外周血单个核细胞分离方法探讨
外周血单个核细胞
外周血单个核细胞（Peripheral blood mononuclear cell, PBMC）即外周血中具有单个核的细胞，包括淋巴细胞和单核细胞。
体外检测淋巴细胞首先要分离外周血单个核细胞，目前主要的分离方法是Ficoll-hypaque（聚蔗糖－泛影葡胺）密度梯度离心法，因为血液中各有形成分的比重存在差异，因此得以分离。
红细胞和粒细胞密度大于分层液，同时因红细胞遇到Ficoll而凝集成串钱状而沉积于管底。
血小板则因密度小而悬浮于血浆中，唯有与分层液密度相当的单个核细胞密集在血浆层和分层液的界面中，呈白膜状，吸取该层细胞递经洗涤离心重悬。
本法分离单个核细胞纯度可达95%，淋巴细胞约占90%～95%，细胞获得率可达80%以上，其高低与室温有关，超过25℃时会影响细胞获得率。
●人外周血单核细胞（PBMC）分离及培养PBMC（peripheral blood mononuclear cell），外周血单个核细胞，顾名思义，其主要细胞类型为血液里边具有单个核的细胞，主要包括淋巴细胞（Ｔ＼Ｂ），单核细胞，吞噬细胞，树突状细胞和其他少量细胞类型。
其中淋巴细胞占很大一部分。
分离ＰＢＭＣ的主要目的是为了将多核细胞和红细胞去除，从而能够很方便地模拟体外的血液免疫环境。
Ficoll是蔗糖的多聚体，呈中性，平均分子量为400,000，当密度为1.2 g/ml仍未超出正常生理性渗透压，也不穿过生物膜。
红细胞、粒细胞比重大，离心后沉于管底；淋巴细胞和单核细胞的比重小于或等于分层液比重，离心后漂浮于分层液的液面上，也可有少部分细胞悬浮在分层液中。
吸取分层液液面的细胞，就可从外周血中分离到单个核细胞。
●工具／原料全血（以10ml为例）无菌PBS溶液(pH7.4) 或者生理盐水蔗糖溶液（Ficoll Pague PLUS) (GE Healthcare Life Sciences #17-1440-02)RPMI 1640培养基（Invitrogen）胎牛血清（FBS）（GIBCO）双抗P/S （Penicillin/ Streptomycin) (GIBCO)二甲亚砜（DMSO）（SIGMA）预先装好异丙醇的冻存盒●方法／步骤配制所需的溶液：a. 细胞培养基：RPMI 1640+10% FBS+1% P/S；b. 细胞冻存液：FBS中加入10%DMSO；1．将10ml全血转入50ml离心管中，加入10ml PBS溶液稀释，轻轻混匀；2. 取两支15ml离心管，先加入5ml Ficoll溶液。
外周血单个核细胞的分离
聚蔗糖－泛影葡胺分层液法
一、原理
1. 单次密度梯度分离法 单次密度梯度 连续密度梯度
2. 试剂：Ficoll－Hypaque
Ficoll：聚蔗糖，MW：40 000，高密 度，低渗透压、无毒性，6％Ficoll密度 为1.020 Hypaque：泛影葡糖胺，34％ hypaque 的密度为1.200，用于调整分离液的密度。 分离人外周血单个核细胞用1.077±0.001 的密度分离液。
免疫器官
胸腺、骨髓
脾脏、淋巴结
黏膜相关淋巴组织
组织
分离免疫细胞的目的
检测免疫细胞的数量和功能，观
察机体免疫状态
免疫细胞的细胞生物学研究 免疫细胞的培养和建株
分离免疫细胞的样本来源
外周血 脾脏 淋巴结 胸腺
骨髓
分离免疫细胞的一般原理
根据各种免疫细胞的物理学和生物 学特征不同将其分离 密度大小
瑞氏染色时第一液不能干，否则会有染料沉积。
此实验与下周实验一起写实验报告，用论文格 式。
（二）方法评价
是分离PBMC最常用的方法 操作简单，不需特殊仪器设备 分离纯度高，可达95％ 细胞得率高，可达80％
瑞氏染色
取细胞悬液涂片 甲醇固定，待干后加瑞氏燃料第一液染色3 －5min。 加第二液染1分钟。 洗涤，镜检
三、实验安排
每两个组抽一个同学的血。 每组做一支试管分离。 每位同学单独做染色。
要求计数100个细胞，计数单个核细胞 的百分率。
四、注意事项
血液加入到抗凝剂中和稀释血液时混匀不能太 用力，否则会溶血。 叠加血液时要小心，将毛细管贴近分离液并倾 斜离心管后再加血液。
