测食品中的有害物质。
质谱
三、碎片离子
分子离子往往具有过剩的能量，很容易 经过裂解生成碎片离子（fragment ion）。 生成的碎片离子可能再次裂解，生成质量更 小的碎片离子，另外裂解同时也可能发生重 排，所以在化合物的质谱中，常可看到许多 碎片离子峰。掌握离子的开裂规律，对利用 质谱推测化合物的结构是有帮助的。
MALDI
电喷雾电离 Electrospray Ionization, ESI 大气压化学电离 Atmospheric Pressure Chemical Ionization, APCI
电子轰击电离 EI
电子轰击电离又称为电子轰击，或电子电离。是应用 最普遍，发展最成熟的电离方法。
轰击电压 50-70eV, 有机分子的电离电位一般为715eV。
各类化合物的分子离子（M+ ）按稳定性可以 排序如下： 芳环（包括芳杂环）＞脂环＞硫醚和疏酮＞ 共轭烯＞直链烷烃＞酰胺＞酮＞醛＞胺＞脂 ＞醚＞羧酸＞支链烃＞腈＞伯醇＞叔醇＞缩 醛．
芳环、共轭烯及硫化物由于电荷离域而稳 定。脂环至少要断裂2个键才能裂解成碎片， 而造成分于离子峰稳定。
直链酮、酯、醛、酰胺、醚和卤化物的分 子中的氧或氮原子上的孤电子对可以稳定 碎片离子中的正电荷中心，使得分于离子 容易裂解，造成分子离子峰弱．
a.只看到丢失小基团的峰，不出现M＋，那么可以由 合理的峰推测M＋。
b.如果观察到比最高质荷比小3～14原子质量单位的 峰，那么最高质荷比的峰很可能不是分子离子峰。 丢失许多个氢原子（或分子）需要很高的能量，不 大可能发生。亚甲基是高能量的中性碎片，从分子 离子峰丢失CH2 的质谱现象也不大容易发生。图谱 中一旦出现丢失14原子质量单位的峰，就应怀疑样 品中混有一个比被测化合物少一个CH2 的同系物。 若出现比最高质荷比小3原子质量单位的峰，可能意 味着分子离子峰应比最高质荷比的峰大 15原子质量 单位，或者说比次高质荷比的峰大18原子质量单位。 它们分别与分子离子丢失甲基（得到最高质荷比的 峰）丢失水（得到次高核质比的峰）相对应。
布鲁克-LC-ESI-MS(Q-TOF)操作流程及注意事项
LC-ESI-MS(Q-TOF)操作流程及注意事项一、前期处理及注意事项1、流动相需现用现配且需是进口、色谱级，使用前需抽滤、超声至少30min排除气泡。
2、色谱柱需冲平(压力持平、无杂质信号峰）方可连接质谱。
3、样品使用前需用流动相稀释1-2次，且根据相似相容原理，流动相需与样品兼容（即样品在流动相中不沉淀析出。
）4、样品使用前需过膜以去除不溶性杂质。
5、浓度需稀释为普通液相的50-100倍，防止污染离子源。
6、流速最大0.2-0.4ml/min（流速过大会导致压力过高损坏仪器）。
二、软件功能1、Chromelon Xpress（变色龙软件）：编辑液相相关参数2、Otocontrol:编辑质谱参数及方法3、Hystar：将变色龙及Otocontrol兼容4、Compass DataAnalysis：数据处理软件5、Otof Acquisition Engine:数据采集三、操作步骤1、换流动相：A、C：水相；B、D：有机相。
2、排汽泡：打开1、Chromelon Xpress软件——〉Home（左上角第一个键）——〉connect——〉take control（断开液相与Hystar的连接，并将其与Chromelon Xpress连接，连接上后方可在变色龙软件操作）——〉HPG-3400RS（左偏上）——〉 purge(打开排汽泡开关，默认流速4ml/min).3、洗进样针、注射器、及缓冲循环器：Chromelon Xpress——〉Sampler——〉Start up——〉分别点击Prime syringe、wash Buffer loop、Wash Needle Externally下方的START键，系统开始自动清洗。
4、温度控制：Temperature control(根据实验需要设置)。
5、DAD：根据实验需要设置波长、温度、紫外、可见光控制器等。
6、设置方法7、冲洗色谱柱8、进样Note：为防止污染离子源，前5分钟液相管路不要与质谱连接）9、结束：断开液相与质谱的连接，禁止样品进入离子源10、冲洗色谱柱11、更换流动相（切记先将流速设为0，否则色谱柱会进气泡）12、让负责该仪器同学检查仪器、关掉液相模块，结束实验并用格式化的U盘拷贝数据。
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六反相液体色谱法与ESI反相液体色谱法（reversed phase liquid chromatography, RPLC）与ESIMS联用是广泛应用的LC/MS技术。RPLC要求待测物质以非解离状态（或部分解离状态）存在于流动相，以在固定相中得到保留；而ESI则希望待测物质解离成离子存在于溶液中，以利于气相离子的形成。因此，好的RPLC条件，可能是“坏的”ESIMS条件。
为了得到好的LC/ESIMS结果，对于RPLC不宜应用非挥发性和低挥发性的磷酸盐、酸、碱及强离子对试剂。可以通过用甲酸、乙酸或氨及其缓冲溶液调节溶液pH，控制RPLC的保留。pH值和pKa对碱性化合物保留时间的影响（图8）
谢谢！