生物技术制药重点及名词解释
生物技术制药复习要点与重点
复习要点第一章绪论1.生物药物的概念及21世纪生物药物的分类2.生物技术(Biotechnology)概念及现代生物技术的组成和特点3.基因工程技术、细胞工程技术、酶工程技术、发酵工程技术定义4.基因诊断、基因治疗概念5.生物技术在药学应用中的两类方式6.生物药物的两大来源及生物药物的特点7.生物制药的特点、生物制药基本过程及生物制药基本方法第五章发酵工程制药1.发酵定义及发酵类型2.菌种的选育方法3.培养基概念和培养基的配制原则4.发酵的基本过程5.微生物发酵方式6.发酵过程影响因素及控制7.代谢工程定义8.简述发酵工程下游加工过程的的特点和一般程序第二章基因工程制药1.基因的概念及基因的一般特性2.基因工程药物的概念3.基因工程药物制药的主要流程4.基因工程药物建立分离纯化工艺的根据5.基因工程药物分离纯化的一般流程6.基因工程产品的质量控制内容7.基因工程药物临床前安全性评价的特殊性8.蛋白质工程的概念第三章动物细胞工程制药1.细胞定义、细胞的特征和细胞的化学组成2.细胞培养定义、细胞培养基本条件和基本过程3.细胞融合技术定义和基本过程4.细胞工程技术概念和动物细胞工程制药的基本概念5.动物细胞培养的基本技术和动物细胞培养特点6.细胞株、细胞系、原代培养和传代培养的概念7.动物细胞的大规模培养方法8.转基因动物概念(transgenic animal)及转基因的技术方法9.转基因动物在医药行业中的应用10.动物乳腺生物反应器(mammary gland bioreactor)概念第四章植物细胞工程制药1.植物细胞工程制药的两大内容2.植物细胞的全能性定义和原理3.植物细胞特点——外植体(explant)、脱分化(dedifferentiation)、再分化(redifferentiation)、愈伤组织(callus culture)概念4.植物细胞的培养方法5.转基因植物概念及主要方法6.植物细胞工程制药应用于哪些方面第六章酶工程制药1.酶工程概念和现代酶工程研究的主要内容2.酶固定化概念、方法和固定化酶的特点3.细胞固定化概念和固定化细胞的特点4.酶反应器(Enzyme reactor)的概念第七章新型生物制药技术抗体工程制药1.概念——抗体(antibody) 、多克隆抗体(Polyclonal antibody,PcAb)、单克隆抗体(monoclonalantibody)、杂交瘤细胞(hybridoma) 技术、抗体工程2.单抗制备的基本流程3.HA T培养基的选择培养杂交瘤细胞的原理4.单克隆抗体的鉴定与检测项目5.基因工程抗体概念和基因工程抗体的类型———嵌合抗体(Chimeric Antibodies),改形抗体(reshaped Antibodies),单链抗体(single chain antigen binding protein,ScFv) 等6.噬菌体抗体工程和转基因动物表达抗体的优点7.反义核酸( ribozyme) 、核酶(antisense nucleic acide)、RNA干扰(RNA interference,RNAi)概念8.核酸疫苗(nucleic acid vaccine)又称基因疫苗(gene caccine)或DNA疫苗(DNA vaccine)概念和核酸疫苗的优点9.基因治疗概念、基因治疗的必要条件和主要方式10.干细胞、胚胎干细胞(embryonic stem cell,ES细胞)的概念及应用11 生物芯片基因芯片,蛋白芯片12.。
生物技术制药重点
⽣物技术制药重点重点（单选10个，名词解释4个，简单3个，论述2个。