外周血单个核细胞总RNA的分离纯化及其逆转录
4. 加10ul DEPC(焦磷酸二乙酯）水溶解RNA。
逆转录-PCR的原理
提取组织或细胞中的总RNA，以其中的mRNA作 为模板，采用Oligo(dT)或随机引物，利用逆转录 酶特异性地反转录成cDNA，再以cDNA为模板进 行PCR扩增，而获得目的基因。转录产物具有连 续的氨基酸编码区，不需要进行剪接，可在原核 细胞中表达。
RNA极易降解，因其RNA酶分布广、活性强、 且难以失活，痕量的RNA酶就能够造成严重的 RNA降解，实验中采用多种措施抑制RNA酶的 活性，减少RNA的降解。
抑制RNA酶活性的试剂
1. 焦磷酸二乙酯（DEPC)，一种强烈的烷化剂，能 够和RNA酶的活性基团组氨酸的咪唑环反应而以 抑制外源RNA酶。 2. 异硫氰酸胍，一种强蛋白变性剂，可使包括 RNA酶在内的所有酶活性丧失，抑制外源性RNA 酶活性。
实验步骤—— PCR扩增
反应体系：
10×Buffer 2 ml
Mg2+
1.5 ml
dNTP
2 ml
cDNA
5 ml
Taq
0.2 ml
primer
2 ml
ddH2O 总体积
17.3 ml 30 ml
反应条件： 94℃ 5min 94 ℃ 45s 56 ℃ 30s ×30c 72 ℃ 30s 72 ℃ 5min 4 ℃ 保存
结果与分析
PCR产物进行琼脂糖电泳鉴定，标明目的条 带，非目的条带。
具体实验结果分析，如果实验失败，请分析 原因，按实际实验出发。
注意事项——预防RNase污染
pbmc离心速度
pbmc离心速度
需要注意的是，离心速度只是离心分离的一个参数，离心时间和离心温度等因素也会对 PBMC分离的效果产生影响。因此，在进行PBMC离心分离时，需要根据具体实验的要求和 离心机的要求来确定 是外周血单个核细胞（Peripheral Blood Mononuclear Cells）的缩写，离心速 度是指将血液样本进行离心分离时，设定的离心机转速。
PBMC 分离通常采用梯度离心法，其中最常用的是Ficoll-Paque离心法。在这种方法中， 将血液样本加入到离心管中，然后加入一层Ficoll-Paque溶液。接下来，将离心管放入离心 机中进行离心分离。离心过程中，离心机的转速会影响离心分离的效果。
外周血单个核细胞分离的操作步骤！
外周⾎单个核细胞分离的操作步骤！外周⾎单个核细胞分离的操作步骤！简介周⾎单个核细胞包括淋巴细胞和单核细胞。
单个核细胞的体积、形态和⽐重与外周⾎其他细胞不同，红细胞和多核⽩细胞的⽐重在1.092左右，单个核细胞的⽐重为1.075-1.090，⾎⼩板为1.030-1.035。
因此利⽤⼀种介于1.075-1.092之间⽽近于等渗的溶液作密度梯度离⼼，使⼀定密度的细胞按相应密度梯度分布，可将各种⾎细胞与单个核细胞分离。
分离⼀、基本原理⼆、试剂与器材1、聚蔗糖—泛影葡胺分层液，Hank’s液，RPMI-1640培养液，肝素。
2、⽔平离⼼机。
三、操作步骤1、取外周静脉⾎，⽤肝素抗凝，加等量的Hank’s液并混匀。
2、将分层液加⼊试管中，⽤量约为⾎量的1/2。
⽤吸管沿管壁缓缓将⾎加⼊分层液⾯上。
3、置于⽔平离⼼机离⼼，1500r/min，10min。
可见绝⼤多数单个核细胞悬浮于⾎浆和分层液的界⾯，呈⽩膜状。
4、⽤尖吸管吸取界⾯的细胞层，置于另⼀试管中，加⼊适量的Hank's液，混匀后以1000r/min，离⼼10min，弃上清。
5、同法洗涤细胞2次。
6、将细胞重悬于RPMI-1640培养液中，4保存备⽤。
四、注意事项1、在分离外周⾎单个核细胞过程中，将稀释⾎液加于分层液上时，要避免冲散分层液⾯，⽽要使之形成良好的界⾯，否则影响分离结果。
2、此法操作得当，单个核细胞得率可达80%-90%，影响得率最重要的因素是分层液的⽐重。
淋巴细胞淋巴细胞来源于造⾎⼲细胞(hemopoietic stem cell，HSC)。
造⾎⼲细胞可分化成多能前体细胞( multipotent progenitor cell，MPC)，继⽽分化为淋巴样⼲细胞和髓样⼲细胞。
