高效液相色谱法的标准操作程序

1目的：规定了高效液相色谱法的标准操作程序，便于规范操作。

2适用范围：适用于公司内用高效液相色谱法检测的产品。

3责任人：QC。

4程序内容

4.1 简述

4.1.1 高效液相色谱法是一种现代液体色谱法，其基本方法是将具一定极性的单一溶剂或不同比例的混合溶液，作为流动相，用泵将流动相注入装有填充剂的色谱柱，注入的供试品被流动相带入柱内进行分离后,各成分先后进入检测器，用记录仪或数据处理装置记录色谱图或进行数据处理得到测定结果。

4.1.2常用的色谱柱填充剂有：硅胶，用于正相色谱；化学键合固定相，根据键合的基团不同可用于反相或正相色谱，其中最常用的是十八烷基硅烷（又称ODS）键合硅胶，可用于反相色谱或离子对色谱；离子交换填料，用于离子交换色谱；具一定孔径的大孔填料，用于排阻色谱。

4.1.3 高效液相色谱仪基本由泵、进样器、色谱柱、检测器和色谱数据处理机组成。检测器最常用的为可变波长紫外光检测器或紫外-可见光检测器，色谱信息的收集和处理常用积分仪或数据工作站进行。梯度洗脱，可用两台泵或单台泵加比例阀进行程控实现。

4.2 高效液相色谱仪的使用要求

4.2.1 按国家技术监督局国家计量检定规程汇编中“实验室液相色谱仪检定规程（JJG705-90）”的规定作定期检定，应符合规定。

4.2.2 仪器各部件应能正常工作，管路为无死体积连结，流路中无堵塞或漏液，在设定的检测器灵敏度条件下，色谱基线噪音和漂移应能满足分析要求。

4.2.3 具体仪器在使用前应详细参阅各操作说明书。

4.3 流动相的制备：用高纯度的试剂配制流动相，必要时照紫外分光度法进行溶剂检查应符合要求。水应为新鲜制备的高纯水，可用超级纯水器制得或用重蒸馏水。对规定PH值的流动相应使用精密PH计进行调节。配制好的流动相应通过0.45μm适宜的滤膜滤过，用前应脱气。应配制足量的流动相及时待用。

4.3.1 供试溶液的配制：供试品用规定溶剂配成供试溶液。定量测定时，对照品溶液配制1份，样品供试溶液配制2份。供试溶液在注入色谱仪前，一般应经0.45μm适宜的滤膜滤过。必要时在配制供试溶液前，样品需经提取净化，以免对色谱系统产生污染。

4.3.2 检查上次使用记录和仪器状态：检查色谱柱是否适用于本次试验，色谱柱进出口位置是否与流动相的流向一致，原保存溶剂与现用流动相能否互溶，流动相的PH值与该色谱柱是否相适应。仪器是否完好，仪器的各开关位置是否处于关断的位置。

4.4 操作

4.4.1 泵的操作

4.4.1.1 用流动相冲洗滤器，再把滤器浸入流动相中，启动泵。

4.4.1.2 打开泵的排放阀，用专用注射器从阀口抽出流动相约20ml，设置高流速（9ml/min)或用冲洗键PURGE 进行充泵排气，观查出口处流动相呈连续液流后，将流速逐步回零或停止（STOP）冲洗，关闭排放阀。

4.4.1.3 将流速调节至分析用流速，对色谱柱进行平衡，同时观察压力指示应稳定，用干燥滤纸片的边缘检查柱管各连接处应无渗漏，初始平衡时间，一般约需30分钟。

4.4.2 紫外可见光检测器和色谱数据处理机的操作：

4.4.2.1 开启检测器电源开关，选择光源（氘或钨）灯，选定检测波长，待稳定后测试参比和样品光路的信号应符合要求。设置吸收度方式和检测响应时间，（一般不大于1秒），设置

满刻度吸收值（适用于记录仪）。

4.4.2.2 开启色谱处理机，设定处理方法，初步设定衰减，纸速，记录时间，最小峰面积等参数，或设定记录仪的纸速和衰减。

4.4.2.3 进行检测器回零操作，检查处理机的电平（LEVEL）应符合要求，或检查记录仪的笔应处在设定的起始位置，如有变动，可继续回零操作直至符合要求。

4.4.2.4 记录基线，待稳定后，进行处理机斜率测试，符合要求方能进行操作。

4.4.3 进样操作（方通阀式进样器）

4.4.3.1 把进样器手柄放在载样位置（LOAD)。

4.4.3.2 用供试溶液清洗配套的注射器，再抽取适量，用定量环(LOOP）载样，则注射器抽取量应不少于定量环容积的5倍，在排除气泡后方能向进样器中注入供试溶液。

4.4.3.3 把注射器的平头针直插至进样器的底部，注入供试溶液，除另有规定外，注射器不应取下。

4.4.3.4 把手柄转至注样位置（INJECT），定量环内供试溶液即被流动相带入流路。

4.4.4 色谱数据的收集和处理。

4.4.4.1 注样的同时启动数据处理机，开始采集和处理色谱信息，如系统记录仪，则注样同时按一下记号键作起记号。

4.4.4.2 最后一峰出完后，应继续走一段基线，确认再无组分流出，方能结束记录。

4.4.4.3 根据第一张预试的色谱图，适当调整衰减、纸速、记录时间等参数，使色谱峰信号在色谱图上有一定强度。定量测定中，一般峰顶不得超过记录满量程。再按（4.4.3.1-4.4.4.1)进行正式分析操作。

4.4.4.4 含量测定的对照溶液和样品供试溶液每份至少注样2次。由全部注样结果(n≥4)求得平均值，相对标准偏差（RSD）应不大于1.5%。

4.4.4.5 色谱系统适用性试验应符合中国药典的要求，如按指定峰计算的理论板数(n)和拖尾因子(T)及相邻峰之间的分离度(R)计算公式为：

n=5.54(tR/Wh/2)2

其中：tR为保留时间，Wh/2为半高峰宽，取相同单位。

T=W0.05/(2d1)

其中：W0.05为离基线5%峰高处的峰宽，d1为峰上升边高5%峰高处的距离。

R=2（tR2-tR1）/(W1+W2)=1.18(tR2-tR1)/(W1h/2+W2h/2)

其中：tR1和tR2分别为相邻前后二峰的保留时间，W1和W2则分别为其峰的底宽，T和W取相同单位。W1h/2、W2h/2为峰1、2的半高峰宽。

4.4.5 测定结果处理

4.4.

5.1 峰面积归一法

按药品标准有关项下进行峰面积归一法求组分含量的，按下式计算：

百分含量[C%]=[∑Ai/∑A]×100%

其中∑Ai为被测含量组分峰面积，∑A为参与计算的全部峰面积之和。

4.4.

5.2 内标法：用含对照品和内标物质的对照溶液所得色谱峰响应值，按下式算出校正固子（f）：

f=(As/ms)/(Ar/mr)

其中：As和Ar分别为内标物质和对照品的峰面积或峰高，ms和mr分别为加入内标物质和对照品的量。

再根据含内标物质的供试品溶液色谱峰响应值，计算含量（mi）:

mi=f×Ai/(As/ms)

其中：Ai和As分别为供试品和内标物质的峰面积或峰高，ms为加入内标物质的量，必要