二十二碳六烯酸海藻糖酯的分离纯化及鉴定
DHA来源及分离纯化方法的研究进展
DHA来源及分离纯化方法的研究进展于喆【摘要】二十二碳六烯酸(Docosahexaenoic acid,DHA)是具有重要生理功能而人体自身又无法合成的一类多不饱和脂肪酸.通过外源补充DHA可提高人体自身免疫机能、增强体质.本文主要就DHA的原料来源和分离纯化方法进行了综述,并提出了DHA相关领域需深入研究的几个问题,以期为将来开展DHA相关研究提供参考.【期刊名称】《天津农业科学》【年(卷),期】2017(023)007【总页数】4页(P29-32)【关键词】二十二碳六烯酸;多不饱和脂肪酸;分离纯化【作者】于喆【作者单位】辽宁省海洋水产科学研究院,辽宁大连106023【正文语种】中文【中图分类】TS22Docosahexaenoic acid（DHA，系统命名为：顺-4,7,10,13,16,19-二十二碳六烯酸）属ω-3系多不饱和脂肪酸（ω-3 polyunsaturated fatty acids，ω-3 PUFAs），又称为 Cervonic acid。
其分子式，C22H32O2；相对分子量，328.49。
DHA的结构简式如图1所示。
DHA分子中的6个不饱和双键使其具有较低的熔点（-45.5～-44.1℃）和较高的流动性，高纯度DHA常温下为无色无味油状液体，不溶于水，易溶于有机溶剂。
DHA含有5个活泼的亚甲基，这些活泼亚基的存在使二者极易受到光氧、高温、金属元素及自由基的影响，产生氧化、酸败、聚合、双键共扼等化学反应，产生以碳基化合物为主的鱼臭物质。
DHA是人体自身无法合成但却具有重要生理功能的一种多不饱和脂肪酸。
DHA作为长碳链高度不饱和脂肪酸，可增加膜的流动性和通透性、提高膜的生理机能、增强脑和神经系统的活性，对维持脑的功能、延缓脑的衰老具有重要作用。
此外，DHA对心血管疾病、糖尿病、肥胖症等有一定的防治作用，且具有抗癌、抗炎作用等活性。
由此可见，DHA对人类健康有着举足轻重的作用。
dha有机化学
DHA（二十二碳六烯酸）是一种重要的有机化合物，属于ω-3系列不饱和脂肪酸。
它在人体中具有多种生理功能和营养价值。
本文将从DHA的结构、来源、合成方法、生理功能以及应用等方面进行介绍，以便更好地了解和认识这一有机化合物。
一、DHA的结构DHA的分子式为C22H32O2，其结构式如下：CH3(CH2)4CH=CHCH2CH=CH(CH2)7COOHDHA分子包含22个碳原子和6个不饱和键，其中两个双键位于第三个和第七个碳原子上。
这种结构使得DHA具有独特的物理和化学性质。
二、DHA的来源DHA主要存在于海洋生物中，尤其是富含脂肪的鱼类和海藻。
鱼类体内含有较高浓度的DHA，而海藻则是鱼类DHA的主要来源。
此外，一些海洋微生物和浮游植物也能合成DHA。
三、DHA的合成方法目前，DHA的合成方法主要有两种：一种是从天然油脂提取DHA，另一种是通过人工合成。
前者通常采用脂肪酸提取法，将富含DHA 的鱼油或海藻油进行萃取和分离，得到纯净的DHA。
后者则通过化学反应在实验室中人工合成DHA，这种方法相对复杂但可控性较高。
四、DHA的生理功能DHA在人体中具有多种生理功能，其主要作用包括：1. 细胞膜结构：DHA是细胞膜的重要组成部分，能够增强细胞膜的稳定性和流动性，维持细胞的正常功能。
2. 脑发育：DHA是脑组织的重要成分，对婴幼儿的脑发育具有关键作用。
充足的DHA摄入可以促进大脑神经元的生长和连接形成，有助于智力发育。
3. 炎症调节：DHA能够通过抑制炎症反应、调节免疫功能等方式，对炎症和自身免疫性疾病具有一定的保护作用。
4. 心脏保健：DHA具有降低血液中三酰甘油和胆固醇水平的作用，有助于预防心血管疾病的发生。
5. 视力保护：DHA是视网膜组织的重要成分，对视力保护和预防眼部疾病具有积极影响。
