三氟乙酸在HPLC中的应用
HPLC-ELSD法测定新霉素的有关物质
HPLC-ELSD法测定新霉素的有关物质摘要】目的建立HPLC-ELSD法测定新霉素的有关物质的方法。
方法流动相：0.2mol?L-1三氟乙酸溶液-甲醇（98：2）；色谱柱：ODS－HYPERSIL（5μ）125mm×4.6mm，Kromasil-100-5C18：150mm×4.6mm；流速：0.4ml?min-1；雾化管温度：30 ℃；漂移管温度：70 ℃；压力：0.4MPa；进样量：20μL。
结论新霉胺在0.02～0.1mg?mL-1范围内线性良好，线性方程为：y= 1.513x+7.629，r=0.9996 (n = 6)。
HPLC-ELSD法法能够快速、准确测定新霉素的有关物质。
【关键词】新霉素 HPLC-ELSD 有关物质1 溶液的配制供试品溶液的制备精密称取硫酸新霉素样品50.17mg，加水溶解并稀释至50ml，作为供试品溶液。
对照溶液浓度的制备精密称取新霉胺对照品适量，加水溶解依次稀释至浓度为0.04 mg?mL-1，0.05 mg?mL-1，0.06 mg?mL-1，0.07 mg?mL-1，0.08 mg?mL-1的系列对照溶液。
系统适用性溶液的制备分别精密称取新霉胺、巴龙霉素、新霉素B和新霉素C对照品，加水制成约各含0.3mg?mL-1的溶液，摇匀，作为系统适用性试验用溶液。
2 系统适用性试验精密量取系统适用性溶液20μL，在上述色谱条件下分析，各杂质峰的分离度不小于1.5，理论塔板数均大于3000，对称因子均小于1.5。
见图1，2。
3 有关物质测定精密量取标准溶液与供试品溶液各20 μL注入液相色谱仪，按上述方法测定并绘制标准曲线，计算新霉胺的含量为0.1%。
见图3。
4 线性范围的考察精密称取新霉胺对照品适量，分别加水制成含新霉胺0.0201、0.0301、0.0401、0.0502、0.0702、0.1003 mg?mL-1的溶液，精密量取20 μL注入液相色谱仪，以上述测定方法绘制随行标准曲线，得线性方程为：y= 1.513x+7.629，r=0.9996 (n = 6) 。
高压液相色谱HPLC常见故障及排除方法[重点]
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高压液相色谱HPLC常见故障及排除方法诊状(一)保留时间变化可能的原因: 解决方法1.柱温变化:柱恒温2.等度与梯度间未能充分平衡:至少用10倍柱体积的流动相平衡柱3.缓冲液容量不够:用>25mmol/L的缓冲液4.柱污染:每天冲洗柱5.柱内条件变化:稳定进样条件,调节流动相6.柱快达到寿命:采用保护柱(二)保留时间缩短可能的原因: 解决方法1.流速增加:检查泵,重新设定流速2.样品超载:降低样品量3.键合相流失:流动相PH值保持在3~7.5检查柱的方向4.流动相组成变化:防止流动相蒸发或沉淀5.温度增加:柱恒温(三)保留时间延长可能的原因: 解决方法1.流速下降:管路泄漏,更换泵密封圈,排除泵内气泡2.硅胶柱上活性点变化:用流动相改性剂,如加三乙胺,或采用碱至钝化柱3.键合相流失:同前(二)34.流动相组成变化:同前(二)45.温度降低:同前(二)5(四)出现肩峰或分叉可能的原因: 解决方法1.样品体积过大:用流动相配样,总的样品体积小于第一峰的15%2.样品溶剂过强:采用较弱的样品溶剂3.柱塌陷或形成短路通道:更换色谱柱,采用较弱腐蚀性条件4.柱内烧结不锈钢失效:更换烧结不锈钢,加在线过滤器,过滤样品5.进样器损坏:更换进样器转子(五)鬼峰可能的原因: 解决方法1.