淋巴样⼲细胞可继续发育为成熟的T淋巴细胞、B淋巴细胞和NK细胞等。
⾻髓、胸腺造⾎微环境是造⾎⼲细胞分化发育的主要场所。
单个核细胞单个核细胞是⾎液⽩细胞中具有单个核细胞的⼀个含糊术语。
猪外周血单核细胞分离
猪外周血单核细胞分离
1.取新鲜抗凝血，400-500g离心5分钟，离心弃上清。
2.加入6-10倍细胞体积的红细胞裂解液，轻轻吹打混匀，裂解1-2
分钟。
例如细胞沉淀的体积为1ml，则加入6-10ml的红细胞裂解液。
本步骤在室温或4度操作均可。
注意：对于鼠的血液，裂解1-2分钟已经足够，对于人的外周血，宜延长裂解时间至4-5分钟，并且裂解过程中宜适当偶尔摇动以促进红细胞裂解。
3.400-500g离心5分钟，弃红色上清。
4℃离心效果更佳。
4.如果发现红细胞裂解不完全，可以重复上述步骤2和步骤3一次。
通常极微量的红细胞不会影响后续的一些检测。
5.洗涤1-2次：加入适量PBS、HBSS、生理盐水或无血清培养液，
重悬沉淀，400-500g离心2-3分钟，弃上清。
可再重复1次，共洗涤1-2次。
洗涤液的用量通常应至少为细胞沉淀体积的5倍。
4℃离心效果更佳。
6.将细胞用RPMI1640完全培养基重悬后，以1×106/ml铺于细胞
培养瓶，24小时候，轻轻吸取未贴壁细胞，贴壁细胞即是单核细胞。
人外周血单个核细胞的采集、分离和保存
ICS 07.080C40 CMBA 团体标准T/CMBA 011—2020人外周血单个核细胞的采集、分离和保存 Collection, separation and preservation of PBMC from human peripheral blood2020-12-28发布2020-12-28 实施86 中国医药生物技术2021年2月第16卷第1期Chin Med Biotechnol, February 2021, V ol. 16, No. 1中国医药生物技术协会团体标准·DOI: 10.3969/j.issn.1673-713X.2021.01.016·T/CMBA 011—2020目 次前言 (87)1 范围 (88)2 规范性引用文件 (88)3 术语和定义 (88)4 总则 (89)5 实验原理 (89)6 实验方法 (89)7 质量控制 (92)参考文献 (93)中国医药生物技术2021年2月第16卷第1期Chin Med Biotechnol, February 2021, V ol. 16, No. 1 87T/CMBA 011—2020前 言本文件按GB/T 1.1-2020 给出的规则起草。
本文件由中国医药生物技术协会归口。
本文件起草单位：中国医药生物技术协会组织生物样本库分会、生物芯片上海国家工程研究中心、上海芯超生物科技有限公司、广州中医药大学第二附属医院（广东省中医院）。
本文件主要起草人：郜恒骏、沈晓莹、杜莉利、亓垚、张小燕、许靖曼、陈明敏、陈曲波、叶扬、李迪。
88 中国医药生物技术2021年2月第16卷第1期Chin Med Biotechnol, February 2021, V ol. 16, No. 1 T/CMBA 011—2020人外周血单个核细胞的采集、分离和保存1 范围本文件规定了采集、分离和保存人外周血单个核细胞的实验原理、实验方法和质量控制。
简易外周血单个核细胞分离方法的探索
・２７４・ ・方法与技术・ 山西医科大学学报（Ｊ Ｓｈａｎｘｉ Ｍｅｄ Ｕｎｉｖ）２０１０年３月，４ｌ（３
简易外周血单个核细胞分离方法的探索 樊卫平 ， 宋玉靖 ， 郝颜琴 ０３０００１； 徐州９７医院实验科； ， 刘军权 ， 陈复兴 ， 王宏伟ｈ （ 山西医科大学微生物免疫教研室，太原 通讯作者，Ｅ—ｍａｉｌ：ｗａｎｇｈｗ６８＠ｈｏｔｍａｉｌ．ｅｏｍ）
