G418筛选抗生素的使用方法
G418的用途及配制方法
G418的用途及配制方法G418 ：白色粉末，融点138～144℃，溶于水、甲醇。
CAS No.：分子式：C20H40N4O10 •2H2SO4 分子量：比旋：+104o～+121o 水分：≤10%吸光值：≤ (280nm,1mg/ml), ≤ (570nm,100mg/ml)G418是一种氨基糖类抗生素，其结构与新霉素、庆大霉素、卡那霉素相似，它通过影响80S核糖体功能而阻断蛋白质合成,对原核和真核等细胞都有毒性 ,包括细菌、酵母、植物和哺乳动物细胞 ,也包括原生动物和蠕虫。
是稳定转染最常用的选择试剂。
当neo基因被整合进真核细胞基因组合适的地方后 ,则能启动neo基因编码的序列转录为mRNA,从而获得抗性产物氨基糖苷磷酸转移酶的高效表达 ,使细胞获得抗性而能在含有Ｇ418的选择性培养基中生长。
Ｇ41 8的这一选择特性 ,已在基因转移、基因敲除、抗性筛选以及转基因动物等方面得以广泛应用。
加药时间由于基因转染到细胞内之后要一段时间才能表达出蛋白质。
所以筛选不能太早；但是也不能太晚，因为转染了外源基因的细胞代谢负荷较大，增值较慢，时间长了就会被没有外源基因转入的细胞所淹没，最终导致筛选不出阳性克隆，一般要在转染24小时之后才开始加G418筛选。
随着细胞的代谢G418的浓度和活性都会下降，所以每3~5天都要更换一次含有G418的筛选液。
这时药物浓度可以降至200ug/ml。
培养液加药筛选约6天左右，细胞会大量死亡，孔中只剩下的细胞寥寥无几。
这时会出现两个问题：1.死亡的细胞会裂解释放出有害物质，导致那些有neo表达的阳性细胞死亡，即非选择性死亡。
2.孔中细胞数目很少，细胞之间的信号会变得很弱，也会导致阳性细胞的状态不佳甚至死亡。
这个时候需要一种特殊的培养液：假如你要转染3T3细胞，在3T3细胞汇合度达到80%的时候，换液，培养过夜之后收集培养液，通过滤器消毒，和新鲜的培养液按1：1混合备用。
再转染后筛选过程中就可以应用这种培养基。
G418详细信息
•保存于运输说明：•2-8℃•详细信息：•G418 sulfate (Geneticin) 现货供应说明：真核表达筛选用抗生素，可以用于筛选表达特定抗性基因的稳定细胞株。
筛选哺乳动物细胞，推荐起始筛选浓度为400微克/毫升；筛选植物细胞，推荐起始筛选浓度为10微克/毫升；筛选酵母，推荐起始浓度为500微克/毫升。
根据起始浓度的效果可以再适当升高或降低G-418的使用浓度。
分子式：C20H40N4O10·2H2SO4分子量：692.71CAS＃：108321-42-2外观：白色粉末特性：溶解性：可溶于水、甲醇、缓冲液和培养基。
溶解后，0.22μm过滤除菌，分成小包装，4℃可保存12个月，-20℃保存时间更长。
最常用的储存液使用100mM HEPES(pH7.3)配制，浓度为50mg/ml。
使用HEPES配制的好处是：加入储存液不会改变培养体系的pH值。
储存条件：2-8℃Ordering InformationDescription Quantity Price(RMB)Cat. no.产地G418 sulfate 1g45011811-023 Invitrogen 5g200011811-023 Invitrogen其他公司产品：G418溶液的配制配的时候就是用配好的HEPES溶G418，然后过滤，不用高压灭菌了，配好后分装，-20度保存，用的时候取一管放4度。
