猪传染性胃肠炎病毒NSP5蛋白单克隆抗体的制备及抗原表位鉴定-论文

第３７卷第３期　２０１５年３月　中国预防兽医学报　

Ｃｈｉｎｅｓｅ　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｐｒｅｖｅｎｔｉｖｅ　Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ　Ｍｅｄｉｃｉｎｅ　Ｖｏ１．３７．Ｎｏ．３　

Ｍａｒ．２０ｌ５　

ｄｏｉ：１０．３９６９８．ｉｓｓｎ．１００８－０５８９．２０１５．０３．１４　猪传染性胃肠炎病毒ＮＳ　Ｐ５蛋白单克隆抗体的制备　及抗原表位鉴定　

董　慧·，张　鑫　，陈建飞　，时洪艳　，石　达　，常铁城。，　徐天　，王智琴　，冯　力。’　谷凤丽　．－，　

（１．沈阳农业大学畜牧兽医学院，辽宁沈阳１１０１６１；２．中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室／　猪传染病研究室，黑龙江哈尔滨１５０００１；３．黑龙江八一农垦大学动物科技学院，黑龙江大庆１６３３１９；　４．东北农业大学生命科学学院，黑龙江哈尔滨１５００３０；５．首都医科大学基础医学院，北京１０００６９）　

摘要：为制备猪传染性胃肠炎病毒（ＴＧＥＶ）ＮＳＰ５蛋白的单抗隆抗体（ＭＡｂ）ＴＬ鉴定其抗原表位，本研究以原　核表达并纯化的重组ＮＳＰ５蛋白（ｒＮＳＰ５．ＧＳＴ）免疫ＢＡＬＢ／ｃ小鼠，取其脾淋巴细胞与ＳＰ２／０细胞进行融合，通过间　接ＥＬＩＳＡ方法筛出一株稳定分泌抗ＴＧＥＶ　ＮＳＰ５蛋白的ＭＡｂ杂交瘤细胞株（５ｃ３）。ＭＡｂ亚类鉴定结果显示其抗体　亚类为ＩｇＧ１／Ｋ链。杂交瘤细胞培养上清液和腹水的效价分别为１：６　４００和１：１０　。Ｗｅｓｔｅｍ　ｂｌｏｔ鉴定表明该ＭＡｂ能　够识别原核及真核表达的ＮＳＰ５重组蛋白。利用肽扫描法鉴定显示，该ＭＡｂ识别的抗原表位为　ＦＴＰＴＥｖＩＲ　ＱＭＹＧＶＮ　。本研究制备的ＭＡｂ及其抗原表位的鉴定，为ＴＧＥｖＮＳＰ５蛋白结构和功能的研究奠定了基础。　关键词：猪传染性胃肠炎病毒；ｎｓｐ５基因；单克隆抗体；抗原表位　中图分类号：￥８５２．６５　文献标识码：Ａ　文章编号：１００８．０５８９（２０１５）０３－０２２０．０５　