摘要： 目的探索简单、经济易行的大容量血样无菌分离外周血单个核细胞（ＰＢＭＣ）的方法。 方法同时用新方法和经 典的聚蔗糖一泛影葡胺密度梯度离心法分离同一份血样。配对ｔ检验分析比较两种方法获取ＰＢＭＣ的数量。新方法采用先 离心抗凝血，取出血浆与红细胞交界层，再用经典分离法分离交界层获得ＰＢＭＣ，余留抗凝血再次离心取出交界层并分离获取 ＰＢＭＣ。 结果新方法得到的ＰＢＭＣ总数不低于经典分离法（Ｐ＞０．０５）。 结论该法能简单安全地从大量血样中无菌分 离ＰＢＭＣ。 关键词：ＰＢＭＣ；分离 中图分类号：Ｒ３２９—３３ 文献标志码：Ａ 文章编号： １００７—６６１１（２０１０）０３—０２７４—０３
Ｅｘｐｌｏｒａｔｉｏｎ ｏｎ ｔｈｅ ｓｉｍｐｌｅ ａｎｄ ｅａｓｙ ｗａｙ ｆｏｒ ｉｓｏｌａｔｉｎｇ ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ ｂｌｏｏｄ ｍｏｎｏｎｕｄｅａｒ ｃｅｌｌ ＦＡＮ Ｗｅｉ—ｐｉｎｇ ，ＳＯＮＧ Ｙｕ—ｊｉｎｇ ，ＨＡＯ Ｙａｎ。ｑｉｎ ，ＬＩＵ Ｊｕｎ—ｑｕａｎ ，ＣＨＥＮ Ｆｕ ｘｉｎｇ２，ＷＡＮＧ Ｈｏｎｇ—ｗｅｉ （ Ｄｅｐｔ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｓｈａｎｘｉ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｔａｉｙｕａｎ ０３０００１，Ｃｈｉｎａ； Ｄｅｐｔ ｏｆＭｅｄｉｃａｌ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ，９７ｔｈ Ｈｏｓｐｉｔａｌ ｏｆＰＬＡ； Ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇ ａｕｔｈｏｒ，Ｅ—ｍａｉｌ：ｗａｎｇｈｗ６８＠ｈｏｔｍａｉｌ．ｃｏｎ） Ａｂｓｔｒａｃｔ： Ｄ ｃｔｉｖｅ Ｔｏ ｅｘｐｌｏｒｅ ａｎ ｅｃｏｎｏｍｉｃａｌ ａｎｄ ｐｒａｃｔｉｃａｌ ｗａｙ ｆｏｒ ｉｓｏｌａｔｉｎｇ ＰＢＭＣ ｆｒｏｍ ｈｉｇｈ—ｃａｐａｃｉｔｙ ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ ｂｌｏｏｄ ｗｉｔｈ ｓｔｅｒｉｌｅ ｏｐｅｒａｔｉｏｎ． Ｍｅｔｈｏｄｓ ＰＢＭＣｓ ｗｅｒｅ ｉｓｏｌａｔｅｄ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ｓａｍｅ ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ ｂｌｏｏｄ ｓａｍｐｌｅ ｂｙ ｔｈｅ ｎｅｗ ｗａｙ ａｎｄ ｔｈｅ ｃｌａｓｓｉｃ ｗａｙ ｏｆ Ｆｉｃｏｌｌ—Ｈｙａ— ｑｕｅ ｄｅｎｓｉｔｙ ｇｒａｄｉｅｎｔ ｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｔｉｏｎ ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ．Ｔｈｅ ｑｕａｎｔｉｔｙ ｏｆ ｔｈｅ ＰＢＭＣ ｉｓｏｌａｔｅｄ ｂｙ ｔｈｅ ｔｗｏ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｗａｙｓ ｗｅｒｅ ａｎａｌｙｚｅｄ ｂｙ ｐａｉｒｅｄ ｔ－ ｔｅｓｔ．Ｂｙ ｔｈｅ ｎｅｗ ｗａｙ，ｔｈｅ ａｎｔｉｃｏａｇｕｌａｔｅｄ ｂｌｏｏｄ ｗａｓ ｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｔｅｄ，ｔｈｅｎ ｔｈｅ ｂｏｕｎｄａｒｙ ｌａｙｅｒ ｂｅｔｗｅｅｎ ｐｌａｓｍａ ａｎｄ ｅｒｙｔｈｒｏｃｙｔｅｓ ｗａｓ ｅｘｔｒａｃｔ— ｅｄ．ａｎｄ ｆｉｎａｌｌｙ ＰＢＭＣｓ ｗｅｒｅ ｉｓｏｌａｔｅｄ ａｎｄ ｇａｉｎｅｄ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ｂｏｕｎｄａｒｙ ｌａｙｅｒ ｂｙ ｔｈｅ ｃｌａｓｓｉｃ ｗａｙ．