100mM HEPES（pH7.3）缓冲液（500ml）ddH2O 490mlNacl 4gNa2HPO4-12H2O 0.1357gKcl 0.185gGlu 0.5gHEPES 2.5g用氢氧化钠调PH至7.3 ，定容至500mlG418贮存液（50mg/ml）的配制以下为细胞筛选的常用步骤：仅仅作为参考1.G418的配制：取1g G418溶于1ml 1M的HEPES液中，加蒸馏水至10ml，过滤消毒，4度保存。
2.细胞培养：取待测培养细胞，制备成细胞悬液，按等量接种入多孔培养板中，培养6小时左右开始加药。
稳转株：G418浓度确定到单克隆化鉴定
稳定转染攻略：从G418浓度确定到单克隆化鉴定摘要: 一、筛选之前确定G418浓度：1、由于每种细胞对G418的敏感性不同，而且不同的厂家生产的G418有效成分的比重不同，一般1g的粉剂中有效的G418含量大约为0.722g。
2、G418是新霉素的类似物，两者都是通过抑制核糖体的功能和蛋白质的合成而杀死细胞的。
但是新霉素对真核细胞无作用而G418对细菌和真核细胞都起作用。
neo就是编码3磷酸转移酶的基因，它表达的蛋白能够分解新霉素和一、筛选之前确定G418浓度：1、由于每种细胞对G418的敏感性不同，而且不同的厂家生产的G418有效成分的比重不同，一般1g的粉剂中有效的G418含量大约为0.722g。
2、G418是新霉素的类似物，两者都是通过抑制核糖体的功能和蛋白质的合成而杀死细胞的。
但是新霉素对真核细胞无作用而G418对细菌和真核细胞都起作用。
neo就是编码3′磷酸转移酶的基因，它表达的蛋白能够分解新霉素和G418。
在进行转染时细胞膜受到影响，抗生素可能对细胞产生较大影响，加上G418有杀菌作用，所以有人主张转转染时不加其它抗生素。
3、汇合度对G418筛选结果的影响很大，一般筛选时汇合度不宜超过50%。
4、G418的活性不尽相同，所以在筛选之前，一定要确定G418的最佳筛选浓度。
具体如下：将细胞稀释到1000个细胞/ml，在100ug/ml~1mg/ml的G418浓度范围内进行筛选，选择出在10~14天内使细胞全部死亡的最低G418浓度来进行下一步的筛选试验。
一个具体试验：3*106个细胞电转后，分别接种1/4000，1/1000，1/300细胞到24孔板中，48h后加药筛选，此时1/300细胞孔内大约50%汇合度。
理论上1/4000孔内应有4%的汇合度。
筛选9天后，观察1/4000孔内有两三个克隆，按比例1/300孔内应该有几十个克隆，事实上，它们几乎全死光了，只有几个克隆。
二、加药时间和维持浓度：1、由于基因转染到细胞内之后要一段时间才能表达出蛋白质。
G418溶液(geneticin,20mgml)
G418溶液(geneticin,20mg/ml)产品简介：新霉素(geneticin, G418)又称遗传霉素，是一种氨基糖苷类抗生素, 是细胞稳定转染最常用的抗性筛选试剂。
G418能阻断蛋白质合成，对细菌、酵母、高等植物以及哺乳动物细胞均具有氨基糖苷类毒性，用于真核细胞从转座子Tn5和Tn601稳定转染新霉素(neo)抗性基因的选择和维持。
经常用于基因转移、基因敲除、抗性筛选以及转基因动物等方面。
Leagene G418溶液经过滤除菌，一般工作浓度为50～1000ug/ml不等，然而不同类型的细胞需要根据实验确定最佳浓度。
在具有相对稳定基因组的细胞(如CHO细胞)中，一旦筛选出稳定细胞株后，无需加入G418继续培养。
产品组成：主要成分：主要由G418、HEPES等组成，过滤除菌。
操作步骤（仅供参考）：1、由于每种细胞对G418的敏感性不同，而且不同批次的G418的活性液不同，所以在筛选之前，需要确定G418的最佳筛选浓度，一般在50～1000μg/ml范围内进行筛选。