Ａｎｔｉｇｅｎｉｃ　ｅｐｉｔｏｐｅ　ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｏｆ　ＮＳＰ５　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｉｎ　ＴＧＥＶ　ＤＯＮＧ　Ｈｕｉ　，ＺＨＡＮＧ　Ｘｉｎ２，ＣＨＥＮ　Ｊｉａｎ—ｆｅｉ　，ＳＨＩ　Ｈｏｎｇ－ｙａｎ　，ＳＨＩ　Ｄａ。，ＣＨＡＮＧ　Ｔｉｅ—ｃｈｅｎｇ３，　ＧＵ　Ｆｅｎｇ—ｌｉ　，．，ＸＵ　Ｔｉａｎ　，ＷＡＮＧ　Ｚｈｉ．ｑｉｎ　，ＦＥＮＧ　Ｌｉ　（１．Ｃｏｌｌｅｇｅ　ｏｆ　Ａｎｉｍａｌ　Ｓｃｉｅｎｃｅ　ａｎｄ　Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ　Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，Ｓｈｅｎｙａｎｇ　Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｓｈｅｎｙａｎｇ　１　１０１６１，Ｃｈｉｎａ；　２．Ｄｉｖｉｓｉｏｎ　ｏｆ　Ｓｗｉｎｅ　Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ　Ｄｉｓｅａｓｅ，Ｓｔａｔｅ　Ｋｅｙ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　ｏｆ　Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｈａｒｂｉｎ　Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ　Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，Ｃｈｉｎｅｓｅ　Ａｃａｄｅｍｙ　ｏｆ　Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ　Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｈａｒｂｉｎ　１５０００１，Ｃｈｉｎａ；３．Ｃｏｌｌｅｇｅ　ｏｆ　Ａｎｉｍａｌ　Ｓｃｉｅｎｃｅ　ａｎｄ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｈｅｉｌｏｎｇｊｉａｎｇ　Ｂａｙｉ　Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｄａｑｉｎｇ　１６３３　１９，Ｃｈｉｎａ；４．Ｃｏｌｌｅｇｅ　ｏｆ　Ｌｉｆｅ　Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｎｏｒｔｈｅａｓｔ　Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ　Ｕｎｉｖｅｒｃｉｔｙ，Ｈａｒｂｉｎ　１５００３０，Ｃｈｉｎａ；　５．Ｃｏｌｌｅｇｅ　ｏｆ　Ｂａｓｉｃ　Ｍｅｄｉｃａｌ，Ｃａｐｉｔａｌ　Ｍｅｄｉｃａｌ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｂｅｉｊｉｎｇ　１０００６９，Ｃｈｉｎａ）　

Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｔｏ　ｐｒｅｐａｒｅ　ｔｈｅ　ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ　ａｎｔｉｂｏｄｉｅ（ＭＡｂ）ａｇａｉｎｓｔ　ｎｏｎ—ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ　ｐｒｏｔｅｉｎ　５（ＮＳＰ５）ｏｆ　ｐｏｒｃｉｎｅ　ｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｂｌｅ　ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｉｔｉｓ　ｖｉｒｕｓ（ＴＧＥＶ）ａｎｄ　ｉｄｅｎｔｉｆｙ　ｔｈｅ　ｅｐｉｔｏｐｅ　ｏｆ　ＮＳＰ５，ＳＰ２／０　ｍｙｅｌｏｍａ　ｃｅｌｌｓ　ｗｅｒｅ　ｆｕｓｅｄ　ｗｉｔｈ　ｓｐｌｅｅｎ　ｃｅｌｌｓ　ｆｒｏｍ　６　ｗｅｅｋ—ｏｌｄ　ＢＡＬＢ／ｃ　ｍｉｃｅ　ｉｍｍｕｎｉｚｅｄ　ｗｉｔｈ　ｐｕｒｉｆｉｅｄ　ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ　ＮＳＰ５　ｏｆ　ＴＧＥＶ　ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ　ｉｎ　Ｅ．ｃｏｌｉ．Ｏｎｅ　ｈｙｂｉｄｏｍａ　ｃｅｌｌ　ｌｉｎｅｓ　ｓｔａｂｌｙ　ｓｅｃｒｅｔｉｎｇ　ＭＡｂ　ａｇａｉｎｓｔ　ＮＳＰ５　ｏｆ　ＴＧＥＶ　ｗａｓ　ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄ　ｂｙ　ｉｎｄｉｒｅｃｔ　ＥＬＩＳＡ．Ｔｈｅ　ＭＡｂ　ｂｅｌｏｎｇｅｄ　ｔｏ　ＩｇＧ１　ｓｕｂｔｙｐｅ　ｗｉｔｈ　Ｋ　ｃｈａｉｎ．Ｔｈｅ　ｔｉｔｅｒｓ　ｉｎ　ｃｅｌｌ　ｃｕｌｔｕｒｅ　ｍｅｄｉｕｍ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｈｙｂｉｄｏｍａｓ　ａｎｄ　ａｓｃｉｔｅｓ　ｗｅｒｅ　１：６　４００　ａｎｄ　１：１　０　，ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ．Ｗｅｓｔｅｒｎ　ｂｌｏｔ　ａｓｓａｙ　ｓｈｏｗｅｄ　ｔｈａｔ　ｔｈｅ　ＭＡｂ　ｗａｓ　ａｂｌｅ　ｔｏ　ｒｅｃｏｇｎｉｚｅ　ｔｈｅ　ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ　ＮＳＰ５．Ｆｕｒｔｈｅｒｍｏｒｅ，ｅｐｉｔｏｐｅ　ｏｎ　ＮＳＰ５　ｗａｓ　ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄ　ｂｙ　ｐｅｐｓｃａｎ　ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ　ａｎｄ　ｔｈｅ　ｌｉｎｅａｒ　ｅｐｉｔｏｐｅ　ｏｆ　ＦＴＰＴＥＶＩＲＯＭＹＧＶＮ　ｗａｓ　ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄ　ｂｙ　ｗｅｓｔｅｒｎ　ｂｌｏｔ　ａｎｄ　ＥＬＩＳＡ　ｗｉｔｈ　ｔｈｅ　ＭＡｂ．