Ｔｈｉｓ ｐｒｏｃｅｓｓ ｗａｓ ｒｅｐｅａｔｅｄ ｔｏ ｇｅｔ ｍｏｒｅ ＰＢ— ＭＣ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ｒｅｍｎａｎｔ ｂｌｏｏｄ． Ｒｅｓｕｌｔｓ Ｔｈｅ ＰＢＭＣｓ ｉｓｏｌａｔｅｄ ｔｈｒｏｕｇｈ ｔｈｅ ｎｅｗ ｗａｙ ｗｅｒｅ ｎｏｔ ｌｅｓｓ ｔｈａｎ ｔｈａｔ ｏｆｔｈｅ ｃｌａｓｓｉｃ ｗａｙ（Ｐ＞０．０５）． Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ Ｔｈｅ ｎｅｗ ｗａｙ ｉｓ ｓｉｍｐｌｅ ａｎｄ ｅａｓｙ，ａｎｄ ｃａｎ ｂｅ ｕｓｅｄ ｔｏ ｉｓｏｌａｔｅ ＰＢＭＣｓ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ｈｉｇｈ—ｃａｐａｃｉｔｙ ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ ｂｌｏｏｄ ｗｉｔｈ ｓｔｅｒｉｌｅ ｏｐｅｒａｔｉｏｎ． Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ：ＰＢＭＣ； ｉｓｏｌａｔｉｏｎ
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对外周血单个核细胞分离方法探讨韩亚萍刘源章莉莉刘婷李军黄祖瑚 2004-7-24 17:06:00 中华现代临床医学杂志 2003年11月第1卷第9期【摘要】目的探讨外周血单个核细胞（PBMC）的不同分离方法对分离效果、贴壁能力以及淋巴细胞的增殖活性的影响。
方法取肝素抗凝血，分别用羟乙基淀粉（hydrixyethylstarch，HES）自然沉降法、HES离心沉淀法、Ficoll密度梯度离心法三种方法分离单个核细胞，直接进行贴壁计数及多种细胞因子诱导的杀伤细胞（Cytokine-induced killer，CIK）培养。
结果 HES自然沉降法、HES离心沉淀法、Ficoll 密度梯度离心法分离的PBMC回收率分别为86.4%、86.0%、85.1%。
结论羟乙基淀粉离心沉淀法可有效地分离PBMC。
关键词羟乙基淀粉淋巴细胞分离液单核细胞Study on the methods of separating peripheral blood mononuclear cellsHanYaping，Liu Yuan，Zhang Lili，et al.Deparment of Infectious Diseases，The First Affiliated Hospital of Nanjing M edical University，Nanjing210029.【Abstract】 Objective To investigate the difference among three protocols o f isolating peripheral blood mononuclear cells（PBMCs）through observing the re covery rate，t he adherent ability and lymphocytes proliferation acˉtivity of t he isolated PBMCs.Methods Use three different isolation protocols，HES（hydrixy ethylstarch）sedimentation method，HES centrifugation method and Ficoll density gradient centrifugation，to isolate PBMCs from healthy donors.Then compare these isolation protocols through observing the recovery rate of PBMCs，the number of plastic-adherent cells and the cytokine-induced killer