温度和培养基在申克孢子丝菌酵母相转化中的作用研究

第３１卷第４期　２０１０年７月　中山大学学报（医学科学版）　
ＪＯＵＲＮＡＬ　ＯＦ　ＳＵＮ　ＹＡＴ—ＳＥＮ　ＵＮＩＶＥＲＳＩＴＹ（ＭＥＤＩＣＡＬ　ＳＣＩＥＮＣＥＳ）　
Ｖ０Ｉ．３１　Ｎｏ．４　

Ｊｕ１．２０１０　

温度和培养基在申克孢子丝菌酵母相转化中的作用研究　
张静・．一，黄怀球¨，薛汝增　，张晓辉　，冯佩英　，李美荣　
（１．中山大学附属第三医院皮肤性病科，广东广州５１０６３０；２．中山大学孙逸仙纪念医院皮肤性病科，广东广州５１０１２０；　
３．广东省皮肤性病防治中心，广东广州５１００００）　

摘要：【目的】探讨不同温度和培养基在申克孢子丝菌酵母相转化中的作用。【方法】将４株临床分离菌株分别接种　
于ＳＤＡ、ＰＤＡ、ＢＨＩ、５０　ｍｇ／ｋｇ羊血ＢＨＩ及５　ｍｇ／ｋｇ　ＧＳＢＨＩ　５种培养基平皿上，每种培养基接种５个平皿，分别置于２５℃、３５　
℃、３６℃、３７。ｃ及３８℃含体积百分数为５％ＣＯ　的恒温箱中培养。观察菌落生长情况并计算酵母细胞转化率。【结果】在３８　
℃，平皿转化率为２５％（只有１株菌发生了转化）；在３５　和３７℃时，平皿转化率分别是６０％和８５％；而在３６℃时平皿转化　
率仅为４５％。使用５０　ｍｇ／ｋｇ羊血ＢＨＩ和Ｏ．５％ＧＳＢＨＩ培养基培养。６５％培养皿上的菌株发生了酵母相转化，使用ＢＨＩ培养基　
培养．４５％培养皿上的菌株发生了酵母相转化．而使用ＳＤＡ和ＰＤＡ培养基培养，只有２０％培养皿上的菌株发生了酵母相转　
化。３７℃时，有３株菌在ＢＨＩ、５０　ｍｇ／ｋｇ羊血ＢＨＩ和５　ｍｇ／ｋｇ　ＧＳＢＨＩ培养基上的酵母细胞转化率均达到９０％，１株菌在　
ＳＤＡ、ＰＤＡ和ＢＨＩ培养基上的转化率均低于１０％。【结论】温度是影响申克孢子丝菌酵母相转化的关键因素，培养基的营养　
成分亦是影响转化效果的重要因素。　
关键词：申克孢子丝菌；酵母相转化：温度；培养基　
中图分类号：Ｒ３７　文献标志码：Ａ　文章编号：１６７２—３５５４（２０１０）０４—０４９１—０５　

Ｅｆｆｅｃｔ　ｏｆ　Ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ　ａｎｄ　Ｍｅｄｉａ　ｏｎ　Ｍｙｃｅｌｉｕｍ・－ｔｏ・－ｙｅａｓｔ　Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ　
ｏｆ　Ｓｐｏｒｏｔｈｒｉｘ　ｓｃｈｅｎｃｋｉｉ　

ＺＨＡＮＧ　Ｊｉｎｇ　’　，ＨＵＡＮＧ　Ｈｕａｉ・ｑｉｕ　，ＸＵＥ　Ｒｕ—ｚｅｎｇ３，ＺＨＡＮＧ　Ｘｉａｏ—ｈｕｉ　，ＦＥＮＧ　Ｐｅｉ—ｙｉｎｇ　，ＬＩ　Ｍｅｉ—ｒｏｎｇ　
（１．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ　ｏｆ　Ｄｅｒｍａｔｏｌｏｇｙ　ａｎｄ　Ｖｅｎｅｒｅｏｌｏｇｙ，Ｔｈｅ　Ｔｈｉｒｄ　Ａｆｆｉｌｉａｔｅｄ　Ｈｏｓｐｉｔａｌ，Ｓｕｎ　ｒａｔ—ｓｅｎ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｇｕａｎｇｚｈｏｕ　５　１０６３０，　
Ｃｈｉｎａ；２．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ　ｏｆ　Ｄｅｒｍａｔｏｌｏｇｙ　ａｎｄ　Ｖｅｎｅｒｅｏｌｏｇｙ，Ｓｕｎ　Ｙａｔ—ｓｅｎ　Ｍｅｍｏｒｉａｌ　Ｈｏｓｐｉｔａｌ，Ｓｕｎ　Ｙａｔ－ｓｅｎ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，　
Ｇｕａｎｇｚｈｏｕ　５　１０６３０，Ｃｈｉｎａ；３．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ　ｏｆ　Ｄｅｒｍａｔｏｌｏｇｙ，Ｇｕａｎｇｄｏｎｇ　Ｃｅｎｔｅｒ　ｆｏｒ　Ｓｋｉｎ　Ｄｉｓｅａｓｅ　ａｎｄ　ＳＴＩ　Ｃｏｎｔｒｏｌ，　
Ｇｕａｎｇｚｈｏｕ　５　１００００，Ｃｈｉｎａ）　

