扩大HBV-DNA PCR-ELISA定量方法的测量范围

・颢技了虻・ＢｕｌｌＭｅｄＲｅ＊，Ｊ∞２００４．Ｖ０１．３３

Ｎｏ．１

动冲洗、自动打印报告等全部过程。仪器还具有自检功能，当出现故障时可自动报警并提示处理方法。⑤速度快捷：除标本前处理及离心时问外，自动吸样时间５Ｓｅｃ，自动冲洗时间８Ｓｅｅ便可完成。⑥安全环保：标本在ＰａｒａＳｅｐ粪便离心器中加甲醛盐水起到同定、消毒、除奥，加乙酝乙砖乳化脂肪，破环粪便结构。防止爆炸危险的作用。标本经无害化处理后在分析全过程都在封舟了管道系统中进行，完全达到安全环保目的。⑦减轻劳动强度：标本处理过程中的振摇、加样、冲洗等步骤由仪器代劳，粪沉渣有形物质通过内置数码位相差显微镜在显示屏观察判平面结构和立体结构图像，结果及报告用键盘操作、减轻工作人员劳动强度和视力疲劳。⑧适用于医、教、研：仪器设计较完善的软件功能，除满足临床粪检诊断和鉴别诊断需要外，还可以采集和贮存有价值的寄生虫卵、原虫、细胞、结晶、食物残渣图谱，供教学、科研用。我们认为：Ｄ／ａＳｙＢＦＥ一２粪便分析工作站在沿用粪检方法基础锐意创新，提供一种新方法，有良好社会效益和经济效益，值得重视和推广使用。参考文献１叶应妩．王挂三主编，全国临床检验操作规程．第二版南京：东南大学出版社，Ｉ研．１４０．

２周友泉寄生虫卵检查新方法（加辟氏玻璃纸厚层涂片法）医学检验信息嘲ｈｔｐ：∥ｖｍｒａ．ｄｉｎｅｒ．㈣

３杨振华．粪便标本中寄生虫分析、检验医学信息网、卫生部临床检验中心．中华医学会检验分会．临床检验管理专业委员会．ｈｔｔｌ，：／／ｗｗ．ｄｉｎｅｒ．哪ｍ值ｉ试验新方法专栏．ｈｔｍ．

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（收稿：２００３—０Ｂ一２５）

扩大ＨＢＶ—ＤＮＡＰＣＲ—ＥＬＩＳＡ

定量方法的测量范围

河南焦作煤业集团中央医院（４５４０（）０）尚文章罗云杰郭长河摘要目的扩大ＨＢＶ—ＤＮＡＰＣＲ～ＥＬＩＳＡ定量方法的测量范围，以及解决高值计算误差较大的向题。方法对ＰＣＲ产物４０倍稀释后再进行微板杂交；用四参数方程代替正比例函数公式计算结果。结果用原法、改进法及宴时荧光定量法分别测量３０份己肝病人血ＨＢＶ—ＤＮＡ，改进法、原法与实时荧光定量法的测量结果在低值范围内一致性很好，但高值区（＞ｌ旷拷贝／ｒａｌ），原法与实时荧光定量法差异较大，而改进怯与实时荧光定量法结果差异不明显。结论扩大ＨＢＶ—ＤＮＡＰＣＲ—ＥＬＩＳＡ法测量范围的方法可普遍用于临床检验工作中。关键词乙肝病毒脱氧核糖核酸酶联免疫吸附试验聚台酶链反应检测范围