cells proliferation.Resul ts The recovery rate of PBMCs is86.4%by HES sedimentation method，83.7%by HES c entrifugation and sedimentation method and85.1%by Ficoll density gradient centr ifugation［method］ separately.Conclusion Our observation provide evidence that HEScentrifugation method could efficiently isolate PBMCs from human peripheral blood.Key words hetastarch ficoll monocyte外周血单个核细胞分离效果直接影响细胞培养结果，经典的Ficoll密度梯度常用于少量血液分离，而在血液较多时则须分成许多离心管，重复地开放操作增加了污染机会。
为此，我们用HES离心沉淀法代替Ficoll密度梯度离心法分离PBMC，对不同方法获取PBMC的贴壁能力和CIK细胞增殖活性等作一较为系统的探讨。
1 材料和方法1.1 材料外周血:健康成人外周血10份。
Ficoll:上海试剂二厂，分子量400000。
6%H ES:DUPONT公司生产，分子量480000。
1.2 方法1.2.1 外周血单个核细胞的分离 HES自然沉降法［1］ :即肝素抗凝血与6%HES按5:1混合，自然沉降60min，取上层液400×g离心10min，以RPMI1640洗两遍备用。
HES离心沉淀法:分别将抗凝血与HES12:1、7:1、6:1、5:1、3:1、2:1，使HES终浓度为0.5%、0.85%、1.0%、1.2%、2.0%和3.0%条件下20℃60×g离心10min，取上层液400×g 离心10min，以RPMI1640洗两次备用。
Ficoll密度梯度离心法［2］ :肝素抗凝血先与RPMI1640培养液1:1混合，再加等量淋巴细胞分离液600×g离心20min，小心吸取单个核细胞层，以RPMI1640洗两遍备用。
1.2.2 PBMC的处理将不同分离方法获取的PBMC计数后重悬于完全培养基中，分别加入24孔培养板，每孔4×10 6细胞，37℃，5%CO 2 培养2h后吸取培养上清，用RPMI1640轻轻洗涤培养孔3次以去除非贴壁细胞。
收集贴壁细胞计数并用荧光素标记的单克隆抗体通过荧光激活细胞分离器（FACS Vantage SE）鉴定。
悬浮细胞用完全培养基调整细胞浓度至1×10 6 /ml，补充适量的CD3单抗、rh-IFN、IL-2等，共同培养多种细胞因子诱导的杀伤细胞（CIK），每3天换液1次并计数，第10天收获细胞，计算增殖倍数，同时以荧光素标记的单克隆抗体鉴定细胞类型。
1.2.3 统计学方法应用SAS6.12统计软件进行方差分析、t检验。
数值以平均数±标准差表示。
2 结果2.1 不同分离方法PBMC回收率 HES终浓度在0.5%、0.85%、1.0%、1.2%、2.0%和3.0%条件下进行离心沉淀和自然沉降，结果显示HES终浓度≥1.0%时PBMC回收率最高，为此我们确定HES终浓度1.2%为最后实验浓度。
用HES离心沉淀法和自然沉降法分离的PBMC总数相近，与传统的Ficoll密度梯度离心法比较也无统计学差异（P>0.05），结果见表1。
2.2 不同分离方法PBMC贴壁能力 HES自然沉降法、HES离心沉淀法、Ficoll分离法其CD14 +细胞FACS检测平均百分率分别为38.69%、68.70%、64.54%，HES自然沉降法明显低于后两法（P<0.01），HES自然沉降法中含有较多的CD3、CD19、CD56细胞见图1。
2.3 不同分离方法PBMC增殖活性 HES自然沉降法、HES离心沉淀法和Ficoll分离法所获得PBMC，其CIK细胞增殖能力接近，第10天略有差别但无统计学差异（P>0.05）。
见图2。