Ａｂｓｔｒａｃｔ：【Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ】Ｔｏ　ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅ　ｔｈｅ　ｅｆｆｅｃｔ　ｏｆ　ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ　ａｎｄ　ｍｅｄｉａ　ｏｎ　ｍｙｃｅｌｉｕｍ—ｔｏ—ｙｅａｓｔ　ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ　ｏｆ却ｏｒｏｔｈｒｉｘ　
ｓｃｈｅｎｃｋｉｉ．【Ｍｅｔｈｏｄｓ】Ｔｈｅ　ｃｌｉｎｉｃａｌ　ｉｓｏｌａｔｅｓ　４　ｗｅｒｅ　ｉｎｏｃｕｌａｔｅｄ　ｏｎ　ｐｌａｔｅｓ　ｏｆ　ｍｅｄｉａ　ａｆｔｅｒ　ｒｅａｃｔｉｖａｔｉｏｎ．Ｅａｃｈ　ｉｓｏｌａｔｅ　ｗａｓ　ｉｎｏｃｕｌａｔｅｄ　ｏｎ　
ｐｌａｔｅｓ　ｏｆ　ＳＤＡ，ＰＤＡ，ＢＨＩ，５０　ｍｇ／ｋｇ　ｇｏａｔ　ｂｌｏｏｄ　ＢＨＩ　ａｎｄ　５　ｍｇ／ｋｇ　ＧＳＢＨＩ，ａｎｄ　５　ｐｌａｔｅｓ　ｏｆ　ｅａｃｈ　ｍｅｄｉａ　ｗｅｒｅ　ｐｒｅｐａｒｅｄ　ｂｅｃａｕｓｅ　
ｉｓｏｌａｔｅｓ　ｏｆ　ｅａｃｈ　ｍｅｉｄａ　ｗｅｒｅ　ｉｎｃｕｂａｔｅｄ　ａｔ　２５　ｏＣ，３５　ｏＣ，３６　ｏＣ，３７　ｏＣ，ａｎｄ　３８℃．Ｇｒｏｗｔｈ　ｏｆ　Ｓｐｏｒｏｔｈｒｉｘ　８ｃｈｅｎｃｋｉｉ　ｗａｓ　ｏｂｓｅｒｖｅｄ　
ａｎｄ　ｒａｔｅｓ　ｏｆ　ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ　ｗｅｒｅ　ｃａｌｃｕｌａｔｅｄ．【Ｒｅｓｕｌｔｓ】Ａｔ　３８　ｏＣ，ｔｈｅ　ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎｓ　ｒａｔｅｓ　ｗｅｒｅ　２５％（ｔｈｅ　ｏｎｌｙ　ｏｎｅ　Ｓｔｒａｉｎ　ｃｏｎｖｅｒｔｅｄ　
ｙｅａｓｔ）．Ａｔ　３５　ｏＣ　ａｎｄ　３７　ｏＣ，ｔｈｅ　ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎｓ　ｒａｔｅｓ　ｗｅｒｅ　６０％ａｎｄ　８５％．ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ．Ａｔ　３６℃，ｔｈｅ　ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎｓ　ｒａｔｅｓ　ｗｅｒｅ　
４５％．Ｔｈｅｒｅ　ｗｅｒｅ　１３　ｏｆ　２０　ｐｌａｔｅｓ　ｃｏｎｖｅｒｔｉｎｇ　ｙｅａｓｔ　ｗｈｅｎ　５％ｇｏａｔ　ｂｌｏｏｄ　ＢＨＩ　ａｎｄ　０．５％ＧＳＢＨ１　ｗｅｒｅ　ｕｓｅｄ．９　ｏｆ　２０　ｐｌａｔｅｓ　ｗｈｅｎ　ＢＨ１　
ｗａｓ　ｕｓｅｄ，４　ｏｆ　２０　ｐｌａｔｅｓ　ｗｈｅｎ　ＳＤＡ　ａｎｄ　ＰＤＡ　ｗｅｒｅ　ｕｓｅｄ．Ａｔ　３７　ｏＣ．ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ　ｒａｔｅｓ　ｏｆ　３　ｉｓｏｌａｔｅｓ　ｒｅａｃｈｅｄ　９０％ｏｎ　ｍｅｄｉｕｍ　ｏｆ　
ＢＨＩ，５０　ｍｇ／ｋｇ　ｇｏａｔ　ｂｌｏｏｄ　ＢＨＩ和５　ｍｇ／ｋｇ　ＧＳＢＨＩ；Ｈｏｗｅｖｅｒ，ｔｈｅ　ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ　ｒａｔｅｓ　ｏｆ　１　ｉｓｏｌａｔｅ　ｗｅｒｅ　ｌｅｓｓ　ｔｈａｎ　１０％ｏｕ　
ＳＤＡ，ＰＤＡ，ａｎｄ　ＢＨＩ．　【Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ】Ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ　ｉｓ　ｔｈｅ　ｋｅｙ　ｆａｃｔｏｒ　ｔｈａｔ　ａｆｅｃｔｓ　ｍｙｃｅｌｉｕｍ—ｔｏ—ｙｅａｓｔ　ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｓｐｏｒｏｔｈｒｉｘ　
ｓｃｈｅｎｃｋｉｉ，ｎｏｕｒｉｓｈｍｅｎｔｓ　ｏｆ　ｍｅｄｉａ　ｍａｙ　ａｌｓｏ　ｂｅ　ｎｅｃｅｓｓａｒｙ　ｆｏｒ　ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ．　
Ｋｅｙ　ｗｏｒｄｓ：Ｓｐｏｒｏｔｈｒｉｘ　ｓｃｈｅｎｃｋｉｉ；ｍｙｃｅｌｉｕｍ—ｔｏ—ｙｅａｓｔ　ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ；ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ；ｍｅｄｉａ　
［Ｊ　ＳＵＮ　ｒａｔ—ｓｅｎ　Ｕｎｉｖ（Ｍｅｄ　Ｓｃｉ），２０１０，３１（４）：４９１—４９５］　