五、DHA的应用由于DHA的多种生理功能，它在医学、保健品、食品工业等领域具有广泛的应用价值。
以下是几个常见的应用领域：1. 婴幼儿配方奶粉：针对婴幼儿的脑发育需求，许多配方奶粉添加了DHA，以满足其对脑营养的需求。
高密度培养裂殖壶菌生产二十二碳六烯酸的开题报告
高密度培养裂殖壶菌生产二十二碳六烯酸的开题报告
一、研究背景
二十二碳六烯酸（DHA）是一种具有重要生理功能的不饱和脂肪酸，特别是在人类婴儿的神经系统和视网膜发育中有着关键作用。
DHA可以从食物中摄入，但是大多数人的摄入量不够，因此需要寻找其他的生产来源。
裂殖壶菌（Schizochytrium）是一种广泛分布的海洋微生物，可以生产大量的DHA。
因此，开发裂殖壶菌的高密度培养生产DHA技术具有重要的研究和应用价值。
二、研究内容和方法
本研究的主要内容是通过裂殖壶菌的高密度培养生产DHA。
具体的研究方法包括以下几个方面：
1. 优化培养基配方：通过单因素实验和正交实验等方法，确定最适合裂殖壶菌生长和DHA生产的培养基配方。
2. 优化发酵参数：包括温度、pH、氧气传质速率、搅拌速率等参数的优化。
3. 建立高生产DHA的裂殖壶菌菌株：筛选出DHA产量高的裂殖壶菌菌株，并进行金属离子诱变和遗传重组等方法，建立高产DHA的裂殖壶菌菌株。
4. 设计连续生产系统：建立连续生产系统，控制发酵条件，实现稳定高密度培养裂殖壶菌生产DHA。
三、预期成果
本研究预期可以通过优化培养条件和建立高产DHA的裂殖壶菌菌株，实现高产DHA的连续生产。
同时，将研究中获得的优化方法和技术推广到工业生产中，为DHA 的生产提供新的可行途径。
DHAEPADPA检测方法
DHAEPADPA检测方法DHA（二十二碳六烯酸，Docosahexaenoic Acid），EPA（二十碳五烯酸，Eicosapentaenoic Acid）和DPA（二十二碳五烯酸，Docosapentaenoic Acid）是三种重要的ω-3多不饱和脂肪酸，它们在人体中具有多种生物学功能，对健康至关重要。
因此，准确快速地检测DHA、EPA和DPA的含量对于评估人们的膳食结构和健康状态具有重要意义。
目前，DHA、EPA和DPA的检测方法主要包括气相色谱法（GC）、高效液相色谱法（HPLC）和质谱法（MS）。
气相色谱法是最常用的DHA、EPA和DPA含量测定方法之一、它通常需要预处理样品，如脂肪提取、甲酯化等。
在脂肪提取过程中，样品中的DHA、EPA和DPA将与有机溶剂结合，并从样品中分离出来。
然后，采用甲酯基化等方法将DHA、EPA和DPA转化为易于GC检测的衍生物。
最后，使用气相色谱仪对衍生物进行分析和定量。
这种方法准确度较高，可以定量测定DHA、EPA和DPA的含量，但需要较长时间和复杂的操作过程。
高效液相色谱法是另一种常用的DHA、EPA和DPA含量测定方法。
该方法通常不需要太多的样品预处理步骤，可以直接测定样品中的DHA、EPA和DPA含量。
在HPLC分析中，样品经过一系列色谱柱，在流动相的作用下，DHA、EPA和DPA根据其亲水性和亲脂性被分离出来，并通过紫外检测器进行检测和定量。
相比气相色谱法，HPLC分析方法更为快速简单，但有时对于含量较低的DHA、EPA和DPA的分离和定量可能有一定的困难。
质谱法是一种新兴的DHA、EPA和DPA检测方法。
质谱法通常结合液相色谱法（LC-MS）或气相色谱法（GC-MS）使用，可以将样品中的DHA、EPA和DPA分离出来，并通过质谱仪进行定量。
质谱法准确度高，可以快速、准确地测定DHA、EPA和DPA的含量，但在设备和操作上相对较昂贵和复杂。
此外，还有更为便携式的方法可以用于快速检测DHA、EPA和DPA的含量，如近红外光谱法和基于电化学的方法。
鱼油DHA和EPA提纯方法