目前，ＦＩＢＶ—ＤＮＡＰＥＲ一定量试剂获得我国国家药检局批准的有两种．～种是实时荧光定量试荆，一种是ＰＣＲ—ＥＬＩＳＡ法试剂。前者虽然有操作简便，测量用时较短．测量范围宽等优点，但由于仪器价格昂贵，因准确度不高等原因，目前尚难以使用内标，在我国未得到普遍应用。ＰＣＲ—ＥＬＩＳＡ定量法虽然测量范围较窄，特别是高值区精度不高，但由于其可采用内标法，因而在低值区有较高的准确度。另外，该法所需设备造价不高，从而易于被选用。在扩大ＨＢＶ—ＤＮＡＰＣＲ—ＥＬＩＳＡ定量方法的测量范围方面，我们作了一些探索，并取得了满意的结果，现介绍如下：材料与方法１．材料：上海豪强公司生产的ＨＢＶ—ＤＮＡＰＣＲ—ＥＬＬＳＡ定量试剂盒，珠海黑马４８０Ｃ型核酸扩增仪，美国Ｓｃａｔ２１００型酶标仪，瑞士Ｋｇｈｔｃｙｃｌｅｘ全自动实时荧光分析仪，ＰＧ公司生产的实时荧光ＨＢＶ—ＤＮＡ定量试剂盒。２．ＨＢＶ—Ｉ）ＮＡＰＣＲ—ＥＬＩＳＡ法原理：先行ＨＢＶ—ＤＶＡ的扩增，将连接着生物索的捕获探针连接到包被有链亲和素的・６２・微板上。将扩增产物变性，使双链ＤＮＡ片段打开成为单链，并将其与捕获探针杂交。而后将未杂交部分冲洗掉，将标记着地高辛的显色探针与杂交至捕获探针上的ＨＢＶ—ＤＮＡ片段的另一端杂交。加入抗地高辛一过氧化物酶酶联物酶联，再加人显色液Ａ和Ｂ，在酶促反应下生产蓝色物质，加入终止液使蓝色转变成黄色。黄色耀浅与样品ＨＢＶ—ＤＮＡ模板数量问存在函数关系【ｌＪ。

３．ＨＢＶ—ＤＮＡＰＣＲ—ＥＬＩＳＡ法存在的不足之处：（１）方法测量范围太窄。该方法的单管法的测量范围是８ｘ

１０３一一４

×１０６拷贝／ｎｄ。然而，实际工作中有相当一部分病人的ＨＢＶ—Ｉ）ＮＡ含量超出此数值。因此，要使方法得到普遍应用，扩大其测量范围是重要前提条件。（２）计算误差大：现在国内市场上出现的ＨＢＶ—ＤＮＡＰＥＲ—ＥＬＩＳＡ定量试剂盘的结果计算公式多是依据正比倒函数公式求解．鄄样品ＤＮＡ＝样品孔吸光度／内标孔吸光度×内标浓度。利用此公式计算的前提条件是标准曲线为通过坐标原点的真线。而我们绘制的标准曲线并非直线，尤其是高值区，曲线更加平坦。因此，结果不准确的因索中。也包含着计算误差，尤其是高值区会存在