）1.⽣物技术制药飞速发展的30年20世纪70年代中期⽣物时代（重组DNA、DNA的合成、DNA和蛋⽩质的微量测序技术、重组蛋⽩、单克隆抗体⼈胰岛素）20世纪80年代中期技术平台时代（新平台：⾼通量筛选、组合化学、胚胎⼲细胞技术，药物的探索性研究、治疗的新模式：反义药物、基因治疗以及在治疗中添加使⽤重组蛋⽩、胰岛素、⼲扰素、EPO、细胞集落刺激因⼦（CSF）、⼈⽣长激素等）20世纪90年代中期基因组时代（新技术：基因组、⾼通量的测序、基因芯⽚、⽣物信息、⽣物能源、⽣物光电、⽣物传感器、蛋⽩质组学和功能基因组学等制药⼯程，新药研发）2006年后基因组时代2.质粒三要素、基因⼯程制药流程、蛋⽩质纯化技术质粒载体的三个要素（1）复制⼦: ⼜称复制起始区（2）选择标记：⽤于筛选鉴定(3) 多克隆位点: 限制性内切酶识别序列基因⼯程制药流程:1.⽬的基因的制备2.载体3.载体与⽬的基因的连接4.重组DNA导⼊宿主细胞5.重组⼦的筛选和鉴定6.细胞表达系统的选择7.基因重组蛋⽩的分离和纯化基因重组蛋⽩的主要纯化技术1. 离⼦交换层析利⽤蛋⽩质等电点的差异，通过带电的溶质分⼦与离⼦交换剂中可以交换的离⼦进⾏交换离⼦交换剂阴离⼦交换剂、阳离⼦交换剂、两性离⼦交换剂、选择性离⼦交换剂影响因素盐离⼦浓度、离⼦⼤⼩、洗脱梯度与流速2. 亲和层析利⽤固定化配基于⽬的蛋⽩之间特异的⽣物亲和⼒进⾏吸附酶与激活剂/受体/底物抗体与抗原受体与激素/配体蛋⽩质与DNA/RNA结合域亲和层析步骤：配基固定化亲和吸附洗涤洗脱解离再⽣3.凝胶过滤4.反相层析和疏⽔层析反相层析：有机溶液洗脱，蛋⽩质可能变性疏⽔层析：盐溶液洗脱3.动物细胞培养常⽤溶液、培养基、⽣产⽤动物细胞动物细胞培养基是维持动物组织及细胞在体外⽣存、⽣长的基本的营养物质。
1．天然培养基：直接采⽤取⾃动物体液或组织中提取的成分作培养液，如乳蛋⽩⽔解物、酪蛋⽩⽔解物、⾎清、⾎浆及胚胎浸出液等(维持液：含低浓度或不含⼩⽜⾎清 /⽣长液：含5％～20％⼩⽜⾎清 )2．合成培养基：化学成分主要为氨基酸、碳⽔化合物、蛋⽩质、核酸类物质、维⽣素、辅酶、激素、⽣长因⼦、微量元素及缓冲剂等。
生物技术制药重点简答总结
⽣物技术制药重点简答总结⽣物技术制药概论1、⽣物技术制药过程包括哪些内容（P5）第⼀阶段：实验室研究阶段，也称为发现或探索研究，属于应⽤基础研究阶段;第⼆阶段：产品开发阶段，属于应⽤阶段，与第⼀阶段统称为研发阶段，即临床前研究;第三阶段：商业化阶段，是将产品推向市场的过程。
2、详细说明下⾯专业英语的含义：T arget identification and validation：靶基因的发现和证实Assay development：建⽴检验⽅法Proof of concept:理论验证High throughput:⾼通量筛选Lead generation:先导化合物的发现Lead optimization: 先导化合物的优化System biology：系统⽣物学Therapeutics: 治疗学Commercialization : 商业化First human dose：⼈类第⼀剂量基因⼯程制药3、有哪些⽅法合成第⼆链cDNA?第⼀：⾃我引导合成法，（Self priming）：RNaseH 消化mRNA摸板；cDNA 3’形成发夹结构（loop）；发夹作为引物合成第⼆链；需要酶：klenow 和S1。
第⼆：⼤肠杆菌RNaseH酶降解取代法（Replacement synthesis）：RNaseH 在RNA摸板上形成缺⼝或空隙，从⽽形成RNA引物；在E.coli DNA polymerase 的驱动下合成⾮连续性第⼆链，需要T4 连接酶接合形成完整第⼆链。
4、有哪些引物⽤来合成cDNA第⼀链？Oligo dT (T=12-18),；随机引物(n=6) ；基因特异性引物(n=18-25)5、建⽴cDNA ⽂库有什么好处？（书）cDNA⽂库代表⽣物某⼀特定器官或组织在某⼀特定的发育时期，细胞转录⽔平上的基因群体。
因为基因组含有的基因在特定的组织细胞中只有⼀部分表达，⽽且处在不同的环境条件、不同的分化时期，故基因表达的种类和强度也不尽相同，因此cDNA⽂库具有组织特异性。
生物制药名词解释
生物制药名词解释1、药物Medicine(remedy)：用于预防、治疗或诊断疾病或调节机体生理功能、促进机体康复保健的物质，有4 大类：预防药、治疗药、诊断药和康复保健药。
2、生物药物（biopharmaceutics）：是以生物体、生物组织或其成份为原料（包括组织、细胞、细胞器、细胞成分、代谢、排泄物）综合应用生物学、物理化学与现代药学的原理与方法加工制成的药物。
3、基因药物（gene medicine）：是以基因物质（RNA 或DNA 及其衍生物）作为治疗的物质基础，包括基因治疗用的重组目的DNA 片段、重组疫苗、反义药物和核酶等。