鱼油DHA和EPA提纯方法鱼油是一种富含omega-3脂肪酸的天然营养物质，其中最主要的两种成分是DHA（二十二碳六烯酸）和EPA（二十碳五烯酸）。
这两种脂肪酸对人体健康具有重要意义，可帮助降低血压、减少心脏疾病风险、改善记忆力和认知功能等。
在鱼油中DHA和EPA的含量相对较低，为了更好地发挥其功效，需要对鱼油进行提纯，以获取更高纯度的DHA和EPA。
本文将介绍鱼油DHA和EPA提纯的方法。
1. 超临界流体萃取法超临界流体萃取是一种利用超临界流体对原料进行提取的方法。
超临界流体的特点是密度和粘度可调，对温度和压力敏感，可在超临界条件下通过控制压力和温度改变其溶解能力，从而实现对目标物质的选择性提取。
在鱼油DHA和EPA提纯中，可选用超临界二氧化碳作为萃取剂，将鱼油溶解在超临界二氧化碳中，通过调控温度和压力，使DHA和EPA在超临界二氧化碳中溶解，其他杂质则不溶解或溶解度较低，最终通过减压或升温的方式将DHA和EPA从超临界二氧化碳中分离得到。
超临界流体萃取法具有操作简单、提取效率高、无需使用有机溶剂等优点，对原料和目标物质均有较好的选择性，是一种比较理想的鱼油DHA和EPA提纯方法。
2. 沉淀法沉淀法是一种利用物理或化学方法使目标物质从溶液中沉淀出来的提纯方法。
在鱼油DHA和EPA提纯中，可利用沉淀剂如甲醇、乙醇等与鱼油中杂质、不需的脂肪酸等发生反应，将其沉淀出来，而DHA和EPA则保持在溶液中，再通过过滤或离心等方法将DHA和EPA 从溶液中分离得到。
沉淀法具有操作简便、成本较低等优点，但需要注意选择适当的沉淀剂和控制沉淀条件，以确保对DHA和EPA的提纯效果。
3. 冷冻结晶法冷冻结晶法是一种较为常用的提取方法，具有操作简单、成本较低等优点，但需要严格控制温度和溶液浓度，以确保提纯效果。
4. 结晶化学纯化法结晶化学纯化法是通过化学反应和结晶过程结合，将目标物质从混杂物中提纯的方法。
在鱼油DHA和EPA提纯中，可选用适当的化学试剂与鱼油中的杂质或其他脂肪酸发生反应，通过结晶法对目标物质进行精细提纯。
海藻糖检测标准
海藻糖检测标准
一、含量检测
海藻糖的含量检测主要采用高效液相色谱法（HPLC），通过色谱柱分离样品中的海藻糖和其他成分，然后通过检测器测定海藻糖的含量。
在此过程中，需要注意样品的处理和提取方法，以避免海藻糖的损失和干扰。
二、稳定性检测
海藻糖的稳定性检测主要包括热稳定性和存储稳定性。
热稳定性可以通过加热试验来评估，即将海藻糖在不同温度下加热一定时间，然后测定其含量和分子量变化。
存储稳定性则可以通过将海藻糖在不同环境条件下存储一定时间，然后测定其含量和分子量变化来评估。
三、安全性检测
海藻糖的安全性检测主要包括急性毒性试验和亚慢性毒性试验。
急性毒性试验主要是通过给小鼠注射一定剂量的海藻糖，观察其急性毒性反应。
亚慢性毒性试验则是通过给小鼠喂食不同剂量的海藻糖，观察其长期毒性反应。
此外，还需要对海藻糖进行微生物检测和重金属检测等安全性检测。
四、吸湿性检测
海藻糖的吸湿性检测主要是通过将海藻糖置于湿度较高的环境中，测定其吸湿程度和吸湿速度。
该项检测可以评估海藻糖在湿度较高环境下的稳定性和使用性能。
五、玻璃化转化温度检测
海藻糖的玻璃化转化温度可以通过差示扫描量热法（DSC）进行检测。
在此过程中，需要注意控制升温速度和样品量，以获得准确的玻璃化转化
温度数据。
六、化学成分定性定量检测
海藻糖的化学成分定性定量检测主要是通过红外光谱法、核磁共振波谱法和质谱法等手段进行测定。
该项检测可以了解海藻糖的化学组成和分子结构信息，为其应用和研究提供依据。
DHA即二十二碳六烯酸
DHA即二十二碳六烯酸，它的英文原名是Docose Hexaenoic Acid,分子式为C22H34O2,有22个碳原子，2个氧原子和34个氢原子组成，22个碳原子并列排列，每个碳原子有4只手，2个氧原子各有2只手，氧原子呈球状连在这些伸出的手上，因在其甲基端第三个碳原子上连结着一个双键，所以DHA这类物质叫做n-3高度不饱和脂肪酸。