　万方数据医学研究通迅２００４年第３３卷第１期・额技市・更大的计算误差。结果１ＰＣＲ后的产物稀释：经过通常使用的３２个扩增循环后．若直接进行微板杂交与酶联显色，ＨＢＶ—ＤＮＡ模板数在１０３～１护之间者，则显色吸光度通常在０．５～３．５Ａ，这说明ＰＣＲ产物杂交时的浓度过高。因为一般酶标仪测量上限为２．４Ａ吸光度超过２．４Ａ者．还需将呈色溶液稀释后再在酶标仪上测量。这样做不仅仅麻烦，更重要的是精密度将受到影响。另方面，酶标仪的最低检测限为０．００１Ａ，说明，０００１～Ｏ．５Ａ这么一个大的吸光度空间未被利用。基于以上两点，说明ＰＣＲ产物杂交时浓度偏高。要降低ＰＣＲ产物杂交耐的浓度，有两种方法：一种是减少扩增的循环次数。这样做，虽然可使低浓度ＨＢＶ—ＤＮＡ样品的最后ＰＣＲ扩增产物浓度降下来。但由于高浓度模板样品在后期的循环中，是以远远低于２玎级进行扩增住ｊ，故不能有效降低高浓度ＤＮＡ模板样品的ＰＣＲ后的产物浓度。我们采用的是另外一种方法，即ＰｃＲ后产物稀释。我们使用的稀释倍数一般是４０倍。２．外标与内标的联合应用：我们通过试验发现。ＨＢＶ—ＤＮＡＰＣＲ—ＥＬＩＳＡ定量法的标准曲线，在低淮度值区（１０３～１０３）呈直线关系，但在１０５～１妒之间，则与直线之间的相关系数愈来愈小。用正比例函数或一次性函数公式计算测量结果，在高值区误差可达数十倍。而我们用四参数方程进行标准曲线的拟台，得到了较高的相关系数，根据四参数方程求出的结果也较为准确。四参数方程的数学表达为：公式：Ｙ＝（ａ—ｄ）／（Ｉ＋（ｘ／ｃ）ｏ】＋ｄＹ为待测样品ＨＢＶ—ＤＮＡ模板数，单位拷贝／ｍｌ，Ｘ为待测样品最后呈色吸光度，单位Ａｘ１０＊ａ、ｂ、ｃ、ｄ四个参数是依据四至六个标准的浓度值与对应吸光度由计算机求解。为了使用四参数方程求解，需要做高，中、低各档次浓度的标准４～６个。我们通常使用的标准分别是５×１驴，５ｘｔｏ＊，５ｘ１０ｓ．５ｘ１驴．５×１旷拷贝／ｍｌ。为克服各样品扩增效率的不一致（影响因素主要是各样品内含有不同的ＤＮＡ聚合酶激动嗣或抑制剂），应同时采用内标法。具体方法是：各测量样品ＰｃＲ扩增后产物应做两个杂交孔，一个用作测量孔（孔内有ＨＢＶ—ＤＮＡ的捕获探针），一个用作内标孔（孔内有内标的捕获探针）。最后测出各孔吸光度值并依据四参数方程求出ＨＢＶ～ＤＮＡ模板数及对应内标的模板教。而后，依据校正公式求出样品ＨＢＶ—ＤＮＡ模板数的校正值。ＨＢＶ—ＤＮＡ校正值＝样品测量拷贝数／内标测量拷贝数×内标浓度。３．改进前后方法与实时荧光定量方法的对比试验：用三种方法分别测量３０份“大三阳”乙肝患者血清ＨＢＶ—ＤＮＡ含量，所得结果见表１。进行配对ｔ检验，三种方法对低值区的样品所测结果差异不明显。但在高值区的样品。原法与实时荧光定量法差异明显，而扩大测量范匿法仍与实时荧光定量珐无明显差异。

表１改进前后方法与实时荧光定量方法的对比试验

讨论１．王豪、陶其敏等人通过评价试验证实Ｐｃ公司生产的实时荧光定量ＨＢＶ—ＤＮＡ测量试荆盒虽然在低区精密不太高，但总体上方法还是过关的（３３１４１。为此，我们做对比试验时选择了ＰＧ公司的试剂盒作为参照方法。２．通过对比试验证明，我们的扩大测量范围的方法不但将原法测量范围上限扩大到１妒拷贝，／ｍｌ，而且计算的精度与准确度大为提高，因此我们认为值得推广应用。

参考文献１辑晏海．张菊，崔大祥等改良ＦＣＲ一ⅡＪｓＡ的建立及初步虚用．临床检验杂志，２００２，（４）：２１１．２李金明定量聚台酶链反应测定技术．中华医学检验杂志．２００２，

２：１２３．３王豪，陶其敏，昊娟．两种乙型肝炎病毒ＤＮＡ定量检测方法的比较与评价．中华医学检验杂志，２００２，５：３１８．４冉其敏如何看待病毒性肝炎的基因诊断，中华医学检验杂志．２００２．２：６９．（收稿：２０∞一０９—２６）

骨转移瘤多见于老年男性北京大学人民医院病理辩沈丹华教授提出，骨转移瘤多见于老年男性。为探讨骨转移瘤的临床病理学特征以及免疫组织化学染色技术在确定原发肿瘤部位中的意义，沈教授回顾性研究了１９９８年～２００３年北京大学人民医院１４１例骨转移瘤患者的Ｉ临床及病理形态学表现，并对原发部位不明确的肿瘤，采用细胞角蛋白系列标记物以及多种特异性单克隆抗体进行免疫组织化学染色。结果发现：在１４１例骨转移瘤患者中，男女之比为１．７：１；患者发病年龄为３１—８０岁；患者的主要临床表现为病变部位的疼痛；肿瘤转移的主要发生部位依次为脊柱７９例（占５６％），长管状骨３２例（占２２．７％）．骨盆２６例（占１８．４％）。沈教授据此提出，骨转移瘤多见于老年男性；中轴骨（脊椎及骨盆）为骨转移瘤好发部位。《中国医药报》・６３・

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