4液-液萃取：是指用一种溶剂将物质从另一种溶剂中提取出来的方法。
5萃取:料液与萃取剂接解后，料液中的溶质的萃取济转移的过程就叫萃取。
6、反义药物：是以人工合成的十至几十个反义寡核苷酸序列，它能与模板DNA 或mRNA 互补形成稳定的双链结构，抑制靶基因的转录和mRNA 翻译，从而达到抗肿瘤和抗病毒作用。
`7、生物制品（biologics）：是应用普通的或以基因工程、细胞工程、蛋白质工程、发酵工程等生物技术获得的微生物、细胞及各种动物和人源的组织和液体等生物材料制备的，用于人类疾病预防、治疗和诊断的药品。
8、RNA 干涉（RNAi，RNA interference）：是指在生物体细胞内，dsRNA 引起同源mRNA 的特异性降解，因而抑制相应基因表达的过程。
9、siRNA (small interfering RNA)：是一种小RNA 分子（~21-25 核苷酸），由Dicer （RNAase Ⅲ家族中对双链RNA 具有特异性的酶）加工而成。
siRNA是siRISC (RNA-induced silencing complex 由核酸内切酶、核酸外切酶、解旋酶等构成，作用是对靶mRNA 进行识别和切割）的主要成员，激发与之互补的目标mRNA 的沉默。
10、酶工程（enzyme engineering）：是从应用目的出发，研究酶和应用酶的特异催化功能，并通过工程化过程将相应原料转化成所需产物的技术。
生物制药知识点总结(HPU)
生物制药知识点总结名词解释：1.生物技术药物：采用DNA重组技术或其他生物新技术研制的蛋白质或核酸类药物。
2.干扰素：人体细胞分泌的一种具有广泛抗病毒，抗肿瘤和免疫调节活性的活性蛋白质。
3.高密度发酵：是应用一定的培养技术和设备来提高菌体生物量和目标产物时空产率的发酵技术。
是指培养液中工程菌的菌体浓度在50gDCW/L以上，理论上的最高值可达200gDCW/L.4.植物细胞全能性：指植物的每个细胞都包含着该物种的全部遗传信息，从而具备发育成完整植株的遗传能力。
5.细胞分化：在个体发育中，由一个或一种细胞增殖产生的后代，在形态结构和生理功能上发生稳定性的差异的过程。
6.脱分化：已分化的细胞在一定因素作用下恢复细胞分裂能力,失去原有分化状态的过程。
7.继代培养：由最初的外植体上切下的新增殖的组织，培养一段时间而称之为第一代培养。
连续多代培养即为继代培养。
8.固定化酶：是指经过物理或化学方法处理，使酶变成不易随水流失即运动受到限制，而又能发挥催化作用的酶制剂。
9.抗体酶：具催化能力的免疫球蛋白，具有典型的酶反应特性。
10.发酵工程：利用微生物制造工业原料与工业产品提供服务的技术。
简答题1.生物技术制药的特征：1）高技术2）高投入3）长周期4）高风险5）高收益2.利用基因工程技术生产药品的优点：1）利用基因工程技术可大量生产过去难以获得的生理活性蛋白和多肽，为临床使用建立有效的保障2）可以提供足够数量的生理活性物质，以便对其生理、生化和结构进行深入的研究，从而扩大这些物质的应用范围3）利用基因工程可以发掘更多内源性生理活性物质4）内源性活性物质在作为药物使用时，存在不足之处，可以通过基因工程和蛋白质工程对其改造5）利用基因工程技术可获得新型化合物，扩大药物筛选来源3.利用基因工程生产药物的基本过程：①目的基因的克隆，②构造DNA重组体，③构造工程菌，④目的基因的表达，⑤外源基因表达产物的分离纯化产品的检验4.反转录法获得目的基因的过程：1）mRNA纯化2）cDNA第一链的合成3）cDNA第二链的合成4）cDNA克隆5）将重组体导入宿主细胞6）cDNA文库的鉴定7)目的cDNA克隆的分离与鉴定5.影响基因工程菌的因素，如何控制：1）培养基：需要对基质中营养物质的配比进行优化，以满足细菌大量繁殖和外源蛋白表达的需要。
生物技术制药课堂重点
第一章绪论·生物技术（biotechnology）：是指将生物用于有价值产品的生产。
·生物技术制药（biotechnology pharmaceutics）:用现代生物技术制造药物。
是指利用基因工程、细胞工程、发酵工程、酶工程、蛋白质工程等生物技术，来研究、开发和生产用于预防、治疗、诊断疾病的药物。
·生物药物（biological drug）：从生物体中制取的各种天然活性物质及其人工合成或半合成的天然物质类似物。