DHA对人类来说是一种不可缺少的高度不饱和脂肪酸，是从鱼油中提取，它具有使人头脑聪明，促进胎儿发育，提高儿童智商以及预防心脑疾病、软化血管、降低血脂、延缓衰老、防止痴呆的作用，随着科学技术的飞跃发展和研究方法实验仪器的不断进步，DHA的作用也在逐渐地被研究证实并为人类所接受，英国、美国、法国以及日本的科学家，进行了大量的科学实验，验证了D HA的功能。
DHA的功能国内外学者的实验已经证实DHA可使人的智力增长，而且对于母亲腹中的胎儿、刚出生的婴儿、儿童、青少年、甚至老人，也就是在人的整个一生中，DHA都是必不可少的营养素。
1、孕妇需要DHA胎儿发育不能缺少DHA。
卵子在女性输卵管内与进入输卵管的精子结合，形成受精卵。
受精卵在受精后开始分裂（也叫卵裂）。
3－4天后进入子宫，这时受精卵已经分裂成12－16个细胞，成为一个实心的细胞团，形态如桑椹（叫桑椹胚），这时的子宫内膜增厚、柔软、血管丰富，准备迎接孕卵。
受精后5－6天的受精卵（这时叫囊胚），分泌一种蛋白质分解酶，这种酶可以溶解子宫内膜，使子宫内膜形成一个缺口，囊胚从缺口进入子宫内膜后，缺口表面迅速被修复，整个囊胚被埋在子宫内膜中，称为着床。
孕卵着床后，细胞分裂更加活跃，形成胚胎。
囊胚着床后，其周围的绒毛与子宫内膜（这时叫蜕膜）接触部分逐渐形成胎盘（怀孕3个月左右），胎盘随着妊娠月份的增加、胎儿的发育而增大。
足月胎盘是扁平的，呈圆盘状，直径15－20厘米，厚度2－3厘米，重量约为胎儿体重的1/6（约500克）。
胎盘中母亲的血液与胎儿的血液是分开的两套循环通路，互相不能混杂。
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200 孙月娥,夏文水,陈 洁*(江南大学食品科学与技术国家重点实验室,江苏无锡214122)
摘 要:在叔丁醇中以二十二碳六烯酸(DHA)乙酯和海藻糖为原料,通过固定化脂肪酶催化合成DHA海藻糖酯,并对其分离纯化方法进行研究。确定DHA海藻糖酯的薄层层析(TLC)条件:展开剂为乙酸乙酯/甲醇/水(815/1/015,v/v/v),碘蒸气显色10min;硅胶柱层析条件:正己烷/异丙醇/甲醇(5/4/1和4/4/2,v/v/v)梯度洗脱,流速113mL/min,1管/7min收集洗出液;用半制备高效液相色谱(HPLC)进一步纯化单酯收集液,经分析型HPLC检测纯度后用核磁共振(NMR)方法进行结构鉴定,确定为DHA藻糖单酯。关键词:二十二碳六烯酸(DHA),海藻糖酯,固定化脂肪酶,纯化,核磁共振(NMR)
Separation,purificationandidentificationofdocosahexaenoyltrehalose
SUNYue-e,XIAWen-shu,iCHENJie*(StateKeyLaboratoryofFoodScienceandTechnology,JiangnanUniversity,Wuxi214122,China)Abstrac:tDocosahexaenoyltrehalose(DHA)wassynthesizedfromdocosahexaenoicacidethylesterandtrehaloseintert-butanolusingmimobilizedlipaseasbiocatalyst1Thepurificationandanalysismethodswereinvestigated1Themobilephaseforthethinlayerchromatography(TLC)wasethylacetate/methanol/water(815/1/015,v/v/v)andiodinewasusedfordevelopment1