抑菌圈实验
放线菌抑菌圈实验
放线菌主要分布在土壤中（主要是链霉菌），其数量仅次于细菌。
一般在中性偏碱性、有机质丰富、通气性好的土壤中含量较多。
1 材料与方法1.1 材料1.1.1 仪器本项目研究所用主要仪器为：高压蒸汽灭菌锅，生化培养箱，分析天平，电热恒温鼓风干燥箱，微波炉，空气恒温震荡器。
1.1.2 试剂NaOH，乙醇，10%酚等。
1.1.3 菌种本实验所用指示菌为金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、大肠杆菌(Escherichia coli)。
1.1.4 培养基（1）高氏I号培养基（g/L）[3]：可溶性淀粉 20；NaCl 0.5；KNO3 1；K2HPO4•3H2O 0.5；MgSO4•7H2O 0,01；FeSO4•7H2O 0.5；琼脂粉15-25，加去离子水至1L, pH7.4-7.6。
121℃,灭菌20min。
（2）牛肉膏-蛋白胨培养基（g/L）[3]：牛肉膏3；蛋白胨10；NaCl5；琼脂粉15-20，加去离子水至1L,pH7.0-7.2。
121℃,灭菌20min。
（3）发酵培养基（g/L）[4]：蔗糖45；黄豆粉25；KH2PO4 0.2；NaCl 1；NaSO4 0.1；FeSO40.01；CaCO3 3；加去离子水至1L，pH7.2。
121℃，灭菌 20min。
1.2 方法1.2.1采土样选取有机质丰富、通气性良好的、偏碱性的土壤，（pH 7.0-7.5）。
用小产挖取地表下5-25cm 的土壤5g。
1.2.2放线菌的筛选（1）土壤悬浊液梯度稀释：将5.0g土壤加入到50ml无菌水中，震荡10min制备土壤悬液；用无菌吸管吸取1ml土壤悬液，加入到9ml无菌水中作10倍稀释；按1:10稀释至10-3、10-4、10-5 [3]。
（2）倒平板：取6套无菌平皿，在皿底贴上标签，注明土壤稀释液的稀释度（10-3、10-4、10-5，每个稀释度做两个培养皿）。
然后在融化并冷却至50℃左右的高氏I号培养基加入10％的酚数滴，混合均匀；在每个培养皿中倒15-20ml左右，待冷凝备用[3]。
抑菌实验实训报告
一、实验目的1. 了解抑菌实验的基本原理和方法。
2. 掌握常用抑菌剂的抑菌效果。
3. 培养实验操作技能，提高对微生物学实验的实践能力。
二、实验原理抑菌实验是通过测定抑菌剂对微生物的生长抑制情况，来评价其抑菌效果的方法。
实验中，抑菌剂与微生物接触，通过干扰微生物的代谢过程或破坏其细胞结构，从而抑制其生长。
三、实验材料1. 菌株：金黄色葡萄球菌、大肠杆菌等。
2. 抑菌剂：苯酚、酒精、氯霉素等。
3. 培养基：牛肉膏蛋白胨培养基。
4. 实验仪器：无菌培养皿、无菌移液器、无菌接种环、酒精灯等。
四、实验方法1. 将金黄色葡萄球菌、大肠杆菌分别接种于牛肉膏蛋白胨培养基中，37℃培养24小时，制成菌悬液。
2. 取无菌培养皿若干，分别加入适量的牛肉膏蛋白胨培养基。
3. 在每个培养皿中央加入适量的抑菌剂，用无菌移液器均匀涂抹。
4. 将菌悬液用无菌接种环取适量，均匀涂布于每个培养皿的抑菌剂周围。
5. 将培养皿倒置，37℃培养24小时。
6. 观察并记录抑菌圈的大小。
五、实验结果1. 苯酚：金黄色葡萄球菌抑菌圈直径约为1.5cm，大肠杆菌抑菌圈直径约为2.0cm。
2. 酒精：金黄色葡萄球菌抑菌圈直径约为1.0cm，大肠杆菌抑菌圈直径约为1.5cm。