进样阀残余峰:每次用后用强溶剂清洗阀,改进阀和样品的清洗2.样品中未知物:处理样品3.柱未平衡:重新平衡柱,用流动相作样品溶剂(尤其是离子对色谱)4.三氟乙酸(TFA)氧化(肽谱) : 每天新配,用抗氧化剂5.水污染(反相) : 通过变化平衡时间检查水质量，用HPLC级的水(六)基线噪声可能的原因: 解决方法1.气泡(尖锐峰) : 流动相脱气,加柱后背压2.污染(随机噪声) : 清洗柱,净化样品,用HPLC级试剂3.检测器灯连续噪声:更换氘灯4.电干扰(偶然噪声) : 采用稳压电源,检查干扰的来源(如水浴等)5.检测器中有气泡:流动相脱气,加柱后背压(七)峰拖尾可能的原因: 解决方法1.柱超载:降低样品量,增加柱直径采用较高容量的固定相2.峰干扰:清洁样品,调整流动相3.硅羟基作用加三乙胺,用碱致钝化柱增加缓冲液或盐的浓度降低流动相PH值,钝化样品4.同前(四)4 : 同前(四)45.同前(四)3 5. : 同前(四)36.死体积或柱外体积过大:连接点降至最低,对所有连接点作合适调整,尽可能采用细内径的连接管7.柱效下降:用较低腐蚀条件,更换柱,采用保护柱(八)峰展宽可能的原因: 解决方法1.进样体积过大:同(四)12.在进样阀中造成峰扩展:进样前后排出气泡以降低扩散3.数据系统采样速率太慢:设定速率应是每峰大于10点4.检测器时间常数过大:设定时间常数为感兴趣第一峰半宽的10%5.流动相粘度过高:增加柱温,采用低粘度流动相6.检测池体积过大:用小体积池,卸下热交换器7.保留时间过长:等度洗脱时增加溶剂含量也可用梯度洗脱8.柱外体积过大:将连接管径和连接管长度降至最小9.样品过载:进小浓度小体积样品液相色谱柱使用及保养液相色谱仪由高压液体泵、检测器及液相色谱柱等三部分组成，其中液相色谱柱的正确安装和使用，是液相色谱工作的关键；也是液相色谱工作者获得正确可靠的实验数据的必经之路。
HPLC法测定豆浆中的嘌呤含量
HPLC法测定豆浆中的嘌呤含量毛玉涛;张洪;王明力【摘要】利用HPLC法对豆浆中的嘌呤物质进行检测分析,建立腺嘌呤、鸟嘌呤、黄嘌呤和次黄嘌呤4种嘌呤物质的多组分检测条件并进行方法评价.研究表明:利用Zorbax C18反相色谱柱(4.6 mm×250 mm,5.0 μm),流动相以KH2 PO4缓冲液(0.02 mol/L,pH 3.0),在流速1.0 mL/min,柱温25℃,进样量10 pL,检测波长(λ1)为254 nm的条件下,豆浆中的4种嘌呤达到最好分离,其精密度和回收率小于2％.%A feasible method using HPLC which was evaluated for analyzing Adenine,Guanine,Xanthine,Hypoxanthine from soybean milk was established in this paper.The chromatographic conditions were optimized as follows:Zorbax C18 column (4.6 mm ×250 mm,i.d.5.0 μm),254 nm by UV detector with 0.02 mol/L of KH2PO4 buffer solution (pH =3.0) as mobile phase,the flow rate was 1.0 mL/min,the column temperature was 25 ℃,and the sample size was 10 μL.The result showed that several purines can be separated effectively in these conditions with the precision and recovery under 2％.