Ｔｈｅｓｅ　ｒｅｓｕｌｔｓ　ｄｅｍｏｎｓｔｒａｔｅｄ　ｔｈａｔ　ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｔｈｅ　ＭＡｂ　ａｎｄ　ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｅｐｉｔｏｐｅ　ｗｏｕｌｄ　ｆａｃｉｌｉｔａｔｅ　ｔｈｅ　ｆｕｒｔｈｅｒ　ｓｔｕｄｙ　ｏｎ　ｔｈｅ　ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ　ａｎｄ　ｆｕｎｃｔｉｏｎ　ｏｆ　ＴＧＥＶ　ＮＳＰ５．　Ｋｅｙ　ｗｏｒｄｓ：ｐｏｒｃｉｎｅ　ｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｂｌｅ　ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｉｔｉｓ　ｖｉｒｕｓ；ｎｓｐ５　ｇｅｎｅ；ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ　ａｎｔｉｂｏｄｙ；ａｎｔｉｇｅｎｉｃ　ｅｐｉｔｏｐｅ　＊Ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇ　ａｕｔｈｏｒ　收稿Ｅｔ期：２０１４．０９—２６　基金项目：黑龙江省高等学校科技创新团队项目（２０１１ＴＤＯ０１）　作者简介：董慧（１９８９．），女，黑龙江哈尔滨人，硕士研究生，主要从事兽医药理学与毒理学研究　通信作者：Ｅ－ｍａｉｌ：ｗｚｑ７６２６＠１２６．ｔｏｍ；ｆｅｎｇｌｉｈ＠１６３．ｃｏｍ　第３期　董慧，等．猪传染性胃肠炎病毒ＮＳＰ５蛋白单克隆抗体的制备及抗原表位鉴定　２２１　猪传染性胃肠炎病毒（Ｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｂｌｅ　ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｉｔｉｓ　ｖｉｒｕｓ　ｏｆ　ｓｗｉｎｅ，ＴＧＥＶ）属于套式病毒目，冠状病毒　科，仪．冠状病毒属，为引起仔猪病毒性腹泻的病原　之一川，由其引起的猪传染性胃肠炎（ＴＧＥ）以呕吐、　严重腹泻和对２周龄以内仔猪的高度致死为特征。　冠状病毒的非结构蛋白具有多种功能，其中包括参　与ＲＮＡ转录、翻译和蛋白合成、加工和修饰以及　病毒复制、感染宿主等功能。ＴＧＥＶ　ＮＳＰ５蛋白为蛋　白水解酶，大小为２７　ｋｕ￣３４　ｋｕ，因其与微小ＲＮＡ　病毒３Ｃ蛋白酶具有相似的识别位点而被称为３Ｃ样　蛋白酶（３ｃ．１ｉｋｅ　ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ，３ＣＬｐｒｏ）。３ＣＬｐｒｏ可以结　合ＯＲＦｌａｂ上的１　１个保守的Ｑ．Ｓ二肽位点从而水解　产生１２个成熟的非结构蛋白（ＮＳＰ５￣ＮＳＰ１６）。研究　表明，不同亚群病毒的３ＣＬｐｒｏ底物结合部位具有很　高的保守性，如ＳＡＲＳ．ＣｏＶ的３ＣＬｐｒｏ可以裂解　ＴＧＥＶ的底物　。　本实验通过制备ＴＧＥＶ　ＮＳＰ５蛋白单克隆抗体　（ＭＡｂ）并对其抗原表位进行鉴定，为ＴＧＥＶ　ＮＳＰ５蛋　白结构及其相关功能的研究奠定了基础。　１材料和方法　１．１　病毒核酸、细胞及实验动物ＴＧＥＶ　ｃＤＮＡ、　ＳＰ２／０骨髓瘤细胞和ｓＴ细胞由本实验室保存；大肠　杆菌Ｔｒａｎｓ５ａ和ＢＬ２１（ＤＥ３）感受态细胞购自北京全　式金生物技术有限公司；６周龄～８周龄ＢＡＬＢ￣小　鼠购自中国农业科学院哈尔滨兽医研究所实验动物　中心。　１．２主要试剂ｐＧＥＸ．６Ｐ．１和ｐＥＧＦＰ．Ｃ２载体由本　实验室保存；质粒ＤＮＡ小量试剂盒购自Ａｘｙｐｒｅｐ公　司；ＥｎｄｏＦｒｅｅ　Ｐｌａｓｍｉｄ　Ｍａｘｉ　Ｋｉｔ和Ａｔｔｒａｃｔｅｎｅ　Ｔｒａｎｓｆｅｃ．　