收稿日期：２００９—１ｌ一２９　
基金项目：广东省自然科学基金（８１５１００８９０１０００１８７）；广东省科技计划项目（２００７Ｂ０３０７０４００６）　
作者简介：张静，硕士生，研究方向为真菌性皮肤病；　通信作者：黄怀球，副主任医师，Ｅ．ｍａｉｌ：ｈｈｕａｉｑｉｕ＠ｍｅｄｍａｉｌ．ｃｏｍ．ｃｎ　
４９２　中山大学学报（医学科学版）　第３１卷　
申克孢子丝菌属于双相型真菌．在自然界或　
室温培养为菌丝相，在体内或３７℃培养为酵母　
相。申克孢子丝菌感染可导致孢子丝菌病，不仅可　
以引起皮肤组织的病变，还可侵犯内脏器官引起　
系统性病变，严重危害着人类的健康［　］。酵母相　
是申克孢子丝菌的致病相，申克孢子丝菌在体内　
从菌丝相到酵母相的转化是致病的一个关键步　
骤［３－４］。目前关于酵母相转化的研究多集中在基因　水平　］，而对于与致病性同样紧密相关的生化特　点研究较少。本文研究了不同温度和培养基在申　克孢子丝菌酵母相转化中的作用。　１材料与方法　１．１实验菌株　菌株ＳＵＭＳ０３８２、ＳＵＭＳ０３８３、ＢＭＵ０２０３５和　ＢＭＵ００４７１经形态学和分子生物学鉴定为申克孢　子丝菌。ＳＵＭＳ０３８２和ＳＵＭＳ０３８３分离自我科淋巴　管型孢子丝菌病患者，ＢＭＵ０２０３５和ＢＭＵ００４７１由　北京大学真菌和真菌病研究中心惠赠，亦分离自　孢子丝菌病患者。　１．２培养基　沙堡弱琼脂（Ｓａｂｏｕｒａｕｄ’Ｓ　ａｇａｒ，ＳＤＡ）基、马铃　薯葡萄糖琼Ｊ］￣（ｐｏｔａｔｏ　ｄｅｘｔｒｏｓｅ　ａｇａｒ，ＰＤＡ）基、脑心　浸汁琼Ｂ￣（ｂｒａｉｎ　ｈｅａｒｔ　ｉｎｆｕｓｉｏｎ　ａｇａｒ，ＢＨＩ）基、含５Ｏ　ｍｇ／ｋｇ去纤维蛋白羊血清的脑心浸汁琼脂基　（ｂｒａｉｎ　ｈｅａｒｔ　ｉｎｆｕｓｉｏｎ　ａｇａｒ　ｐｌｕｓ　５０　ｍｇ／ｋｇ　ｇｏａｔ　ｂｌｏｏｄ，　５０　ｍｇ／ｋｇ羊血ＢＨＩ）及含５　ｍｇ／ｋｇ葡萄糖脑心　浸汁琼脂基（ｂｒａｉｎ　ｈｅａｒｔ　ｉｎｆｕｓｉｏｎ　ａｇａｒ　ｐｌｕｓ　５　ｍｇ／ｋｇ　Ｇｌｕｃｏｓｅ，５　ｍｇ／ｋｇ　ＧＳＢＨＩ），ｐＨ值均为７．０，购自　广州市迪景微生物技术有限公司。　１．３菌株活化　将实验菌株接种于ＰＤＡ斜面培养基上，在含　体积分数为５％的ＣＯ：２５℃恒温箱中培养，每隔　７　ｄ传代１次，连续传代２次，光镜下检查菌落形　态。以保证菌株的纯度和生长活力。　１．４酵母相转化　于超净工作台内，采用划线接种法将每株菌　分别接种于ＳＤＡ、ＰＤＡ、ＢＨＩ、５０　ｍｇ／ｋｇ羊血ＢＨＩ　及５　ｍｇ／ｋｇ　ＧＳＢＨＩ　５种培养基上．每种培养基接　种５个平皿。分别置于２５、３５、３６、３７及３８℃含　５％的体积分数为ＣＯ　恒温温箱中培养。观察菌落　生长情况，每５　ｄ传代１次，连续传代３次。　在所有平皿上的菌株传代３次生长至第５天　时，用接种环挑取少量菌落，置于灭菌载玻片上，滴　加乳酸酚棉兰或酚红染色后。置于光学显微镜下观　察菌落形态。参照文献［　］计算每个平板上菌株的酵　母细胞转化率，转化率＞１０％为酵母相转化成功。　１．５统计学分析　利用精确概率法对所有菌株在不同温度和培　养基下转化率的差异进行统计学分析。统计软件　
使用ＳＰＳＳ　１６．０，Ｐ＜０．０５为差异有统计学意义。　

