包埋法固定化葡萄糖异构酶_王菲菲(1)
第五章-固定化酶
2．离子结合法 酶通过离子键结合于具有离子交换剂的水不溶 性载体的固定化方法。 • 常用载体：各种阴、阳离子交换剂。 如CM-纤
维素、DEAE-纤维素、DEAE-葡聚糖凝胶等
• 优点：操作简单，酶活性中心不易被破坏和酶
高级结构变化少，酶活力损失很少。
• 缺点：载体和酶的结合力 比较弱，酶易脱落。
3.共价结合法
• 相对活力：固定化酶活力与同量蛋白量
的溶液酶活力的比值
固定化酶活力 相对活力 100% 溶液酶总活力 残留酶活力
四、固定化酶（细胞）的半衰期
• t1/2 ：固定化酶（细胞）的活力下降为最 初活力1/2所经历的连续工作时间；衡量 操作稳定性的指标。
Fig. 2. Kinetic of ROL adsorption on the silica aerogels. The activity was measured using olive oil emulsion as substrate at pH 8.5 and 37 °C.
第五章 固定化酶与固定化细胞
第一节 酶的固定化
一、固定化酶（immobilized enzyme）：是 指在一定空间内呈闭锁状态存在的酶，能 连续进行反应，反应后的酶可以回收重复 使用。
优点：
①极易将固定化酶与底物、产物分开，简 化了提纯工艺，提高酶的使用效率； ②在大多数情况下，能够提高酶的稳定；
(五)固定化酶的米氏常数(Km)变化 • 中性载体：固定化酶的表观Km值上升。
• 载体与底物电荷相同：表观Km值显著 上升； • 载体与底物电荷相反：Km
？
四、影响固定化酶性能的因素
1．构象改变、立体屏蔽
• 构象改变：指固定化过程及酶和载体的 相互作用，引起了酶的活性中心构象发 生改变，从而导致酶活性改变的—种效 应。
微球形固定化α-葡萄糖苷酶的制备
微球形固定化α-葡萄糖苷酶的制备
微球形固定化α-葡萄糖苷酶的制备
将粉末状壳聚糖制备成微球形多孔载体,采用吸附-交联的方法将TGL固定化.研究表明,制备微球形多孔壳聚糖载体的取决于壳聚糖原料的分子量分布、壳聚糖的稀酸溶液浓度以及凝结液的组成等因素;当壳聚糖的相对分子质量为3.0×105左右,壳聚糖溶液浓度为2.5%,凝结液组成为2 mol/L NaOH∶40%甲醛=3∶2(体积比)或2 mol/L NaOH∶甲醇=3∶1(体积比)时,可制得微球形多孔壳聚糖载体.最佳固定化条件研究表明,对于脱乙酰度为88%的壳聚糖载体,加酶量为3×105 Unit/g 时,在pH 6.0条件下,室温吸附8 h,然后用2.0%的戊二醛在45 ℃交联9 h,可得到固定化酶的活力为2.342×105 Unit/g,酶活力回收率为78.1%,并具有较好的强度.