ｔｉｏｎ　Ｒｅａｇｅｎｔ购自ＱＩＡＧＥＮ公司；Ａｎｔｉ．ＧＦＰ　ａｎｔｉｂｏｄｙ　购自Ａｂｃａｍ公司；弗式完全佐剂、弗式不完全佐　剂、ＰＥＧ１４５０、ＨＡＴ和ＨＴ购自ＳＩＧＭＡ公司；ＨＲＰ　标记山羊抗鼠ＩｇＧ（ＩｇＧ．ＨＲＰ）购自北京中杉金桥生物　技术有限公司；ＴＭＢ购自ＡＭＲＥＳＣＯ公司；ＭＡｂ　亚类鉴定试剂盒ＳＢＡ　ＣｌｏｎｏｔｙｐｉｎｇＴＭ　Ｓｙｓｔｅｍ／ＨＲＰ购自　Ｓｏｕｔｈｅｒｎ　Ｂｉｏｔｅｃｈ公司；ＩＲＤｙｅ７００ＤＸ＠兔抗猪ＩｇＧ、　ＩＲＤｙｅ７００ＤＸ＠绵羊抗兔ＩｇＧ和ＩＲＤｙｅ７００ＤＸ⑧山羊　抗鼠ＩｇＧ购自本研究所；蛋白质Ｍａｒｋｅｒ购自Ｔｈｅｒｍｏ　公司。　１．３　ＴＧＥＶ　ＮＳＰ５蛋白的表达及纯化　根据Ｇｅｎ．　Ｂａｎｋ中ＥＵ０７４２１８．２序列设计并合成２对扩增　ＴＧＥＶ　ｎｓｐ５基因的引物，引物序列分别为：上游引　物１：　５＇－ＧＴ　△！　ＴｃＡＧＧＴＴＴＡＣＧＧＡＡＡＡＴＧＧｃ　３’（ＢａｍＨ　Ｉ）；下游引物１：５＇－ＧＡｃＴｃＧＡＧｃＴＧＡＡＧ　ＡＴＴＴＡＣＡＣＣＡＴＡＣ．３’（Ｘｈｏ　Ｉ）。上游引物２：５＇－ＧＴ　！　ＴＣＡＧＧＴＴＴＡＣＧＧＡ　Ａ　ＡＡＴＧＧＣ一３’（Ｘｈｏ　Ｉ）；　下游引物２：５＇－ＧＡＧＧＡＴＣＣＣＴＧＡＡＧＡＴＴＴＡＣＡＣＣＡ　ＴＡＣ．３’（ＢａｍＨ　Ｉ），引物由哈尔滨博仕生物技术有限　公司合成。以ＴＧＥＶ　ｃＤＮＡ为模板，ＰＣＲ扩增ｎｓｐ５　基因，将扩增的ＴＧＥＶ　ｎｓｐ５基因、ｐＧＥＸ．６Ｐ．１和　ｐＥＧＦＰ．Ｃ２分别用ＢａｍＨ　Ｉ和Ｘｈｏ　Ｉ双酶切，用Ｔ４　ＤＮＡ连接酶１６℃过夜连接，构建重组质粒ｐＧＥＸ．　ＮＳＰ５和ｐＥＧＦＰ—ＮＳＰ５。　将构建的重组质粒ｐＧＥＸ－ＮＳＰ５转化ＢＬ２１（ＤＥ３）　感受态细胞，经ＩＰＴＧ诱导表达，离心，超声破碎，　分离上清液和沉淀。通过ＳＤＳ．ＰＡＧＥ分析重组蛋白　（ｒＮＳＰ５．ＧＳＴ）的表达。利用谷胱甘肽树脂对ｒＮＳＰ５．　ＧＳＴ进行纯化，通过ＳＤＳ．ＰＡＧＥ分析其纯度，超微　量分光光度计测定蛋白浓度。　将构建的重组质粒ｐＥＧＦＰ．ＮＳＰ５转化Ｔｒａｎｓ５ｏＬ感　受态细胞，用ＥｎｄｏＦｒｅｅ　Ｐｌａｓｍｉｄ　Ｍａｘｉ　Ｋｉｔ提取重组质　粒ｐＥＧＦＰ－ＮＳＰ５，按照Ａｔｔｒａｃｔｅｎｅ　Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ　Ｒｅａｇｅｎｔ　说明书方法将重组质粒ｐＥＧＦＰ－ＮＳＰ５转染ｓＴ细胞以　表达ｒＮＳＰ５．ＧＦＰ蛋白。　１．４重组蛋白的ｗｅｓｔｅｒｎ　ｂｌｏｔ鉴定　以纯化的ｒＮ．　ＳＰ５．ＧＳＴ为抗原，抗ＴＧＥＶ猪阳性血清为一抗，　ＩＲＤｙｅ７００ＤＸ＠兔抗猪ＩｇＧ（１：５　ｏｏｏ）为二抗，进行　ｗｅｓｔｅｒｎ　ｂｌｏｔ鉴定ｒＮＳＰ５．ＧＳＴ的抗原性。收集并裂解　转染后２４　ｈ的ｓＴ细胞作为抗原，以抗ＧＦＰ标签的　多抗为一抗，ＩＲＤｙｅ７００ＤＸ＠绵羊抗兔ＩｇＧ（１：５　０００）　为二抗，进行ｗｅｓｔｅｒｎ　ｂｌｏｔ鉴定检测ｒＮＳＰ５．ＧＦＰ的表　达。　１．５动物免疫将纯化的ｒＮＳＰ５．ＧＳＴ蛋白与等体　积的弗式不完全佐剂乳化后，按５０　只的剂量腹　部皮下注射免疫６周龄～８周龄ＢＡＬＢ￣小鼠。间隔　２周免疫一次，共免疫３次，第２次和第３次免疫　时用ｒＮＳＰ５．ＧＳＴ蛋白与等体积的弗式完全佐剂进行　乳化，５０　只。第３次免疫一周后，断尾采血，　间接ＥＬＩＳＡ方法检测小鼠抗体水平，选择抗体水平　最高的小鼠腹腔注射ｒＮＳＰ５．ＧＳＴ蛋白５０　只加强　免疫　，３　ｄ后取脾脏进行细胞融合。　１．６细胞融合、ＭＡｂ的制备以及ＭＡｂ亚类鉴定