【期刊名称】《食品与发酵工业》【年(卷),期】2015(041)002【总页数】5页(P207-211)【关键词】豆浆;嘌呤;HPLC【作者】毛玉涛;张洪;王明力【作者单位】贵阳市粮油质量检测中心,贵州贵阳,550002;贵州省分析测试研究院,贵州贵阳,550002;贵州大学酿酒与食品工程学院,贵州贵阳,550025【正文语种】中文由RNA、DNA在生命科学研究中的重要地位，可预见到核苷、核碱、核酸及嘌呤物质的分析研究，是生命科学的一个重要领域，解决嘌呤物质的分析问题，在物质检测发展中一直处于核心地位［1］。
高效液相色谱法在合成多肽分离与纯化中的应用
HPLC在合成多肽分离与纯化中的应用杜雾晨摘要：固相肽合成（SPPS）技术是目前制备各种模式多肽和天然多肽类似物的最有效方法，但是最终产物的成分往往比较复杂，不经纯化难以用于蛋白质多肽的结构、功能和药理学研究。
近年来已出现了多种多肽及蛋白质的分离纯化技术，高效液相色谱法（HPLC）是目前分析纯化合成多肽的主要手段。
本文根据固相肽合成方法的原理及产物特点，对高效液相色谱法在分析纯化合成肽中的应用作了较为系统的评述。
关键词：固相肽合成；纯化；高效液相色谱法多肽是分子结构介于氨基酸和蛋白质之间的一类化合物,由一种或多种氨基酸按照一定的排列顺序通过肽键结合而成。
多肽是构成蛋白质的结构片段,也是蛋白质发挥作用的活性基团,是人体进行代谢、调控活动的重要物质。
蛋白质主要以多肽形式吸收,透过多肽既可深入研究蛋白质的性质,又为改变和合成新的蛋白质提供了基础材料。
研究多肽结构与功能的关系,有助于了解多肽中各氨基酸系列的功效,以便应用中设计尽可能短的多肽同时提高其生理活性,减少临床的不良反应。
多肽类药物在临床上显示了巨大的应用价值,受到药物化学家越来越多的重视,多肽药物的研究和开发成为国际新药技术领域竞争中的重要方面。
化学合成的肽产品是一个纯度不好的粗产品,其一是因为在合成肽过程中各种副反应、消旋化等造成的副反应肽,二是在脱保护过程中,由于保护基的残留,肽键的断裂、烷基化等造成的杂质。
杂质的分子结构与合成肽很相似,或许二者之间仅仅在某一个位置的氨基酸残基不同,或许二者之间的差异仅仅在某一氨基酸残基侧链上某一基团是否存在等等。
由于杂质与合成的肽在分子结构和化学性质上如此相似,就给肽的分离纯化带来了困难[1]。
因此,根据对目的肽的要求,需要选择适当的方法进行纯化。
高效液相色谱(HPLC)是生物技术中分离纯化的重要方法,在多肽、蛋白质的分离纯化工艺中显示出优异的性能。
而且,它已走出实验室投入到大规模的工业化生产中,成为生物技术X围内一有力高效的分离工具[2]。
HPLC测定蛋白质含量方法验证
结论：lowry法与HPLC法所测得的浓度存在一定的差异！
a
6
色谱图比较
25.757
25.688
工作标准品色谱图例
供试品色谱图例
a
7
重复性实验（出峰时间）
批序号
类别 规格（ug/ml） 平均峰出峰时间 RSD值(%)
/
标准品
75
25.546
0.057
/
标准品
150
25.537
0.038
/
标准品
300
实验结论：RSD值﹤2%，符合2015年版《中国药典》要求
a
10
精密度实验（峰面积）
批序号 类别
/ / / 原液批2 成品批4 成品批5 成品批6
标准品 标准品 标准品 供试品 供试品 供试品 供试品
规格 （ug/ml)
75 150 300 300 300 150 75
平均峰面积
