分子标记辅助选择

第十七章分子标记辅助选择育种

分子标记：以DNA多态性为基础的遗传标记

分子标记的特点：1、遗传多态性高；2、在基因组中大量存在且均匀分布；3、稳定性、重现性好；4、信息量大，分析效率高

第一节分子标记的类型及原理

一、分子标记的类型

1、以DNA-DNA杂交为基础的DNA标记技术：限制性片段长度多态性标记，简称RFLP标记；可变数目串联重复序列标记，简称VNTR标记；原位杂交，简称ISH

2、基于PCR的DNA标记：1）单引物PCR标记；2）双引物选择性扩增的PCR标记；3）通过克隆、测序来构建特殊双引物的PCR标记。

3、基于PCR与限制性内切酶技术相结合的DNA标记。分为两类：限制性酶切片段的选择性扩增，如AFLP；PCR扩增片段的限制性酶切，如CAPs

4、基于单核苷多态性的DNA标记：单核苷酸多态性，简称SNP

二、主要分子标记

1、RFLP（Restriction Fragment Length po1ymorpams）限制性片段长度多态性

1980，Bostein用限制性内切酶酶切不同个体的基因组DNA后，含有与探针序列同源的酶切片段在长度上的差异。（1）RFLP标记的原理

基因组DNA序列上的变化：碱基替换、插入、缺失或重复造成某种限制性内切酶（restriction enzymes ）酶切位点的增加或丧失以及内切酶酶切位点间DNA片段变化

（1）RFLP标记的分析步骤

（2）RFLP分析探针

单拷贝或寡拷贝

探针来源：cDNA克隆；基因组克隆（Random Genome）；PCR克隆

（3）RFLP标记的特点

优点：①数目几乎无限；②共显性；③可以利用现有探针，具有种族特异性；④RFLP标记遍及全基因组；⑥重复性好缺点：成本较高;一个探针只能产生一个多态位点；需要许多克隆探针；所需DNA量大(5～15μg)；易造成环境污染

2、RAPD（Random Amplification Polymorphism DNA）随机扩增多态性DNA

1990,Williams通过PCR扩增染色体组DNA所获得的长度不同的多态性DNA片段。

如随机排列的寡聚脱氧核苷酸单链引物（10个核苷酸）。

PCR，聚合酶链式反应（polymerase chain reaction）

Mullis等(1985)PCR反应：变性、复性、延伸。特异性取决于引物与模板DNA结合的特异性。

RAPD与经典的PCR反应的区别：①引物；②反应条件；③扩增产物

AP-PCR（Arbitrarily primed polymerase chain reaction)：任意引物PCR；引物长度与一般PCR反应中的引物相当；开始阶段退火温度较低

DAF（DNA amplification fingerprinting）：DNA扩增指纹；引物长度比RAPD更短，为5～8个核苷酸；DAF复性和延伸常用同一种温度

（2）RAPD标记的特点

优点：1）可检测未知序列的基因组DNA；2）引物无种族特异性；3）RAPD技术简单；4）单个引物可产生几个多态位点；5）通过克隆测序可转化成SCAR（特异序列扩增区域标记）；

缺点：1）再现性差；2）显性遗传；3）存在共迁移问题

3、AFLP（Amplified Fragment Length Polymorphisms）扩增片段长度多态性

1993，Zabeau marc和V os pieter是对限制性酶切片段的选择性扩增。

（1）AFLP标记的原理：基因组的DNA进行双酶切；人工接头连接；PCR反应的引物；凝胶电泳

限制性酶：酶切频率较高的限制性酶（frequent cutter），产生易于扩增基因组DNA。酶切频率较低的限制性酶（rare cutter），限制扩增模板DNA片段的数量。

AFLP扩增数量由酶切频率较低的限制酶在基因组中的酶切位点数量决定。

AFLP分析的基本步骤：1）限制性核酸酶双酶切基因组DNA；2）DNA片段两端连接上特定的接头；3）选择扩增；4）聚丙烯酰胺凝胶电泳；5）凝胶转移，干胶处理；6）自显影；（荧光标记、银染）