2、将细胞制备成细胞悬液，并稀释到1000个/ml。
3、加入不同量的G418 solution (20mg/ml)，选择在10~14天内使细胞全部死亡的最低G418浓度来进行下一步的筛选试验。
注意事项：1、尽量减少反复冻融的次数，以免失效。
2、基因转染到细胞内要一段时间才能表达出蛋白质, 所以筛选不能太早。
3、筛选也不宜太迟，一般要在转染24h之后才开始加G418筛选。
因为转染了外源基因的细胞代谢负荷较大，增值较慢，时间长了就会被没有外源基因转入的细胞所淹没，最终导致筛选不出阳性克隆。
4、随着细胞代谢，G418的浓度和活性都会下降，应每3~5天更换一次含有G418的筛选液，这时药物浓度可以降至200μg/ml。
5、加药筛选约5～7天左右，细胞会大量死亡，为了减少死亡细胞对阳性克隆的不利影响以及增加阳性克隆的得到率，可以应用套环法或刮除法结合有限稀释法来筛选阳性克隆。
最全的G418筛选稳定表达细胞系总结2
最全的G418筛选稳定表达细胞系2前言在分子生物学领域中，稳定表达细胞系的制备是非常重要的。
而在制备稳定表达细胞系的过程中，G418耐受性筛选是最常用的一种方法。
本文就该方法进行细致的，希望对大家有所帮助。
G418的作用G418是一种广泛应用于细胞培养中的抗生素。
G418的主要作用是通过破坏靶细胞的核糖体的功能而发挥抗生素活性。
这依赖于靶细胞中的耐药性基因，通常经过转染或整体基因组编辑获得。
这些基因通常会转录RNA，并翻译成与蛋白质功能无关的药物代谢酶或其他抗性蛋白质。
筛选细胞系的基本流程G418的筛选过程是稳定表达细胞系的一部分。
经过瞬时转染或电穿孔后，与转染物质中的DNA共染色板并内化进入细胞。
在内化过程中，染色体或质粒DNA 可以在总体上被细胞机制视为异物并准备将其解除。
其中的一个解除机制是通过解除转录RNA，从而将它们从蛋白质生产途径中移除。
G418抑制暴露在表面的核糖体中的修饰基队的蛋白质的生产。
如果细胞体系不具有反抗力机制，则G418会破坏细胞并导致细胞死亡。
然而，通过特定酵母的CUP1锌指转录因子同源工程，使其对G418转化为一种有效的ATP结合剂，从而打开药物代谢酶表达。
可以在这些细胞中选择表达具有耐药性G418药物代谢酶的细胞，并在含有适量G418的培养基上进行培养和筛选。
筛选条件的优化G418抗性筛选过程具有一定的体系依赖性，因此筛选条件需要在洗脱和拍摄步骤之后进行优化。
根据选择的细胞线，典型的筛选条件是0.5mg/ml浓度的G418和2-4周的境况培养。
但是，这些条件可能需要优化以适应特定试验条件，例如在分子克隆中需要更强的选择并且可能需要更长的选育时间。
考虑到选择压连续存在的潜在影响，推荐根据具体情况进行测试并确定适当的药物添加量和持续时间。
稳定表达细胞系的优点与瞬时转染相比，生成稳定表达细胞系有很多优点。
首先，它们可以被保存和用于长期研究，免受数据库变化和反常的实验结果的影响。
G418的用途及配制方法
G418的用途及配制方法本页仅作为文档封面，使用时可以删除This document is for reference only-rar21year.MarchG418的用途及配制方法G418 ：白色粉末，融点138～144℃，溶于水、甲醇。
CAS No.：分子式：C20H40N4O10 2H2SO4分子量：比旋：+104o～+121o?水分：≤10%吸光值：≤ (280nm,1mg/ml), ≤ (570nm, 100mg/ml)中的话，目的基因还是很容易丢失的。
但是外源基因整合到基因组中的概率太小了，而且是随机整合，会导致表达的目的蛋白的量产生很大差异。
