基因重组葡萄糖异构酶工程产业化项目资金设计可行性研究报告(已成功初步设计可行性研究报告国家补助资金)

基因重组葡萄糖异构酶工程产业化项目 资金申请报告 1 第一章 项目的意义和必要性 第一节 国内外现状和技术发展趋势 一、国内外现状 葡萄糖异构酶（Glucose Isomerase，简称GI），能将D-木糖、D-葡萄糖、D-核糖等醛糖转化为相应的酮糖，工业上主要用作果葡糖浆生产的催化剂。1967年，美国首次成功的进行了葡萄糖异构酶的工业化应用，至今国外的果葡糖浆生产业均已转向葡萄糖异构酶技术。由于葡萄糖异构酶结构稳定，是目前世界上公认的研究酶的催化机制、建立完整的蛋白质工程技术的最好模型之一，具有巨大的经济价值和理论研究意义，国外投入了大量的人力、物力对葡萄糖异构酶的酶学性质、固定化工艺、基因工程、晶体学及其蛋白质工程进行了系统的研究。如比利时的植物遗传所、荷兰细菌遗传公司（Gist-brocades）、英国帝国理工学院生物工程中心、美国加州Cetus以及Amgen公司、加拿大及日本的一些研究机构等。 国内自六十年代起已开展了葡萄糖异构酶应用于果葡糖浆生产的研究，山东省食品发酵工业研究设计院通过诱变筛选获得的7号淀粉酶链霉菌M1033菌株，是国内在这方面最具应用价值的工业菌株之一。目前国内外主要是通过诱变筛选等手段来获得生产用菌株，中国科学技术大学生命科学学院是国内唯一开展葡基因重组葡萄糖异构酶工程产业化项目 资金申请报告 2 萄糖异构酶的蛋白质工程的研究单位。自国家“八六三”项目“葡萄糖异构酶的蛋白质工程”立项以来，项目组的研究人员对葡萄糖异构酶的催化机理及其蛋白质工程进行了多年的研究和探索。经十五年科技攻关，目前已完成葡萄糖异构酶的蛋白质工程改造，获得性质改良的基因重组葡萄糖异构酶；并利用基因工程方法构建高表达量的基因重组链霉菌工业生产菌株，获得了具有完整自主知识产权的同源重组基因工程菌株M1033WZ，其技术水平及工业应用价值在国内外处于领先水平。目前项目共获得3项国家发明专利：“SM33GI的突变酶GIG138P及一种提高GI热稳定性的突变方案”（专利号ZL95112782.9）、“一种葡萄糖异构酶的247位单突变体酶和138，247位双突变体酶及其构建方法”（专利号ZL97119714.8）、“表达M1033GI的突变酶GIG138P的基因工程菌株M1033WZ及其构建方法”(专利号：ZL02143031.4)，其中“表达M1033GI的突变酶GIG138P的基因工程菌株M1033WZ及其构建方法”已获得PCT国际专利受理。（见附件4-6、4-7、4-8、4-9、4-10、4-11）

葡萄糖异构酶市场方面，目前我国还没有自己的葡萄糖异构酶生产企业，国内市场完全由丹麦诺维信公司所垄断，其产品均为进口分装，目前国内市场销售价约为38万元/吨。

二、我国酶制剂产业现状 1965年，中国第一家酶制剂专业生产企业在无锡市成立，标基因重组葡萄糖异构酶工程产业化项目 资金申请报告 3 志着中国酶制剂工业的起步，40年来，我国酶制剂产业从无到有，至今已具有一定规模。目前我国酶制剂生产企业约100家，但均为中小型企业，现有年生产能力约40多万吨，已实现工业化生产的酶种有20多种，主要集中在糖化酶、淀粉酶、蛋白酶等三大类，大部分企业生产水平仅达到90年代末国际水平。 我国酶制剂生产厂家主要产品大多停留在技术含量低、利润率低的产品上，如目前市场上5万单位糖化酶工厂成本约4400元/吨，售价仅为4600元/吨，2000单位中温淀粉酶工厂成本约7000元/吨，售价仅为8000元/吨，10万单位蛋白酶工厂成本约7200元/吨，售价仅为8100元/吨。同时许多工业生产急需的酶种如葡萄糖异构酶、普鲁蓝酶、真菌淀粉酶、乳酸酶、溶菌酶等又需大量从国外进口，这种情况既严重影响了我国酶制剂行业的健康发展，又增加了下游生产行业的生产成本。 在当前的市场情况下，安徽*****生物技术有限公司紧抓机遇，依托中国科学技术大学的技术优势，生产科技含量高、技术壁垒高的基因重组葡萄糖异构酶，并将进一步发展多种高技术含量的酶种如普鲁兰酶、碱性蛋白酶、啤酒复合酶、真菌淀粉酶、乳酸酶、溶菌酶等，并争取以此带动国内的酶制剂生产企业赶上国外同行业水平。 基因重组葡萄糖异构酶工程产业化项目 资金申请报告

4 1991-1998年中国各类酶制剂的产量、总产量和销售情况 单位：千吨/百万元 表1-1 1991年 1992年 1993年 1994年 1995年 1996年 1997年 1998年 α-淀粉酶 11.65 13.98 20.00 24.88 30.89 35.00 32.00 38.00 糖化酶 67.82 74.26 74.80 93.44 125.11 160.00 150.00 138.00 蛋白酶 12.83 14.99 15.02 27.43 40.02 45.00 38.00 40.00 其它酶 0.13 0.05 0.26 - 0.29 - - 5.00 总产量 92.33 100.33 110.10 145.92 196.31 240.00 220.00 221.00 总销售额 190.18 225.95 250.13 328.93 416.73 521.60 478.01 480.00

