基因治疗(gene
基因治疗产品的质量控制分析方法及研究进展
Research progress in quality control analysis methods for gene therapy products*
示产品含量即病毒数量的指标。病毒滴度分为总颗
20 日， 网站的数据显示全球已登记基 粒数、基因组滴度、感染性滴度、转导滴度等不同的类
因治疗临床试验总数为 4 091 项，其中美国 2 198 项， 型。总颗粒数和基因组滴度表示病毒的物的研究开发以及规模 物理滴度；感染性滴度和转导滴度表示有生物活性
滴度法所测得的结果。
转基因的表达产生影响。因此，较为理想的转导滴
1.2.3 感染性滴度 感染性滴度指标表示产品中 度测定方法是采用与病人体内靶细胞相同类型的细
具 有 感 染 性 病 毒 颗 粒 的 总 数。 感 染 性 滴 度 测 定 的 传 统 方 法 是 噬 斑（PFU）法 和 半 数 组 织 细 胞 感 染 量 （TCID50）法［20］。 这 些 方 法 主 要 依 靠 人 为 识 别 噬 斑 或细胞病变作为计数判定的依据，造成测定结果的
Chinese Journal of Pharmaceutical Analysis
药 物 分 析 杂 志 Chin J Pharm Anal 2020,40(1)
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基因治疗（gene therapy）是指将外源正常基因 因进行鉴定。限制性酶切图谱分析中需要选用适当
导入靶细胞，以纠正或补偿基因缺陷和异常引起的 的内切酶，必要时可使用多个内切酶，使切得的 DNA
Abstract：In recent years，gene therapy products have become a hot spot in drug R&D at home and abroad. For the gene therapy products in R&D stage，quality research should be conducted to establish corresponding quality control methods and standards，which is an important guarantee for product safety and effectiveness and one of the important steps in the industrialization process. Quality control items of gene therapy products include identification，content，potency，purity，impurities and other routine test items，etc. This paper describes in detail the analytical methods that can be used for these quality control items in various gene therapy products. For novel gene therapy products，it is urgent to develop appropriate analytical methods for effective quality control，while the quality control methods and standards for products which have already been approved for market or clinical research need to be further improved and perfected. Keywords：gene therapy products；quality control；quality requirement；analytical methods；safety；effectiveness； identification test；content；potency；purity；impurity
遗传学常用术语
基因(gene)与基因组(genome)基因：遗传的基本物理单位，从亲代传到子代，并含有确定性状所需要的信息。
基因在被称作染色体的结构上依次线性排列。
一条染色体只包含一条很长的DNA分子，而仅有DNA其中的一小段对应于单个基因。
人类染色体上大约有２万个编码蛋白质的基因。
基因组：细胞内的整套遗传物质。
人类基因组由细胞核内的２３对染色体和线粒体中一条较小的染色体组成。