3. 氯霉素：金黄色葡萄球菌抑菌圈直径约为2.5cm，大肠杆菌抑菌圈直径约为3.0cm。
六、实验分析1. 苯酚对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌均有一定的抑制作用，但效果不如氯霉素。
2. 酒精对金黄色葡萄球菌的抑制作用较弱，而对大肠杆菌的抑制作用较好。
3. 氯霉素对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌均有较强的抑制作用。
七、实验讨论1. 抑菌实验是微生物学实验中的重要内容，通过实验可以了解不同抑菌剂的抑菌效果，为临床用药和食品加工等提供参考。
2. 实验过程中，无菌操作至关重要，否则会导致实验结果不准确。
3. 本实验结果表明，氯霉素是一种高效的抑菌剂，在临床用药和食品加工等领域具有广泛的应用前景。
八、实验总结本次抑菌实验实训，使我对抑菌实验的基本原理和方法有了更深入的了解，提高了我的实验操作技能。
如何使用牛津杯测定抗生素的抑菌圈
如何使用牛津杯测定抗生素的抑菌圈
目的：观察抗生素的抑菌效果，测定抗生素的抑菌圈大小，掌握牛津杯体外测定抗生素的抗菌性。
原理：抗生素从孔洞向琼脂培养基扩散渗透，通过对试验菌的抑杀作用而影响细菌生长繁殖，使菌落形成抑菌圈，依抑菌圈的大小确定抗生素抗菌能力的强弱。
材料
1.菌种：金黄色葡萄球菌，用营养肉汤培养16~18h得到的菌液。
2.药品：氨苄青霉素，肉汤培养基。
3.器材：牛津杯、涂布棒、生化培养箱、高压蒸汽灭菌锅、水浴锅、灭菌肉汤琼脂培养基、酒精灯、平皿、吸管、0.5cm纸片、镊子、记号笔、尺子等。
实验步骤
1.按照培养基的配制方法步骤配制好肉汤培养基，并在121℃，灭菌20min后，放在60℃水浴锅中保温，注意温度恒定，不要让培养基凝固。
2.将用于试验的防腐剂（抑菌物质）配制成2个所需的浓度（10ug/ml,30ug/ml）。
3.将已经培养好的菌制成一定浓度（106cfu/mL）的悬浮液，用移液管移取1mL该菌悬液至灭过菌的（121℃，20分钟）培养皿中，倒入15mL已灭菌的培养基（温度约45℃，用手摸瓶壁不感觉烫手即可），轻轻转动培养皿，使培养基与菌液混匀，静置凝成平板。
4.将凝固后的平板用灭菌后的打孔器在平板上打孔（4个孔洞），并挑出培养基。
（或将已灭菌的牛津杯依次轻轻放置在平板上）
5.按照顺时针方向依次在每个孔洞（或牛津杯）中加入抑菌剂，以无菌水做空白对照，每种抑菌剂的浓度做三个平行样。
6.在37℃下培养24h观察，用尺子测量抑菌圈的大小。
注意事项
1.应在无菌条件下操作，试验完毕后及时灭菌处理。
2.添加抑菌剂的时候注意滴到其他地方，以免影响观察。
抑菌试验预习方案
抑菌试验1 定义抑菌试验，用于测定抗菌药物体外抑制细菌生长效力的试验称为抑菌试验抑菌活性的研究实验方案。
实验方法1. 纸片法（抑菌圈法）将测定菌株接种到培养基中，置37度条件下培养6-24小时，取出备用。
再用无菌吸管吸取上述培养液0.1ml，再用三角刮刀将菌液涂匀。
待培养基表面稍干后，用无菌小镊子分别取出所需的药敏纸片均匀地贴在培养基的表面，轻轻压平，各纸片间应有一定距离，并分别做上标记。
将培养皿置37度恒温箱内培养18-24小时后，测量各种药敏纸片抑菌圈直径的大小。
2. 挖孔法（1）在平板上打孔，然后将药液滴入孔内，用经酒精灯灭菌的接种环挑取适量细菌培养物，以划线方式将细菌涂布到平皿培养基上。