优点：1）数目和种类很多；2）一次PCR反应可检测多个遗传位点；3）AFLP分析模板用量少；4）分辨率高；5）假阳性低，可靠性高；6）AFLP标记多数为显性；

缺点：分析成本高；DNA的纯度及内切酶质量要求也比较高；甲基化敏感酶易产生假假阳性。

4、SSR（Simple Sequence Repeat）1987，Nakamura生物基因组内有一种短的重复次数不同的核心序列

可变数目串联重复序列，简称VNTR（小卫星（minisatellites、微卫星（microsatellites）

简单重复序列，又称微卫星：DNA一类由1—6个碱基组成的基序（motif）串联重复而成的DNA序列。

（1）SSR标记的原理：微卫星DNA两端的序列是相对保守的单拷贝序列。根据微卫星DNA两端的单拷贝序列设计一对特异引物，利用PCR技术，扩增每个位点的微卫星DNA序列，通过电泳分析核心序列的长度多态性。

建立SSR标记的一般程序：①建立基因组DNA的质粒文库；②设计并合成探针，筛选重组克隆；③阳性克隆DNA插入序列测序；④根据SSR两侧序列设计并合成引物；⑤PCR扩增；⑥凝胶电泳检测

（2）SSR标记的特点：1）数量几乎无限，检测出多态性的频率极高；2）检测一个单一的多等位基因位点。3）多数为共显性标记；4）重复性高，稳定可靠；5）需DNA样品量少，对DNA质量要求亦不苛刻；

使用SSR技术的前提是需要知道重复序列两翼的DNA序列。

ISSR标记：相邻SSR区域内的引物去扩增中间的单拷贝序列。引物设计采用2－4个核苷酸序列为基序（motifs），以其不同重复次数再加上几个非重复的锚定碱基。

小卫星（minisatellites）标记：核心序列长度为10-60bp，常用Southern杂交方法检测。用小卫星做探针，与限制性内切酶酶切的基因组DNA杂交，检测其多态性。

5、SCAR（Sequence Characterized Amplification Region）特异序列扩增区域标记：

一般步骤：RAPD分析；克隆片段两端测序；设计长为18～24bp的引物；PCR扩增检测

优点、：高的重复性；共显性遗传

6、CAPS（Cleaved Amplification Polymorphism Sequence-tagged Site）切割扩增多态序列标签位点技术，又称PCR-RFLP 基本步骤：特定引物PCR扩增；PCR扩增产物限制性内切酶酶切；酶切产物凝胶电泳检测

CAPs标记的优点：①引物与限制酶组合非常多；②CAPS标记呈共显性；③所需DNA量极少；④结果稳定可靠；⑤操作简便、快捷；

7、STS（Sequence-tagged Sites）序列标签位点，简称序标位：指基因组中长度为200—500bp，且核苷酸顺序已知的单拷贝序列，可采用PCR技术将其专一扩增出来。

引物来源：RFLP单拷贝的探针序列；微卫星序列；表达基因序列；Y AC或cosmid插入末端序列

8、表达序列标签（Expressed sequence tags ，ESTs ）表达基因的部分序列，突出优点：共显性遗传。很容易在不同组合的遗传图谱间进行标记的转移，且是沟通植物遗传图谱和物理图谱的中介。

9、SRAP（Sequence-related amplified polymorphism）相关序列扩增多态性

引物17-18个碱基，包括13-14个碱基的核心区域（5’的10-11个碱基为填充区，随后正向为CCGG，反向为AA TT），核心区域后为3个选择碱基。

SRAP的特点：优点：1）每一反应可得大量多态位点；2）不需克隆任何序列，引物可用于不同生物；3）便利、简单；4）重复性好；5）PCR产物可直接测序。

10、SNP（simple nucleotide polymorphisms）单核苷酸多态性：等位基因遗传密码的单碱基差异。基因组中每隔1000个碱基就存在一单碱基差异。

一般通过对PCR产物、基因组文库、表达序列标签（EST）文库测序而获得。

特点：数量大。

第二节重要农艺性状基因连锁标记的筛选

一、遗传图谱的构建

1、作图群体的建立

（1）亲本的选配：亲本选择的原则：亲本间的DNA多态性丰富；亲本纯度高；杂交后代可育。

（2）群体的类型

重组近交系群体（RIL ）：RIL群体是杂交后代经过多代自交而产生的一种作图群体，通常从F2代开始，采用单粒的方法建立。常自交6-7代。

DH群体：单倍体经过染色体加倍形成的二倍体。

近等基因系群体：一组遗传背景相同或相近，只在个别区段存在差异的株系。

（3）群体的大小：构建分子标记骨架连锁图可用小群体150单株或家系。

2、图谱构建的理论基础：连锁图谱构建的理论是染色体的交换和重组。