RSD值（%）
分析员A 分析员B 分析员A 分析员B
a
4
方法比较（ lowry与HPLC）
Folin-酚（lowry）
要求人为精确控制操作时间 操作复杂，干扰因素较多
重复性、精密度较差 只适用于检测原液的蛋白质含量
HPLC
设备控制时间，减少人为误差 操作简便，干扰因素较少 重复性、精密度较好
适用于原液及成品的蛋白质含量
/
2015年版《中国药典》首次规定的 检测方法
a
5
方法比较（lowry与HPLC）
批序号
原液批1 原液批2 原液批3 原液批4 原液批5 原液批6 原液批7 原液批8
lowry法（ug/ml)
1477 1393 1432 1466 1389 1456 1395 1428
HPLC-CAD法测定硫酸新霉素中新霉素B、新霉素C、新霉胺及其他有关物质
HPLC-CAD法测定硫酸新霉素中新霉素B、新霉素C、新霉胺及其他有关物质刘庄蔚;朱健萍;梁秋霞;蒋洁;杨欣智【摘要】目的建立测定硫酸新霉素中新霉素B、新霉素C、新霉胺及其他有关物质的高效液相色谱-电喷雾检测器(HPLC-CAD)方法.方法采用Waters HSS T3色谱柱(4.6mm×250mm,5μm),以0.15mol/L三氟乙酸水溶液为流动相,流速1.0mL/min,柱温30℃,电喷雾检测器的雾化温度为45℃.结果新建方法对新霉素B、新霉素C、其他有关物质分离度良好,精密度、重复性和回收率均满足分析要求.新霉素B、新霉胺浓度与峰面积线性关系良好(r＞0.995),检出限可达到0.02μg和0.003μg.结论新建方法分离度好、灵敏度高,可以检出更多的杂质,可以满足硫酸新霉素原料有关物质分析的要求.【期刊名称】《中国抗生素杂志》【年(卷),期】2019(044)003【总页数】6页(P370-375)【关键词】电喷雾检测器;硫酸新霉素;有关物质;高效液相色谱法【作者】刘庄蔚;朱健萍;梁秋霞;蒋洁;杨欣智【作者单位】广西壮族自治区食品药品检验所,南宁530021;广西壮族自治区食品药品检验所,南宁530021;广西壮族自治区食品药品检验所,南宁530021;广西壮族自治区食品药品检验所,南宁530021;广西壮族自治区食品药品检验所,南宁530021【正文语种】中文【中图分类】R978.1;R917硫酸新霉素(neomycin sulfate)是首个被发现的氨基糖苷类抗生素，它是1949年Waksman等[1]从新霉素链霉菌代谢产物中分离得到的混合物。
其抗菌谱较广，对革兰阳性菌、革兰阴性菌、结核杆菌等均有抑制作用[2]，由于新霉素有显著的肾毒性和耳毒性，故常被制备成乳膏剂、软膏剂和滴眼液等外用制剂供患者使用。
据文献报道，硫酸新霉素的主要成分为新霉素A、B、C 3种，新霉素A(新霉胺)仅微量，是新霉素B、C的降解产物之一[1]。
罗汉果甜苷的HPLC法分析
罗汉果甜苷的HPLC法分析
马少妹
【期刊名称】《福建分析测试》
【年(卷),期】2006(015)004
【摘要】目的:为建立全面评价罗汉果的质量的方法.方法:采用超声强化水提取法进行样品前处理,用罗汉果苷Ⅴ作为参照物进行指标成分峰的定位,用HPLC对罗汉果水提取物进行分离,比较了水-甲醇、冰醋酸水溶液-甲醇、磷酸水溶液-甲酸、水-乙睛、磷酸水溶液-乙腈、三氟乙酸水溶液-乙腈6种体系的等度、梯度洗脱效果.结果:实验表明在上述6种流动相体系中,以三氟乙酸水溶液-乙腈的洗脱效果最好,色谱条件:梯度洗脱、Sinochrom ODS-BP柱、检测波长为205nm,流速
0.8ml/min,柱温25℃.结论:采用HPLC技术,可以得到分离度和重现性均较好的罗汉果水提取物的HPLC色谱图.