２　结　果　
２．１菌株活化　
４株申克孢子丝菌经活化后均生长良好。形　
成棕褐色有皱褶的典型菌落。　
２．２酵母相转化　
２．２．１　申克孢子丝茵在不同温度的酵母相转化　
在２５℃的培养条件下，５种培养基上生长的菌株　
均表现为明显的丝状菌落，不能转化为酵母相。在　
３８　ｑＣ时，２５％培养基平皿上的菌株发生了酵母相　
转化（为菌株ＢＭＵ００４７１，其余菌株均不能生长）。　
３５℃和３７℃时分别有６０％（１２／２０）和８５％（１７／　
２０）培养基平皿上的菌株发生了酵母相转化。３６℃　
时仅有４５％（９／２０）培养基平皿上的菌株发生了酵　
母相转化（表１）。菌株在各温度下的转化率的差　
异具有统计学意义（Ｐ＜０．００１）。在光镜下计数不　
同温度时５０　ｍｇ／ｋｇ羊血ＢＨＩ培养基上生长的４　
株申克孢子丝菌酵母细胞的转化率．发现所有菌　
株在３５℃和３７℃的转化率均明显高于３６℃和　
３８℃，对于菌株ＢＭＵＯ０４７１。其在３５℃和３７℃的　
转化率均可达到９０％；３８℃时所有菌株的转化　
率最低，菌株ＳＵＭＳ０３８２、ＳＵＭＳ０３８３、ＢＭＵ０２０３５均　
低于ｌＯ％（图１）。不同温度下的酵母相菌落均在　
转种后的第２天开始出现．在第２　４天生长迅　
速．在第５天生长变得缓慢。在含５％去纤维蛋白　
羊血清的ＢＨＩ培养基上，菌株ＢＭＵＯ０４７１在３５、　
３６、３７和３８　ｃＩ二均可以转化为酵母相。在３５℃和　
３７℃时。酵母细胞生长良好，光镜下观察发现　
９０％的菌丝可转化为酵母细胞；在３６℃，酵母相　
菌株生长相对缓慢，光镜下仍可见到较多的菌丝　
片段和孢子：在３８℃，菌株生长速度较３６℃时　
快。但在光镜下发现转化的酵母细胞数量较３６　
℃少（图２）。