Thesilicagelcolumnchromatographyconditionswereasfollows:gradientmobilephasesofhexane-isopropanol-methanol5B4B1(v/v/v)and4B4B2(v/v/v)wereusedinturn1Theflowratewas113mL/minandtheeluentof1tube/7minwascollected1Theeluentofmono-docosahexaenoyltrehalosewaspurifiedwithsemi-preparativehighperformanceliquidchromatographyHPLCfurtherandthenwasidentifiedbynuclearmagneticresonance(NMR)1Keywords:docosahexaenoicacid(DHA);docosahexaenoyltrehalose;mimobilizedlipase;purification;NMR中图分类号:TS20112+3 文献标识码:A 文章编号:1002-0306(2010)03-0200-04
收稿日期:2009-05-05 *通讯联系人作者简介:孙月娥(1973-),女,博士研究生,研究方向:食品脂质氧化。基金项目:国家自然科学基金课题(20401007)以及江苏省创新人才基金课题(BK2006503)支持。
非水相酶法催化酯交换反应是一个崭新的研究领域,与传统的化学合成法相比,酶催化合成具有反应条件温和、选择性高、副产物少等优点。大量研究证实,DHA为人体必需的多不饱和脂肪酸,具有抑制血小板凝聚、抗血栓、防治心脑血管疾病[1]、降低冠心病患者心肌梗塞死亡率[2]、促进智力发育等功能[3],此外,还具有抗肿瘤作用[4-5]。海藻糖是天然双糖中较稳定的二糖,无还原性,在食品中加热不发生美拉德反应。海藻糖作为一种天然二糖,它不仅具有其它低聚糖的特性,而且还具有独特的生物活性)))对生物体和生物分子具有独特的非特异性保护作用[6]。研究表明,许多生物在胁迫环境(如饥饿、高温、冷冻、干燥、高渗、辐射、有毒物质等)下表现出的抗逆耐受力与体内的海藻糖含量有直接的关系[7-8]。因此,通过酯交换反应把海藻糖和DHA结合成酯能同时发挥两种活性成分的生物学功能。本文主要研究了非水相脂肪酶催化合成DHA海藻糖酯的分离纯化方法和鉴定方法,即通过薄层层析、硅胶柱层析和半制备反相HPLC分离纯化目标产物,采用液相色谱-电喷雾离子阱质谱联用系统(LC-ESI-MS)及核磁共振技术对DHA海藻糖单酯进行鉴定。1 材料与方法111 材料与设备硅胶(200~300目)、硅胶板(G254) 青岛海洋化工;甲醇(色谱纯) 江苏汉邦科技有限公司;海藻糖(食品级) 日本林原公司;DHA乙酯(含量>75%) 无锡市迅达海洋生物制品厂赠送;4!分子筛、叔丁醇及其它有机溶剂 分析纯,中国医药集团上海试剂有限公司;固定化脂肪酶Novozym435 诺201
维信公司。Waters高效液相色谱-质谱联用仪、Waters半制备型高效液相色谱仪 美国Waters公司;LC20A分析型高效液相色谱仪 日本岛津公司;Seastar旋转蒸发器 无锡星海王生化设备有限公司;水浴恒温振荡器 上海精宏实验设备有限公司;BRUKER500MHz核磁共振仪 德国Bruker公司。112 实验方法11211 非水相酶法合成DHA海藻糖酯 在250mL圆底烧瓶(包裹锡箔纸)中分别加入150mL预脱水的叔丁醇、115g海藻糖、4124gDHA乙酯、115g固定化脂肪酶Novozym435,充氮保护,在50e恒温水浴振荡器(150r/min)中避光反应50h。