随着培养时间的延续，那些丢失了外源基因的细胞和很少表达目的基因的细胞会占据优势，强表达目的蛋白的细胞会越来越少。
这样再次筛选是必不可少的。
只有经过2次以上的筛选之后才能找到那种我们想要的强分泌目的蛋白的，遗传稳定的细胞克隆。
的配制：取1g G418溶于1ml 1M的HEPES液中，加蒸馏水至10ml，过滤消毒，4度保存。
2.细胞培养：取待测培养细胞，制备成细胞悬液，按等量接种入多孔培养板中，培养6小时左右开始加药。
3.制备筛选培养基：在100ug/ml～1000ug/ml范围内确定几个梯度，比如先做个100ug/ml、400ug/ml、800ug/ml、1000ug/ml，按梯度浓度用培养基稀释G418制成筛选培养基。
4.加G418筛选: 吸除培养孔中培养基，PBS洗涤一次，每孔中加入不同浓度的筛选培养基。
5.换液：根据培养基的颜色和细胞生长情况，每3~5天更换一次筛选培养基。
方法同4。
6.确定最佳筛选浓度：在筛选10～14天内能够杀死所有细胞的最小G418浓度即为最佳筛选浓度。
在第一轮就筛选出最佳G418浓度的可能性不大，最有可能的是出现这种情况：用某一浓度G418的量在筛选14天后还不能杀死细胞，而用下一个梯度的 G418的量在10天前就看不到活细胞了。
g418筛选细胞原理
g418筛选细胞原理一、引言在生物学研究中，细胞是一个非常重要的研究对象。
为了更好地理解细胞的功能和特性，科学家们经常需要筛选出特定类型的细胞。
本文将重点介绍一种常用的细胞筛选方法，即使用g418进行筛选的原理。
二、g418的作用机制g418是一种广谱抗生素，属于氨基糖苷类抗生素，常用于细胞筛选和基因转染实验。
它能够抑制细菌和真菌的生长，同时对哺乳动物细胞具有选择性毒性。
g418的作用机制主要是通过抑制细胞内的蛋白质合成而起作用。
三、g418筛选细胞的原理g418筛选细胞的原理是利用细胞对g418的敏感性来筛选出特定类型的细胞。
在细胞培养基中加入一定浓度的g418，只有对g418敏感的细胞才能够存活下来，而对g418不敏感的细胞则会死亡。
因此，通过调整g418的浓度，可以选择性地杀死或保留特定类型的细胞。
四、g418筛选细胞的步骤1. 准备细胞培养基：在培养基中添加适量的g418，使其浓度达到所需浓度；2. 培养细胞：将待筛选的细胞加入带有g418的培养基中，进行培养；3. 观察细胞生长：观察细胞在带有g418的培养基中的生长情况。
对于对g418敏感的细胞，它们将在培养基中存活和繁殖；而对g418不敏感的细胞，则会死亡或生长缓慢；4. 筛选细胞：根据细胞的生长情况，筛选出对g418敏感的细胞。
五、g418筛选细胞的注意事项1. g418的浓度要根据具体实验目的进行调整，过低的浓度可能无法有效筛选出特定细胞，而过高的浓度可能对所有细胞都具有毒性；2. g418的作用时间也需要根据实验目的进行调整，通常需要持续培养一段时间才能筛选出对g418敏感的细胞；3. 在筛选细胞的过程中，需要定期观察细胞的生长情况，及时调整培养基中的g418浓度，以保证细胞的生长和筛选效果。
六、g418筛选细胞的应用g418筛选细胞的方法在生物学研究中得到了广泛应用。
例如，在基因转染实验中，可以利用g418筛选出成功转染的细胞，以便进行后续的功能研究；在细胞分离和纯化实验中，也可以利用g418筛选出特定类型的细胞，以便进一步研究其特性和功能。
G418原代细胞的筛选
G418原代细胞的筛选分析转化的功能和表达需要DNA稳定转染至宿主细胞染色体。
外源基因进入细胞后，部分能够通过细胞质进入细胞核内，根据细胞类型，至多80%的进入核内的外源DNA得到瞬时表达。