具体方式：用灭菌接种环取适量细菌分别在平皿边缘相对四点涂菌，以每点开始划线涂菌至平皿的1/2，依次划线，自至细菌均匀密布于平皿（将测定菌株接种到培养皿中，置37度条件下培养18-24小时，用灭菌的棉拭子将带将细菌混悬液涂布于平皿培养基表面。
要求涂布均匀）。
（2）以无菌操作将灭菌的不锈钢小管，（外径4mm，孔径与孔距均为3mm，管的两端要光滑，也可用玻璃管和瓷管），放置在培养基上打孔，将孔中的培养基用针头挑出，并以火焰封底，使培养基能充分的与平皿融合（3）加样时，按不同药液加样，用无菌滴管将样品加至满而不溢为止。
3. 牛津杯法（1）双碟的制备方法：将灭菌培养基溶化后取15ml倒入灭菌平皿内。
吸取待测菌株的菌液1-5ml与100ml冷至45度的培养基混匀，然后分别每一平皿加入5ml。
并均匀摊布在具有底层培养基的平皿内。
（2）待培养基凝固后，在每碟中均匀立放小钢管（及牛津杯）4个，用陶瓦盖覆盖。
（3）将下列实验药液分别加入小钢管中，置37度培养18-24小时，量取抑菌圈大小，判定抗菌药物抑菌作用的强弱。
乳酸菌的抑菌实验1产抑菌活性物质乳酸菌的初筛采用纸片法。
将培养好的大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、蜡样芽孢杆菌培养液 OD 600分别调整到 0.17、0.19、0.10，各取 100μL 接种于 LB 固体培养基，涂布均匀，固定1h。
抑菌试验PPT课件
5. 摆放牛津杯：在培养基表面垂直摆放牛津 杯，轻轻加压，使其与培养基接触无空隙。
6.加入待检药液：在杯中加入不同稀释度的 药液或待检样品。
7. 孵育：加满后在37 ℃培养16~18 h。
8. 结果报告：用毫米尺量取抑菌圈直径，参 考表的标准判读结果，按敏感（S）、中介 （I）、耐药（R）报
牛津杯
“牛津杯”是放被测抗生素的不锈钢小管， 小管内径为6mm，外径为8mm，高 10mm的圆筒形管子，管子的重量尽可能 相等。
三、实验操作
1. 倒平板：将已灭菌的琼脂培养基加热到完 全融化，倒在培养皿内，每皿约20ml，凝 固。
2. 标记：菌种、牛津杯摆放位置、药物及其 浓度
3. 制备菌悬液：用生理盐水洗下试管内的菌 苔并稀释。
注意事项
在超净工作台中或酒精灯旁操作 平板倒好，一定要平 牛津杯立直，才能保证杯内抑菌物质均匀
的向四周扩散 牛津杯均匀摆放于培养基上，位置安排适
中，防止出现抑制圈重叠，可在平皿中央 摆一个，外周等距离摆5－6个。
思考题
青霉素、头孢菌素类药物的抗菌机制如何？
药敏试验
抗菌药物敏感性试验，简称药敏试验，是 指对敏感性不能预测的分离菌株进行试验， 测试抗菌药在体外对病原微生物有无抑制 作用，以指导选择治疗药物和了解区域内 常见病原菌耐药性变迁，有助于经验性治 疗选药
二、实验材料
培养基： 牛肉膏蛋白胨固体培养基 菌种：
大肠杆菌（E.coli) 金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus) 枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis)
药品：阿莫西林、黄芪多糖、 其他：牛津杯、培养皿、酒精棉、酒精灯、涂布器、
抑菌圈实验步骤样品洗涤
抑菌圈实验步骤样品洗涤一、所用器皿及稀释液：1、检验中所用玻璃器皿，如培养皿，吸管、试管等必须是完全灭菌的，并在灭菌前彻底洗涤干净，不得残留有抑菌物质。