这些染色体合计起来约有３１亿个碱基长的ＤＮＡ序列。
单基因的(monogenic)与多基因的（polygenic）单基因的：一种特征或疾病是由单个基因的个体作用所控制(见于经典的孟德尔疾病)。
多基因的：一种特征或疾病是由多个（>3）基因共同作用所控制。
外显子(exon)一个基因中用于编码氨基酸的部分。
在植物和动物细胞中，大多数基因序列被一段或几段被称为内含子的DNA序列所打断。
这类基因中，那些编码蛋白质的序列被称为外显子，因为这部分序列在蛋白质中表达了；而那些没有被表达的序列则被称为内含子，夹在外显子中间。
表型（phenoty pe）有机体的外观或其他特征，是由其遗传组成与环境因素相互作用引起。
杂合子的（heterozygous）、复合杂合子（compound heterozygote）、纯合子的（homozygous）杂合子的：在一个特定的位点上存在两个不同的等位基因。
复合杂合子：一个个体由于基因的每个拷贝发生不同的突变而导致其功能发生变化，如一个患有囊性纤维化个体的CFTR基因的基因型为△F508/G542X，即在同一个位点的两个等位基因上有两个突变。
纯合子的：在一个特定的位点上存在两个相同的等位基因。
显性（dominant）与隐性（recessi v e）显性：突变等位基因相对于野生型等位基因为显性的一种特征，即当遗传了一个突变等位基因拷贝时就会导致疾病表现，如软骨发育不全。
基因药物和基因治疗及健康出生
3.基因治疗的类型
生殖细胞基因治疗（Germline gene therapy ）: 是在生殖细胞中进行操作, 改变生殖细胞的程序, 这 些细胞能将改变传递给下一代, 使其后代从此再不 会得这种遗传疾病。
体细胞基因治疗（Somatic gene therapy ）:是 在体细胞中进行基因操作, 以改变身体已分化细胞 DNA的程序, 但这些细胞没有能力将这种改变传递 给一代, 其子孙后代仍会患这种病。
程方法生产的胰岛素投入市场, 售价
降低了30%-50%。
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• 基因工程药品 —— 干扰素
干扰素是病毒侵入细胞后产生的一种糖蛋白。干扰素几 乎能抵抗所有病毒引起的感染, 是一种抗病毒的特效药。此 外干扰素对治疗某些癌症和白血病也有一定疗效。
传统的干扰素生产方法是从人血液中的白细胞内提取, 每 300L血液只能提取出1mg干扰素。1980-1982年, 科学家 用基因工程方法在大肠杆菌及酵母菌细胞内获得了干扰素, 是传统的生产量的12万倍。1987年上述干扰素大量投放市 场。
不稳
Hb Grady
α118与119间插入3个氨基酸 无27明
2.基因病的传统疗法
酶 苯丙氨酸
酪氨酸(正常)
正常酶无法合成
苯丙酮酸
积累
损伤 神经
另一种酶
系统
12号染色体苯丙氨酸羧化酶基因突变
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糖原储积症: 溶酶体中缺少a-1.4糖苷酶,不能将糖原转化成葡萄糖,心肌造成损 伤,2岁前夭折
半乳糖血症: 常染色体隐形遗传病,缺少半乳糖-1-磷酸尿苷酰转移酶,半乳糖不能 转化成葡萄糖,半乳糖积累,患儿生长停滞,智力迟钝,肝脏受损死亡, 还可引发白内障.
C 蛋白
猪
1 克/升 三期临床
基因诊断与基因治疗
（1）DNA模板的变性 DNA模板的变性 模板的
将待扩增DNA加热到95 左右，使双链DNA DNA解开成 将待扩增DNA加热到950C左右，使双链DNA解开成 DNA加热到
使模板DNA或延伸后的双链DNA DNA或延伸后的双链DNA发生热变性 为单链（即：使模板DNA或延伸后的双链DNA发生热变性 ），
PCR技术在模板、dNTP、Mg2+等条件下，用耐热 技术在模板、dNTP、 等条件下， 技术在模板 Taq酶代替DNA聚合酶 用合成的DNA引物代替RNA 酶代替DNA聚合酶， DNA引物代替RNA引 的Taq酶代替DNA聚合酶，用合成的DNA引物代替RNA引 经过DNA变性、引物与模板结合 复性）和延伸3 DNA变性 模板结合（ 物，经过DNA变性、引物与模板结合（复性）和延伸3 个步骤的循环过程（25∼30个循环），目的DNA可 个循环），目的DNA 个步骤的循环过程（25∼30个循环），目的DNA可扩增 100万倍以上 万倍以上。 100万倍以上。
并游离于反应体系中作为模板； 并游离于反应体系中作为模板；
（2）模板与引物的结合（退火或复性） 模板与引物的结合（退火或复性）