极少数情况下，进入细胞的外源DNA通过系列非同源性分子间重组核连接，形成巨大的***结构最终整合进细胞染色体。
细胞基因组自由部分表达，所以整合并不一定意味着表达，只有整合到表达区的基因才会表达，而且整合到不同的染色体区段的外源基因的表达的量也是不同的。
由于摄取、整合、表达外源基因是小概率事件，通常根据新表型筛选稳定转染体。
一般情况下这种新表型由共转染的编码抗生素抗性基因提供。
细菌Tn5转座子序列（neo抗性基因）携带的氨基糖苷磷酸转移酶可以将G418转变成无毒形式。
G418是一种氨基糖类抗生素，其结构与新霉素、庆大霉素、卡那霉素相似，它通过影响80S核糖体功能而阻断蛋白质合成，对原核和真核等细胞都有毒性，包括细菌、酵母、植物和哺乳动物细胞，也包括原生动物和蠕虫。
是稳定转染最常用的选择试剂。
当neo基因被整合进真核细胞基因组合适的地方后，则能启动neo基因编码的序列转录为mRNA，从而获得抗性产物氨基糖苷磷酸转移酶的高效表达，使细胞获得抗性而能在含有Ｇ4 18的选择性培养基中生长。
Ｇ418的这一选择特性，已在基因转移、基因敲除、抗性筛选以及转基因动物等方面得以广泛应用。
在进行转染时细胞膜受到影响，抗生素可能对细胞产生较大影响，加上G418有杀菌作用，所以有人主张转让时不加其它抗生素。
其实G418本身有很好的杀菌效果，在用G418进行筛选的过程中很少会发生污染。
但有一点，其实我觉得问题也不是很大，那就是：在老外的一本实验手册中提到，在脂质体转染时所用培养基中最好不加任何抗生素。
我想他的想法可能是脂质体对细胞膜有影响，可能此时加抗生素对细胞损伤较大。
因为庆大霉素、链霉素、G418均是氨基糖甙类药物，其药理作用完全一样。
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G418，是一种与庆大霉素相关的氨基糖苷类抗生素，常用作真核细胞的筛选。
作为硫酸新霉素的类似物，G418在真核细胞中干扰80S核糖体的功能以及蛋白质的合成。
显性作用的抗性基因(neor)的表达可筛选包含转座子Tn601(903)或Tn5的哺乳动物表达载体。
当表达抗性的哺乳动物细胞在含有G418的培养基中生长时，约10-14天内产生稳定的菌落。
G418筛选抗生素结构式
性质
形态：白色粉末
融点：138～144℃
溶解性：溶于水、甲醇
CAS：108321-42-2
分子式：C20H40N4O10·2H2SO4
分子量：692.71
比旋：104-121℃
水分：≤10%
吸光值：≤0.015 (280nm,1mg/ml), ≤0.1 (570nm, 100mg/ml)
储运：室温下运输, 干粉在室温下储存，溶于水、甲醇，溶液于-20℃储存。
优势
1、提供纯度＞90%（HPLC）的产品，与其他低浓度G418产品相比，使用量更低，更有利于细胞生长
2、效价＞700ug/mg
3、严格控制ED50值，保证各批次的一致性
使用方法
由于各真核细胞系对G418敏感度不同,需通过实验确认各新细胞系或细胞株稳定转染时杀死非稳定转染细胞所需用量。
最适用量通过建立细胞死亡曲线获得。
将细胞稀释至1000cell/ml，每孔100ul加入有培养基的24孔板，将每孔中的G418浓度稀释至0,100,200,300,400,500,600,700,800,900,1000,1100ug/ml等12个级别, 培养10-14
天，以最低细胞全部死亡浓度为基准，一般400-800ug/ml左右，筛选时比该浓度再高一个级别，维持时使用筛选浓度的一半即可。