2、用作样品稀释的液体，每批都要有空白对照。
如果在琼脂对照平板上出现几个菌落时，要追加对照平板，以判定是空白稀释液，用于倾注平皿的培养基，还是平皿吸管或空气可能存在的污染。
3、检样的稀释液虽可用生理盐水或磷酸盐缓冲液，但以用磷酸缓冲盐水为合适，因为磷酸盐缓冲液对细菌细胞有更好的保护作用，不会因为在稀释过程中而使食品检样中原已受损伤的细菌细胞导致死亡。
如果对含盐量较高的食品(如，酱品等)进行稀释，则宜采用蒸馏水。
二、检样稀释：1、检样稀释时，应以无菌操作称取(或量取)有代表性的样品25g(或mL)剪碎放于含有225ml灭菌稀释液的玻璃瓶内(瓶内预置适当数量的玻璃珠)，经充分振摇作成l：10的稀释液。
如，系肉、鱼等固体样品，最好剪细于灭菌乳钵内与稀释液研匀，或与稀释液同置于灭菌均质器杯或拍击式均质袋中，使做成均匀的1：10稀释液。
2、根据食品卫生标准要求或对标本污染情况的估计，将上述1:10的检样稀释液再做成几个适当的10倍递增稀释液。
即取1：10稀释液1mL与9mL稀释液混和做成l：100的稀释液，然后依次递增稀释，做成1：1000、1：10000等稀释液。
注意每递增稀释一次，必须另换1支l mL灭菌吸管，这样所得检样的稀释倍数方为准确。
3、从吸管筒内取出灭菌吸管时，不要将吸管尖端碰着其他仍留在容器内的吸管的外露部分；而且吸管在进出装有稀释液的玻璃瓶和试管时，也不要触及瓶口及试管口的外侧部分；因为这些部分都可能接触过手或其他沾污物。
4、在作10倍递增稀释中，吸管插入检样稀释液内不能低于液面2、5cm；吸入液体时，应先高于吸管刻度，然后提起吸管尖端离开液面，将尖端贴于玻璃瓶或试管的内壁时吸。
管内液体调至所要求的刻度，这样取样较准确，而且在吸管从稀释液内取出时不会有多余的液体粘附于管外。
生物制药工艺实验,抑菌圈的大小
生物制药工艺实验,抑菌圈的大小
抑菌圈和抑菌物质浓度的对数是成正比的，也就是抑菌物质浓度越高，抑菌圈越大。
抑菌物质浓度一直稀释下去，则抑菌圈直径逐渐变小，直到没有抑菌圈出现，这个临界浓度就是MIC。
如果你的实验没有出现抑菌圈，说明抑菌物质浓度不高。
说明你做的抑菌物质浓度在临界浓度范围内，如果你做的是梯度抑制实验，则说明你的结果有意义，如果是固定浓度，那么久很难说明原因了。
抑菌圈法是衡量杀菌防霉剂效果的一种方式丰要用于测定杀菌
防霉剂对细菌、霉菌、酵母菌的抑菌作用，是定性或半定量的方法。
通过杀菌防霉剂在琼脂平板上的扩散能力来初步筛选更有效的杀菌
防霉剂品种。
实验十二 抑菌实验
2.细菌接种 2.细菌接种
0.1ml含菌量相当于麦氏比浊管第 含菌量相当于麦氏比浊管第1 1/2的 每管加入 0.1ml含菌量相当于麦氏比浊管第1管1/2的 金黄色葡萄球菌(相当于1.5亿/ml)，操作术式如下表。 金黄色葡萄球菌(相当于1.5亿/ml)，操作术式如下表。 1.5
思考题
1.圆纸片药敏试验操作时应注意什么事项？ 1.圆纸片药敏试验操作时应注意什么事项？ 圆纸片药敏试验操作时应注意什么事项 2.试述药敏试验的意义 试述药敏试验的意义。 2.试述药敏试验的意义。
操作程序 （以葡萄球菌对青霉素的敏感性为例） 以葡萄球菌对青霉素的敏感性为例） 1.青霉素稀释 1.青霉素稀释