将体系温度降至合适温度（ 左右） 将体系温度降至合适温度 （ 550C 左右 ） ， 使加入 的引物与模板DNA两端 碱基序列互补结合。 的引物与模板DNA两端（3ˊ端）碱基序列互补结合。 DNA两端（
固 相 支 持 物
B
本法优点： 本法优点：
16 特异性强，对样本纯度要求不高，定量较准确。 特异性强，对样本纯度要求不高，定量较准确。
situ） （6）原位杂交（nucleic acid hybridization in situ） 将标记探针与细胞或组织切片中的核酸进行杂交， 将标记探针与细胞或组织切片中的核酸进行杂交， 进而检测特异的DNA RNA序列 DNA或 序列。 进而检测特异的DNA或RNA序列。 有 细胞原位杂交 组织切片原位杂交 三类杂交
基因治疗临床试验概述
基因治疗临床试验概述基因疗法从被发明应用，到如今的蓬勃发展，其进程可谓一波三折。
随着越来越多基因治疗产品上市，基因治疗的征程已获得里程碑性胜利。
从目前已获批产品和未获批的产品临床试验进程来看，基因治疗具有广阔前景。
近日，发表在BIOMEDICINE & PHARMACOTHERAPY上题为Gene th erapy clinical trials, where do we go? An overview的综述中，作者简要回顾了基因治疗的历史，总结了目前基因治疗的主要领域及涉及的临床试验。
基因治疗的发展历史基因治疗的历史可以分为基础研究、临床实验开始、萧条到繁荣以及未来的发展这四个阶段。
下文将对每个阶段的时间及发生的主要事件进行详述。
1.1 基础研究阶段（1909-1973）基因治疗之旅始于Wilhelm Johannsen创造了“基因（gene）”一词。
Francis Crick和James Watson在大约半个世纪后发现了DN A双螺旋结构。
“基因工程（genetic engineering）”一词最早是在20世纪30年代开始使用。
在20世纪60年代，人们发现了细菌中基因转移的基本原理，并根据这些原理发展了真核细胞的基因转移技术。
20世纪70年代首次描述的限制性内切酶和连接酶构成了基因操作的基础。
重组DNA技术使研究人员能够将选定的治疗基因导入工程载体。
随着病毒转移遗传物质的能力被发现，病毒载体逐渐成为一种有前途的基因转移工具。
这些技术进步使科学家成功应用基因治疗载体将特定遗传物质转移到靶细胞从而实现治疗目的。
1.2 临床试验开始阶段（1989-2003）基因治疗临床阶段始于1989年，一种逆转录病毒被应用于新霉素耐药标记，用来追踪黑色素瘤免疫治疗中的浸润性淋巴细胞。
第一次成功的基因治疗临床试验于1990年在宾夕法尼亚大学启动，在一名被诊断为重症联合免疫缺陷病（SCID）的四岁女孩体内应用：该试验使用逆转录病毒载体将正常拷贝的腺苷脱氨酶（ADA）基因转移到患者的T细胞后，令机体产生ADA的能力提高。
基因治疗
腺病毒可插入的外源基因可达7.5kb。
人们对腺病毒的基因组构造非常了解，以它作
为基因治疗的载体比较容易控制。
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腺病毒作为基因载体也存在某些缺点： ①重组的病毒DNA是以游离的形式存在于细胞 中，因而基因表达的时间较短，不能满足基因 长期表达的需要；如需进行长期表达，必须反 ②重组腺病毒载体的反复使用，有可能会诱发
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治疗基本步骤:
ADA基因+逆转录病毒载体
导入患者淋巴细胞
体外扩增
回输病人体内
淋巴细胞ADA酶恢复至正常水平的5%-10%
维持免疫系统功能,改善病人症状
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腺苷脱氨酶(ADA)缺乏的 严重联合免疫缺陷(SCID)
第一个基因临床治疗的方案(1990.9.14,NIH)
• 病因: • 淋巴细胞缺乏ADA酶 腺苷、dATP堆积
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这项研究揭示了基因治疗方法的潜力，但是同时也表 现出了基因治疗的有限性，产生的毛细胞可以像正常细胞
那样产生电信号，并且与神经元联系；然而当幼年小鼠使
用基因治疗后两周，Atoh1基因的效应就会减弱。相关研究 成果刊登在了5月9日的国际杂志Journal of Neuroscience 上。
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四川大学华西医学中心研究人员采用反 义核酸阻断生物钟基因表达的方法，对小鼠进 行戒毒实验，发现可以阻断生物钟基因参与调