【总页数】4页(P3-6)
【作者】马少妹
【作者单位】广西民族大学化学与生态工程学院,南宁,530006
【正文语种】中文
【中图分类】O657.72
【相关文献】
1.HPLC-MS法测定罗汉果中6种罗汉果甜苷含量 [J], 牟俊飞;王韶旭;罗琴;王鹏程;黄四新;苏小建;陈旭;梁成钦;周先丽
2.超高压提取罗汉果中罗汉果甜苷V的工艺优化 [J], 王迪
3.HPLC法测定罗汉果中罗汉果苷ⅡE、苷Ⅲ的含量 [J], 李典鹏;黄永林;刘金磊;潘争红
4.利用RP-HPLC法研究罗汉果采后贮藏期甜苷V的含量变化趋势 [J], 梁成钦;周先丽;刘林文;苏小建;徐庆
5.HPLC法测定罗汉果中罗汉果苷V和11-氧化罗汉果苷V [J], 周兢;王梦月;李晓波;屠鹏飞;王强
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HPLC注意事项
HPLC使用注意事项1.流动相必须用HPLC级的试剂，使用前过滤除去其中的颗粒性杂质和其他物质(使用0.45um或更细的膜过滤)。
2.流动相过滤后要用超声波脱气，脱气后应该恢复到室温后使用。
3.不能用纯乙腈作为流动相，这样会使单向阀粘住而导致泵不进液。
4.使用缓冲溶液时，做完样品后应立即用去离子水冲洗管路及柱子一小时，然后用甲醇(或甲醇水溶液)冲洗40分钟以上，以充分洗去离子。
对于柱塞杆外部，做完样品后也必须用去离子水冲洗20ml以上。
5.长时间不用仪器，应该将柱子取下用堵头封好保存，注意不能用纯水保存柱子，而应该用有机相(如甲醇等)，因为纯水易长霉。
6.每次做完样品后应该用溶解样品的溶剂清洗进样器。
7.C18柱绝对不能进蛋白样品，血样、生物样品。
8.堵塞导致压力太大，按预柱→混合器中的过滤器→管路过滤器→单向阀检查并清洗。
清洗方法；①以异丙醇作溶剂冲洗：②放在异丙醇中间用超声波清洗；⑧用10％稀硝酸清洗。
9.气泡会致使压力不稳，重现性差，所以在使用过程中要尽量避免产生气泡。
10.如果进液管内不进液体时，要使用注射器吸液：通常在输液前要进行流动相的清洗。
11.要注意柱子的PH值范围，不得注射强酸强碱的样品，特别是碱性样品。
12.更换流动相时应该先将吸滤头部分放入烧杯中边振动边靖洗，然后插入新的流动相中。
更换无互溶性的流动相时要用异丙醇过渡一下。
高效液相色谱常见故障的断定及解决诊状可能的原因解决方法(一)保留时间变化1.柱温变化柱恒温，必要时需配置恒温箱2.等度与梯度间未能充分平衡至少用10倍柱体积的流动相平衡柱3.缓冲液容量不够用》25mmol/L的缓冲液4.柱污染每天冲洗柱5.柱内条件变化稳定进样条件,调节流动相6.柱快达到寿命采用保护柱(二)保留时间缩短1.流速增加检查泵,重新设定流速2.样品超载降低样品量3.键合相流失流动相PH值保持在3"7.5检查柱的方向4.流动相组成变化防止流动相蒸发或沉淀5.温度增加柱恒温(三)保留时间延长1.流速下降管路泄漏,更换泵密封圈,排除泵内气泡2.硅胶柱上活性点变化用流动相改性剂,如加三乙胺,或采用碱至钝化3.键合相流失同前(二)34.流动相组成变化同前(二)45.温度降低同前(二)5(四) 出现肩峰或分*1.样品体积过大用流动相配样,总的样品体积小于第一峰的15%2.样品溶剂过强采用较弱的样品溶剂3.柱塌陷或形成短路通道更换色谱柱,采用较弱腐蚀性条件4.柱内烧结不锈钢失效更换烧结不锈钢,加在线过滤器,过滤样品5.进样器损坏更换进样器转子(五)鬼峰1.进样阀残余峰每次用后用强溶剂清洗阀,改进阀和样品的清洗2.样品中未知物处理样品3.柱未平衡重新平衡柱,用流动相作样品溶剂(尤其是离子对色谱)4.三氟乙酸(TFA)氧化(肽谱) 每天新配,用抗氧化剂5.水污染(反相) 通过变化平衡时间检查水质量，用HPLC级的水(六) 基线噪声1.气泡(尖锐峰) 流动相脱气,加柱后背压2.