作者：彭志英岳振峰张学兵徐建祥赵谋明作者单位：华南理工大学生物科学与工程研究中心, 刊名：华南理工大学学报(自然科学版) ISTIC EI PKU 英文刊名：JOURNAL OF SOUTH CHINA UVIVERSITY OF TECHNOLOGY 年，卷(期)： 2001 29(6) 分类号：Q556 关键词：α-葡萄糖苷酶(EC3.2.1.20) 固定化壳聚糖微球形。
酵母蔗糖酶的固定化
酵母蔗糖酶的固定化实验三酵母蔗糖酶的固定化一、实验原理1.固定化酶通过物理或化学的方法，将水溶性的酶与水不溶性载体结合，使酶固定在载体上，并在一定的空间范围内进行催化反应的酶称为固定化酶。
与游离酶相比，固定化酶有以下优点:?提高酶的稳定性;?易与产物分离;?可反复利用。
酶的固定化方法有:吸附法、共价偶联法、交联法、包埋法。
本实验用壳聚糖固定化酵母蔗糖酶属共价偶联法。
由于载体带电性质的不同，会引起酶与底物亲和力的变化，从而引起米氏常数Km值的改变。
酶固定化后，对变性剂、抑制剂的抵抗能力增强，贮存稳定性和操作稳定性也得以提高。
2.酶活测定蔗糖酶催化非还原糖中的α-呋喃果糖苷键水解，具有相对专一性，能催化蔗糖水解生成葡萄糖和果糖。
本实验用测定生成还原糖(葡萄糖和果糖)的量来测定蔗糖水解的速度，在碱性条件下，还原糖与3,5-二硝基水杨酸(DNS)共热，DNS被还原为3-氨基-5-硝基水杨酸(棕红色物质)，还原糖则被氧化成糖醛酸及其它产物。
在一定范围内，还原糖的量与棕红色物质深浅成比例关系。
酶活定义: 在540 nm 光吸收处，光密度每增加0.001个光吸收值定义为1个酶活力单位。
二、实验材料、仪器和试剂1.材料壳聚糖、实验一纯化得到的酵母蔗糖酶酶液2.仪器移液管、注射器、分光光度计、水浴锅、铁架台等3.试剂(1)1% 3，5-二硝基水杨酸(DNS)试剂:酒石酸钾钠100 g溶于400 mL蒸馏水，加热中依次加入NaOH 5 g，3，5-二硝基水杨酸5 g，苯酚1 g，亚硫酸钠0.25 g，搅拌至溶。
冷却后定容至500 mL，储于棕色瓶室温保存。
(2)10%蔗糖溶液(3)0.1 mol/L pH 7.8 Tris-HCl缓冲液(4) 1%戊二醛溶液:将4 mL 25%戊二醛溶液用上述Tris-HCl缓冲液稀释至100mL (5)0.2 mol/L pH 4.5醋酸缓冲液三、实验步骤1.壳聚糖载体的制备及戊二醛的偶联(1)称取3 g壳聚糖溶于98 mL蒸馏水中，搅拌均匀，再滴加2 mL冰醋酸，搅拌至均匀的粘稠状。
葡萄糖-6-磷酸异构酶
葡萄糖-6-磷酸异构酶葡萄糖-6-磷酸异构酶（glucose-6-phosphate isomerase，GPI）是一种广泛存在于物种中的酶类，也是细胞生命过程中的重要催化酶之一。
GPI的主要功能是在糖代谢途径中催化D-葡萄糖-6-磷酸（G6P）异构化成D-果糖-6-磷酸（F6P），从而使其在酵解、糖异生等代谢途径中得以形成能量和生物大分子。
GPI的结构GPI是一种大小为约63kDa的单体酶，它由四个相同构架的α螺旋折叠域组成。
每个域中含有具有6个α螺旋的结构单元，与其他三个域通过整个GPI分子的相互作用形成稳定的四聚体结构。
这种结构特点使其在催化反应时具有一定的特异性和稳定性。
GPI的催化机制GPI的催化反应是一个经典的异构酶反应，其催化机制是在催化反应的过程中，GPI将G6P的羟基原子从C1位向C2位移动，同时还伴随着一个过渡的亚稳中间体或高能催化机质的形成。
该催化机理需要以下几个步骤：1. 将G6P的羟基离子向C2转移GPI的主要作用是将G6P的羟基离子从C1位向C2位转移。
这个步骤需要消耗催化酶和G6P中的水，同时还需要提高催化酶中的若干残基的活性。
2. 过渡状态的形成在反应中间状态下，葡萄糖-6-磷酸的结构发生了改变，尤其是C1和C2之间的空间位置被重新排列。
这种重组后的分子结构使得GPI更容易形成F6P。
3. F6P的生成当葡萄糖-6-磷酸中的羟基离子从C1转移到C2后，GPI就能够形成F6P，继而释放生成的物质。
GPI的生物学功能1. 糖分子分解GPI的主要生物学功能是帮助细胞对糖分子进行分解，使其能够进入细胞内其他代谢途径。
同时，GPI还参与了葡萄糖-6-磷酸的糖异生过程，通过GPI的作用将丙酮酸和甲醛磷酸转化为糖分子进一步合并和催化。
2. 能量代谢GPI也是细胞内能量代谢的重要催化酶之一。
它可以促进各种代谢物的合成和分解，使得细胞能够利用糖分子中的能量，从而维持其生命活动等各种能量依赖性代谢过程。