图1 不同分离方法PBMC的贴壁能力略图2 不同分离方法CIK细胞增殖能力的比较略表1 不同分离方法PBMC回收率略3 讨论分离PBMC是一项常规工作，传统的是采用Ficoll密度梯度离心法，Ficoll是一种粘性强的液体，其比重为1.077，在一定离心力的作用下，比重大于淋巴细胞的红细胞及多核粒细胞等沉淀于分离液的底层，单个核细胞在分离液的界面上。
操作时需将抗凝血作适当稀释，比较适用于少量血液的分离，在血量较多时要分成数管进行离心，十分不便，而且重复多次地开放性操作也增加了污染机会。
HES是一种血浆代用品［3］，原料来自于天然绿色植物玉米，由高分子量支链淀粉经降解、羟乙基化并进一步加工处理后制成。
HES与红细胞膜上的负电荷结合，使红细胞彼此以凹面相贴，重叠在一起的红细胞下沉阻力减少，红细胞与血浆及单个核细胞形成清晰的界面。
抗凝血与终浓度为1%～2%的HES混合后经低速离心可加快红细胞的下沉，便于吸取含单核细胞的血浆层，使PBMC的分离过程简单化，有利缩短工作时间，提高工作效率。
此外，用HES分离PBMC也可在封闭系统中即血袋中进行［1］，非开放性操作可减少污染机会。
与F icoll法相比HES离心沉淀法除简化了操作外，也减少了耗材，降低了试验成本［4］。
Denning ［5］等用HES沉降法分离脐血单个核细胞发现，脐血单个核细胞的回收率可受分离前脐血放置时间和温度的影响。
我们将新鲜采集的血液与HES混匀后常温（22℃～25℃）静置60min获取的PBMC，其细胞活率及贴壁能力都低于HES离心沉淀法，不规则细胞形态增加，是否与细胞在相对高浓度的HES中浸泡时间过长有关，还有待于观察。
将肝素抗凝血与HES在离心管中按最适比例混匀后直接60×g离心10min，所得到的细胞数量与其他方法相近（见表1），无统计学差异，而形态学和贴壁能力明显好于HES自然沉降法（P<0.01）。
HES有高、中、低三种分子量，不同的分子量其分离效果各有差异［6］。
因此，选择合适的HES浓度和分子量可以确保分离效果。
总之，在获取PBMC时应根据血量多少和实验室的条件来选择不同的分离方法。
本实验室用6%HES离心沉淀法分离的外周血单个核细胞回收率为86.0%，活细胞在97%以上。
在综合细胞纯度、细胞回收率、细胞活力以及操作的难易程度等因素，笔者认为HES离心沉淀法不失为分离PBMC首选的方法之一。
参考文献1 Rubinsten P，Taylor PE，Scaradavou A，et al.Unrelated placental blood for bone marrow reconstitution:organization of the placental blood proˉgram.Blood Cells，1994，20:587-600.2 北京医学院微生物学教研组编.实验免疫学.北京:人民卫生出版社，1980，435-436.3 Forster H.Physical and chemical properties of hydroxyethylstarch.Plasˉma Volume Expansion，1992，105-121.4 Rubinstein P，Dobrila L，Rosenfield RE，et al.Processing and cryopˉreserv ation of placental/umbilical cord blood for unrelated bone marrow reconstitutio n.Proc Natl Acad Sci，1995，92:10119-10122.5 Denning-kendall P，Donaldson C，Nicol A，et al.Optimal processing of human umbilical cord blood for clinical banking.Exp Hematol，1996，24:1394-1401.6 Kenichi S，Mikitomo Y，Ryo S，et al.Cell processing for。