污染(随机噪声) 清洗柱,净化样品,用HPLC级试剂3.检测器灯连续噪声更换氘灯4.电干扰(偶然噪声) 采用稳压电源,检查干扰的来源(如水浴等)5.检测器中有气泡流动相脱气,加柱后背压(七)峰拖尾1.柱超载降低样品量,增加柱直径采用较高容量的固定相2.峰干扰清洁样品,调整流动相3.硅羟基作用加三乙胺,用碱致钝化柱增加缓冲液或盐的浓度降低流动相PH值,钝化样品4.同前(四)4 同前(四)45.同前(四)3 5.同前(四)36.死体积或柱外体积过大连接点降至最低,对所有连接点作合适调整,尽可能采用细内径的连接管7.柱效下降用较低腐蚀条件,更换柱,采用保护柱(八)峰展宽1.进样体积过大同(四)12.在进样阀中造成峰扩展进样前后排出气泡以降低扩散3.数据系统采样速率太慢设定速率应是每峰大于10点4.检测器时间常数过大设定时间常数为感兴趣第一峰半宽的10%5.流动相粘度过高增加柱温,采用低粘度流动相6.检测池体积过大用小体积池,卸下热交换器7.保留时间过长等度洗脱时增加溶剂含量也可用梯度洗脱8.柱外体积过大将连接管径和连接管长度降至最小9.样品过载进小浓度小体积样品。
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降低三氟乙酸用量，改善质谱分析
在反相色谱分离多肽和蛋白质的实验中，使用三氟乙酸 (TFA) 作为离子对试剂是常见的手段。
流动相中的三氟乙酸通过与疏水
键合相和残留的极性表面以多种模式相互作用，来改善峰形、克
服峰展宽和拖尾问题。
三氟乙酸与多肽上的正电荷及极性基团相
结合以减少极性保留，并把多肽带回到疏水的反相表面。
以同样
的方式，三氟乙酸屏蔽了固定相上残留的极性表面。
三氟乙酸的
行为可以理解为它滞留在反相固定相的表面，同时与多肽及柱床
作用，这已在 Vydac Advances for Spring, 1997 中得到了报导。
三氟乙酸优于其他离子修饰剂的原因是它容易挥发，可以方
便地从制备样品中除去。
另一方面，三氟乙酸的紫外最大吸收峰
低于 200nm ，对多肽在低波长处的检测干扰很小。
改变三氟乙酸的浓度，可以细微地调整多肽在反相色谱上的
选择性。
这一影响对于优化分离条件、增大复杂色谱分析（如多
肽的指纹图谱）的信息量是非常有益的。
三氟乙酸添加在流动相中的浓度一般为 0.1% ，在这个浓度下，大部分的反相色谱柱都可以产生良好的峰形，当三氟乙酸浓
度大大低于这个水平时，峰的展宽和拖尾就变得十分明显。
LC/MS 液质联用
在过去的十年中，反相色谱与电喷雾质谱联用已成为多肽和
蛋白质的分子量测定和结构分析的重要工具。
然而，含有三氟乙
酸的流动相对离子的产生具有抑制作用，一定程度上降低了液质联用技术的灵敏性和分析可靠性。
这种抑制作用可以通过柱后加成技术部分地克服，但将使色谱系统极大地复杂化。
将流动相中三氟乙酸的浓度降低 10 倍可以消除这种抑制作用，但同时也会造成色谱分析质量的降低。
Vydac 公司开发了三种液质联用专用反相色谱柱，在使用较低浓度的三氟乙酸时，仍可以得到对称性好、柱效高的多肽和蛋白质色谱峰。
这些柱子基于 Vydac 公司品质卓越的高纯硅胶（ 300A）及 C18 和 C4 键合相，并通过专利的硅胶处理技术大大减轻了对 TFA 的依赖。
二种可选的 C18 反相填料 -- 多元键合型和单体键合型，具有细微的选择性差异。
在复杂样品，如蛋白质消化物的分离时，这种差异有助于优化分离效果或提供二套特征峰的位置。
对于某些样品，特别是蛋白质消化物在 Vydac 液质联用专用反相色谱柱上的分离，在流动相中仅添加乙酸而不使用三氟乙酸就能够获得出色的分离效果。
关于在单体键合 C18 液质联用色谱柱上的分离及以乙酸作为流动相改性剂来分离蛋白质和多肽的更多信息，请参阅 Vydac 公司的 2000/2001 年度的产品目录的相关内容。