11212 液质联用分析(HPLC-MS)1121211 色谱条件 色谱柱,YMC-PackODS-A,416mm@250mm,5Lm;流动相A,超纯水(013%甲酸);流动相B,甲醇;流动相C,正己烷;梯度洗脱程序:0~15min,A20%~0%,B80%~100%;15~30min,B90%~100%,C0%~10%。流速,1mL/min;检测波长,205nm;柱温,30e;进样量10LL。1121212 质谱条件(MS) WatersPlatformZMD4000,电喷雾离子化源,正离子模式ES+:毛细管电压4120kV,锥孔电压36V,离子源温度100e,脱溶剂气温度250e,质量范围(m/z)200~1400,光电倍增器电压650V,Analyser真空度216e-5mBar,气体流速413L/h。负离子模式ES-:毛细管电压4123kV,锥孔电压36V,离子源温度100e,脱溶剂气温度250e,质量范围(m/z)200~1400,光电倍增器电压650V,Analyser真空度216e-5mBar,气体流速413L/h。11213 硅胶柱层析分离纯化 将反应液过滤,除去固定化脂肪酶,减压浓缩,浓缩液上硅胶层析柱(硅胶200~300目,30mm@400mm),流动相为正己烷/异丙醇/甲醇=5/4/1、4/4/2(v/v/v)梯度洗脱,流速为113mL/min,按1管/7min分段收集洗出液,同时进行TLC检验。将斑点相同者用分析型HPLC进一步检测,合并杂质较少的收集管中的流出物,将其进行减压浓缩后,用半制备液相色谱进一步分离纯化。11214 薄层色谱(TLC)分析 将经过硅胶柱层析收集的粗分离液在硅胶薄层板上点样,展开剂为乙酸乙酯/甲醇/水(815/1/015,v/v/v),展开10min,碘蒸气显色。11215 半制备液相色谱纯化 色谱条件:SunfireC18
色谱柱(150mm@19mmi1d1,10Lm),流动相甲醇B水
(v/v)=85B15,流速810mL/min,检测波长205nm,进样量500LL,柱温30e。11216 分析型HPLC分析 岛津LC-20A分析型HPLC色谱条件:SunfireC18反相色谱柱(150mm@416mmi1d1,5Lm),流动相为甲醇B水(v/v)=85B15,二极管阵列检测器(PDA),流速110mL/min,上样量10LL,检测波长205nm,柱温30e。11217 DHA海藻糖单酯结构鉴定 核磁共振(NMR):样品溶解于氘代甲醇中,用BRUKER500MHz核磁共振仪测定产物的13CNMR图谱。
2 结果与分析211 DHA海藻糖酯的合成与HPLC-MS分析DHA乙酯与海藻糖进行酯交换反应的过程见图1,由于海藻糖是分子结构对称的二糖,6-和6c-位置的羟基较活跃,因此,有可能在6-OH和6c-OH上进行酯交换反应,生成相应的DHA海藻糖的单酯和二酯。
图1 DHA海藻糖酯的合成路线实验中得到的合成反应液经过滤、梯度洗脱和在线柱后质谱鉴定,结果如图2和图3所示。图2显示,合成反应液经过液相色谱仪后出现较多的峰,但是经在线质谱检测,发现只是在保留时间为8127min和17154min的组分为可能的目标产物。
图2 DHA海藻糖酯反应液的色谱分离图
图3 DHA海藻糖酯的ESI-MS离子流谱电喷雾电离是通过常压电离源,使待分析样品的分子质子化而生成单电荷离子[9-11]。图3(a)为保留时间8127min的组分的MS图谱,DHA海藻糖单酯的相对分子质量为652135,ES-图谱上出现的m/z值为65117的峰,是[M1-H]的质谱信号。其它m/z值为69718、32713、130413的峰分别为[M1+HCOO-]、[C22H31O2]-(DHA酸根)、[2M1-1]的质谱信号;而ES+图谱上出现的m/z值为67517、69118、132812的峰分别为[M1+Na]、[M1+K]、[2M1+Na]的质谱信号,因此证明了DHA海藻糖单酯的存在。图3(b)为