将装有1ml肉汤的试管排成一列，编上1 将装有1ml肉汤的试管排成一列，编上1～9的管号， 1ml肉汤的试管排成一列 的管号， 在第1管内加入含64IU/ml 青霉素肉汤1ml 1ml， 在第1管内加入含64IU/ml 青霉素肉汤1ml，混匀后吸取 1ml到第 到第2 混匀，再取1ml至第3 1ml至第 依次类推到第8 1ml到第2管，混匀，再取1ml至第3管，依次类推到第8管。 管不含青霉素的肉汤作对照管。 第9管不含青霉素的肉汤作对照管。
实表1 实表1 细菌对不同抗菌药物敏感度标准
药物名称 抑菌圈直径（mm）
无抑菌圈 ＜10 11～26 ＞26 无抑菌圈 ＜10 11～15 ＞15 无抑菌圈 ＜10 11～25 ＞25
敏感度
不敏感 低度敏感 中度敏感 高度敏感 不敏感 低度敏感 中度敏感 高度敏感 不敏感 低度敏感 中度敏感 高度敏感
青霉素（50μg/ml）
链霉素（500μg/ml）
新霉素（300μg/ml）
（二）最低抑菌浓度试验
原理：将抗菌药物作倍比稀释， 原理：将抗菌药物作倍比稀释，在不同浓度的稀释 管内接种被检细菌，定量测定抗菌药物的最 管内接种被检细菌， 低浓度。 低浓度。本结论可作为其他药物敏感性试 验的标准方法。 验的标准方法。 实验材料： 实验材料： • • • • • 金黄色葡萄球菌肉汤培养物 普通肉汤 含青霉素64IU/ml 含青霉素64IU/ml 的普通肉汤各一管 麦氏比浊管 灭菌1ml 1ml刻度吸管 灭菌1ml刻度吸管
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抑菌圈实验
抑菌圈法是衡量杀菌防霉剂效果的一种方式，主要用于测定杀菌防霉剂对细菌、霉菌、酵母菌的抑菌作用，是定性或半定量的方法。
通过杀菌防霉剂在琼脂平板上的扩散能力来初步筛选更有效的杀菌防霉剂品种。
用具和材料
霉菌培养皿，无菌吸管（或针筒），圆片滤纸（直径2cm），带玻璃珠的无菌水，带过滤漏斗的三角牌，镊子，接种针（环），熔化状态的琼脂培养基（最好保温于45℃左右水浴中），一定浓度的药剂，供试验用的菌种。
试验过程
用接种环挑取各试管斜面的菌种于带玻璃珠的无菌水中，用手振荡数分钟使孢子分散，过滤后制成混合孢子悬液。
用无菌吸管（或针筒）向各培养皿中注入一定浓度的混合孢子悬浮液0.5mL。
向各培养皿内注入15Ml~20ml的熔化状琼脂培养基（约45℃），将菌液与培养基混合均匀，待其冷却。
用镊子将圆片滤纸在不同浓度的防霉剂中浸渍片刻，取出置于带菌培养基平板的中央，盖上盖子
置适宜温度下，培养2~3d，观察滤纸片圆片周围抑菌圈的有无及大小。
注意事项
所有的操作用具和材料都要事先做灭菌处理，操作必须在无菌室（或无菌箱）内于火焰旁进行。
霉菌、细菌、酵母菌等各种微生物都必须分别配置混合菌液，即这里指的混合菌液是霉菌或酵母菌等诸种菌的分别混合液，并非霉菌、细菌和酵母菌的混合液。
混合菌液的浓度一般为106~108cfu/mL.
倒入培养皿的琼脂培养基温度不能太高（一般为45℃左右），否则会引起微生物死亡。
也不能太低，因为琼脂会很快凝结，以致搅拌不均匀，影响试验结果。
各种微生物的最适生长温度不同（例如霉菌一般为25~30℃，细菌一般为32~37℃等），恒温培养时宜分开放置。
结果评判
由于滤纸圆片所吸附的药液慢慢向四周扩散，因此在滤纸片的周围就出现清晰的抑菌圈（加入该防霉剂对供试菌有抑制效果）。
抑菌圈的大小代表药剂抗菌力的高低。
在一定的药剂浓度范围内，药剂的浓度越高则抑菌圈的直径越大。
此法同样适合于测定单个菌的抗菌效果。