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张康的研究小组比较了600例视网膜萎 缩和非萎缩病人之间TLR3的差异. 发现 TLR3某些突变可以保护病人免受进一步的 炎症性萎缩。携带保护型突变TLR3的病人 比正常基因型的病人罹患视网膜萎缩的危 险低得多,程度取决于携带突变的比例.而相 比之下,携带非保护型突变的病人则更容易 被小RNA诱发出萎缩。
基因治疗
以病毒为载体进行基因治疗示意图
逆转录病毒载体( retrovirus )
逆转录病毒（双链RNA病毒）
Ψ序列，其编码产物 能有效包装病毒基因 组进入病毒颗粒 病毒基因gag,pol, env,分别编码结构 蛋白，酶蛋白，被 膜蛋白，是整合入 宿主基因组必需的。
黑色素瘤的基因治疗
TNF
＋
肿瘤细胞
病人臀部
3周后切取 淋巴结 扩增的T细胞 ＋ IL－2
病人
3、病毒性疾病的基因治疗
(1) 转导抗病毒细胞因子基因 (干扰素，白细胞介素类)
(2) 反义技术 1 ）反义 RNA 与病毒的前 mRNA （ pre-mRNA ）相结合， 可使mRNA前体不能进行正确剪切，成熟的 mRNA不能形 成。 2 ）反义 RNA 与 mRNA 形成杂交体，使 mRNA 翻译功能受 到抑制。同时，杂交体可激活内源性 RNase( 如 RNaseH 等 ) ， 使杂交体降解。 3）反义RNA结合在 mRNA分子核糖体结合的位点上，使 rRNA不能 与 mRNA正确结合，也就不能翻译成蛋白质.
STEP 4
INFECTING THE TARGET ELL
逆转录病毒载体的主要优点：
(1)宿主范围广泛，能感染不同生物种类的多种细胞类型；
(2)感染效率高（-100%）；
(3)能将外源基因整合到宿主细胞的基因组中，使之在宿主 细胞中稳定存在，不易丢失;
逆转录病毒载体的主要缺点为：
繁殖滴度低，目前能达到的滴度(107)达不到治疗大肿瘤 所需的滴度; 包装容量较小，容纳外源基因的DNA长度为不大于8kb； 只能感染处于分裂期的细胞; 在血液循环中可激活补体系统而被补体灭活； 靶细胞重要功能基因的插入失活和原癌基因激活
恶性肿瘤的基因治疗 (2)
者体内； 后者是将重组基因导入相应的宿主细胞，如
细菌、酵母或哺乳动物细胞，在体外进行扩 增并经分离、纯化后，获得其表达的蛋白产 物（如生长因子、可溶性受体等）。
基因治疗发展史
从20世纪80年代起至今，经历了三个阶段：
（一）准备期（1980-1989）：基因治疗的“禁锢时代”。1990年 批准正式临床实验。关键人物：French Aderson、Steve Rosenberg、 Michael Blease
肿瘤在中国上市
基因治疗基本原理
二、基因治疗的基因导入系统
II：基因治疗导入系统（载体）
基因治疗的核心技术
病毒 (复制缺陷病毒)
优缺点
逆转录病毒 单纯疱疹病毒 腺相关病毒 腺病毒 慢病毒 痘苗病毒
转染效率高 可短暂或持久表达 免疫原性较强 转基因大小有限
Hale Waihona Puke 化学和物理方法（非病毒）裸DNA （基因枪，水压法） 磷酸钙 脂质体 ✓配体/阳离子多聚物/DNA 复合物
具有一定的包装容量，一般来说，病毒包装容量不超过自身基因组大小 的105～110％。需将适当长度的外源DNA插入病毒基因组的非必需区， 包装成重组病毒颗粒。
缺点： 大多数野生型病毒对机体都具有致病性：需对其进行改造才能用于人体 插入外源DNA的长度受到很大限制：删除病毒的必需/非必需基因，这些
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基因治疗的靶细胞
1. 基因缺陷的细胞: 受体缺陷细胞， 肿瘤细胞等 2. 广泛的细胞类型: 造血干细胞 皮肤成纤维细胞 血液淋巴细胞 肌细胞 肝细胞 骨髓基质细胞
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基因治疗靶细胞的选择
可根据疾病的特点、目的基因及其转移的 方式等因素来确定。
第七章++基因治疗
肽链合成减少，引
起患者溶血性贫血
。
β 地贫的基因治疗
基因转移的治疗 向患者的造血干细胞导入正常的β珠蛋白基因 反义核酸修复 通过反义核酸与目标mRNA特异性杂交，导致异常表达 的mRNA降解，或修饰mRNA的剪接或阻碍的翻译。
3. 囊性纤维化（CF）
cftr基因突变引起 正常的CFTR引导氯离子穿过细胞 膜 患者肺细胞分泌过量的黏液，呼 吸困难
溶液类型对基因表 达有影响：
重组DNA可贮存 于5%~30%的蔗 糖溶液中 也可用生理盐 水或PBS
裸露DNA的转移方法
直接注射法
电穿孔法
微粒子轰击法
2. 脂质体法
人造单层膜，是一 种脂质双层包围水 溶液的脂质微球.