2001年全国酶制剂行业重点生产企业 表1-2 北京市房山酶制剂总厂 无锡杰能科生物工程有限公司 黑龙江省肇东市酶制剂厂 天津市利华酶制剂技术有限公司 江苏江阴星达生物工程有限公司 山东省沂水隆大生物工程有限责任公司 河北邢台市翔宇生物工程有限公司 江西豪德集团生物工程实业有限公司 湖南津市市新型发酵有限责任公司 广东江门生物技术开发中心酶制剂厂 宜兴杰成生物工程有限公司 河南省三门峡发酵厂 苏州宏达制酶有限公司 张家港市金源生物化工有限公司 烟台盛元鸿生物工程有限公司 山东省安丘市酶制剂厂 湖南省津市鸿鹰祥生物工程有限公司 郑州市兴达发酵厂 河北胜利酶制剂厂 无锡市协达生物制品有限公司 连云港元升实业股份有限公司 赤峰红山生物工程有限公司

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5 2000年酶制剂行业收入最大的十家主要企业 表1-3 公司名称（成立年份） 主要产品

无锡杰能科生物工程有限公司(1993) 酶制剂 宜兴杰成生物工程公司(1992) 淀粉酶 河南省三门峡发酵厂(1980) 糖化酶 安丘市酶制剂厂(1990) 糖化酶 广州酶制品厂(1985) 木瓜酶 江阴市星达生物工程有限公司(1995) 糖化酶 河北省邢台市酶制剂厂(1953) 淀粉酶 吉林省吉发集团农业开发股份有限公司糊精厂(1987) 麦芽糊精 贵阳白云银星化工厂(1999) 触酶 烟台盛元鸿生物工程有限公司(1999) 酶制剂

三、技术发展趋势 从天然菌株中分离纯化得到的野生型葡萄糖异构酶早已商业化，并取得了良好的经济和社会效益，但同时存在着一定的局限性。主要表现在葡萄糖异构酶在较高的反应温度下稳定性不够理想，在异构化反应中，温度越高(直至105‴～110‴)，热力学平衡越趋向于果糖方向。因此，通过蛋白质工程改造葡萄糖异构酶的热稳定性，可以提高酶促反应速度，延长酶寿命，降低生产用酶量，增加反应平衡过程中果糖的产量。 目前各国科学家都在运用蛋白质工程技术改造葡萄糖异构酶，以寻求具有优越特性并适于工业化生产的葡萄糖异构酶及高表达菌株，使葡萄糖异构酶制剂工业从传统的依靠野生型菌株生基因重组葡萄糖异构酶工程产业化项目 资金申请报告 6 产发展到运用基因工程菌株生产的阶段。而在这个领域，中国科学技术大学生命科学学院走在了前沿。 国内外在葡萄糖异构酶的突变体构建方面存在多种突变方案，但真正通过蛋白质工程方法获得的有效突变，仅有比利时的Mrabet与法国、荷兰科学家合作构建的K253R，以及中国科学技术大学生命科学学院所构建的GIG138P和GIG138P-G247D等。中国科学技术大学生命科学学院所建立的葡萄糖异构酶蛋白质工程研究系统在完整性和有效性上都达到国际先进水平，在7号淀粉酶链霉菌M1033菌株葡萄糖异构酶晶体结构模型的基础上，确立了突变体的分子设计，并发现PDB所提供的橄榄色链霉菌葡萄糖异构酶晶体结构是错误的模型。

第二节 对产业发展的作用与影响 葡萄糖异构酶是生产果葡糖浆的催化剂。人们利用淀粉为原料，经液化、糖化、异构化等作用，生产出的含葡萄糖和果糖的混合糖浆，国内称果葡糖浆，国外称高果糖浆，并分为42型、55型和90型。其中42型果葡糖浆含糖71％、其中果糖占42％，葡萄糖52％，低聚糖6％，甜度与蔗糖相当。 果葡糖浆以其风味醇厚、食用后不会引起血糖升高、抑制体内蛋白质消耗等蔗糖不可比拟的优势，正在受到世人的青睐。尤其是果葡糖浆在人体内的代谢不需经过胰岛素途径，故糖尿病基因重组葡萄糖异构酶工程产业化项目 资金申请报告 7 人可以摄入果葡糖浆，这一突出优势更使近年来果葡糖浆的消费量年年攀升。 2002年，美国果葡糖浆的消费量为1084万吨，而我国仅为120万吨，远远低于发达国家的水平。目前发展果葡糖浆已引起了国务院、轻工部的重视，计划到2010年发展到330万吨规模，届时对葡萄糖异构酶的需求量将达到800吨/年。 果葡糖浆生产技术、尤其是酶制剂生产技术的落后是影响其发展的主要障碍。基因重组葡萄糖异构酶工程产业化项目的实施，对提高我国酶制剂产业化水平，推进国内食品行业的产品创新，提升食品生产技术水平，拉动农业产业化发展，节约稀有的土地资源，减少果葡糖浆生产的资源消耗，节省外汇资源等具有广泛而深远的意义。具体体现如下： 一、是进行农产品深加工、增加农产品高附加值、拉动农业产业化发展的需要 长期以来由于产品深加工技术落后，我国的许多农产品加工一直处于产品加工链的初端，获得的收益与高端加工相比有巨大的悬殊。利用本项目产品可以进行玉米等农产品的深加工，生产附加值相对较高、经济效益显著、人民生活需要的果葡糖浆，实现农业的产业化发展。 我国是淀粉生产的原材料大国，原料如玉米、薯干、马铃薯等资源丰富，以玉米为例，年产量已达1.2亿吨，居世界第二位，玉米的增产为发展果葡糖浆提供了物质基础。从市场看，进