结构和性质与细胞 膜极为相似，二者 易于融合，DNA由于 细胞的内吞作用进 入细胞。
IVa2和VA均为病毒RNA聚合酶的亚基编码基因。
腺病毒载体的构建
第一代腺病毒载体缺少E1a和 E1b基因，取代的是治疗基因。 包装细胞基因组含有E1基因；但第一代腺病毒载体产生炎症， 而且基因表达快速衰退；
第二代腺病毒载体在删除E1的基础上，或者突变E2区或直接 除掉E2或E4区，基因型为E1－\E2－或E1－\E4－。由于保留有 E3区，可抑制宿主的免疫反应。 第三代腺病毒载体正在开发，目的是尽可能多删除全部的反 式序列基因，以降低病毒基因的表达，但腺病毒载体的生产 及治疗基因在细胞内的稳定性可能有影响。
复制缺陷型病毒
可感染分裂和非分裂细胞 病毒颗粒稳定，易于浓缩和纯化 可导入多种靶细胞，并持续表达 无致癌性
Gelsinger Case
基因的英语名词解释
基因的英语名词解释基因（gene）作为生物学和遗传学领域中的重要概念，是指存在于DNA分子中的遗传信息单位。
它被广泛认为是生物遗传信息的基本单位，也是生命进化和发展的基础。
基因决定了生物体的性状和特征，包括外观、行为以及许多疾病的发生与发展。
基因是由核苷酸（nucleotide）序列组成的DNA片段，其中包括腺嘌呤（adenine）、胸腺嘧啶（thymine）、鸟嘌呤（guanine）和胞嘧啶（cytosine）四种碱基。
这些碱基以不同的顺序排列，形成了基因的遗传密码。
这个密码会被描述为A（adenine）与T（thymine）之间的配对关系，以及C（cytosine）与G（guanine）之间的配对关系。
基因不仅存在于人类和其他动物的细胞中，也存在于植物、微生物等各种生物体中。
它们被储存在染色体（chromosome）上，每个基因都位于染色体上特定的位置，称为基因座（locus）。
人类染色体中大约有数万个基因。
基因通过遗传传递给后代，决定了它们的遗传特征。
人的基因通常由父母各自提供一半，这解释了为什么我们会拥有来自父母的遗传特征。
然而，我们并不完全继承父母的所有基因，因为在基因的遗传过程中可能会发生突变（mutation）。
突变是基因序列发生改变的过程，它可以是无害的或有害的，有时甚至可以带来一些新的优势。
基因不仅仅决定着我们的外貌和性状，也在很大程度上影响我们的健康状况。
一些基因突变会导致遗传性疾病的出现，比如囊性纤维化（cystic fibrosis）和遗传性视网膜变性（retinitis pigmentosa）。
同时，一些基因也与疾病的易感性有关，如乳腺癌（breast cancer）和帕金森病（Parkinson's disease）等。
通过研究基因和相关遗传变异，科学家能够更好地理解疾病的发生机制，并寻找相应的治疗方法。
基因在现代生物科学中发挥着重要的作用。
通过基因工程技术，科学家们能够对基因进行编辑和改变，以实现特定的目的。