·生物技术药物（biotechnological drug）:利用现代生物技术生产的蛋白质或核酸类等生物药物。
·现代生物技术的主要内容基因工程技术细胞工程技术酶工程技术发酵工程技术·生物技术制药的主要内容基因工程制药细胞工程制药酶工程制药发酵工程制药·基因工程技术：是将一种生物体的基因与载体在体外进行连接，然后转入另一种生物体内，使重组基因在受体细胞内表达，产生出人类所需要的基因产物。
·细胞工程技术：包括细胞及转基因细胞的离体培养、繁殖、再生、融合以及细胞核、细胞器（如线粒体、叶绿体等）的移植与改建等操作技术。
·酶工程技术：在一定生物反应装置中利用酶的催化作用，将相应的原料转化成有用物质的技术。
·发酵工程技术：培养活细胞以取得生物体或代谢产物的技术。
（抗生素、氨基酸、维生素）·生物制药：从生物材料中提取、分离、纯化药物的过程。
第二章基因工程制药·基因工程制药：是指利用基因工程技术生产蛋白质或多肽类药物。
·基因工程药物制造步骤:上游阶段：分离目的基因，构建工程菌，目的基因的表达。
下游阶段：从工程菌的大量培养到产品的分离纯化和质量控制。
·分离纯化的步骤：细胞分离-细胞破碎-固液分离-浓缩与初步分离-高度纯化直至得到纯品-成品加工·基因重组蛋白的主要分离技术：分离、沉淀（等电点沉淀法、盐析法）、膜分离、双水相萃取。
生物技术制药试题及答案
生物技术制药试题及答案一、名词解释1. 生物技术（biotechnology）：有时也称为生物工程（bioengineering），是指人们以现代生命科学为基础，结合先进的工程技术手段和其他基础学科的科学原理，利用生物得体或其体系或它们的衍生物来制造人类所需要的各种产品或达到某种目的的一门新兴的、综合性的学科。
2．基因工程（gene enginerring）：是指在基因水平上的操作并改变生物遗传特性的技术。
即按照人们的需要，用类似工程设计的方法将不同来源的基因（DNA 分子）在体外构建成杂种DNA分子，然后导入受体细胞，并在受体细胞内复制、转录和表达的操作，也称DNA重组技术。
3．细胞工程（cell engineering）：是指在细胞为基本单位，在体外条件下进行培养、繁殖或人为地使细胞某些生物学特性按人们的意愿发生改变，从而达到改良生物品种和创造新品种的目的，加速繁育动植物个体，或获得某种有用物质的技术。
4．酶工程（enzyme engineering）：是利用酶、细胞器或细胞所具有的特异催化功能或对酶进行修饰改造，并借助生物反应器和工艺过程来生产人类所需产品的技术。
5．发酵工程（fermentation engineering）：是指利用包括工程微生物在内的某些微生物或动、植物细胞及其特定功能，通过现代工程技术手段（主要是发酵罐或生物反应品的自动化、高效化、功能多样化、大型化）生产各种特定的有用物质；或把微生物直接用于某些工业化生产的一种技术。
由于发酵多与微生物密切联系在一起，所以又称之为微生物工程或微生物发酵工程。
6. 生物反应器（bioreactor）：主要包括微生物反应器、植物细胞培养反应器，动物细胞培养反应器以及新发展起来的有活体生物反应器之称的转基因植物生物反应器，转基因动物生物反应器等。
7. 转基因动物：是指在基因组中稳定地整合有导入的外源基因的动物。
8. 转基因植物：是指通过体外重组DNA技术将外源基因转入到植物细胞或组织，从而获得新遗传特性的再生植物。
生物技术制药复习知识点
生物技术制药复习知识点第一章绪论1.生物制药的研究内容包括基因工程制药，细胞工程制药，酶工程制药和发酵工程制药。
2.生物技术制药，是采用现代生物技术人为地创造一些条件，借助某些微生物、植物或动物来生产所需的医药品。
3.生物技术药物，是采用DNA 重组技术、单克隆抗体技术或其它生物新技术研制的蛋白质、治疗性抗体或核酸类药物。
4.生物药物，指包括生物制品在内的生物体的初级和次级代谢产物或生物体的某一组成部分，甚至整个生物体用作诊断和治疗的医药品。
5.现代生物药物四种类型：①应用DNA重组技术制造的基因重组多肽、蛋白质类治疗剂。
②基因药物，如基因治疗剂、基因疫苗、反义药物和核酶等。
③来自动植物和微生物的天然生物药物。
④合成与部分合成的生物药物。
6.生物药物按功能用途分为三类：治疗药物，预防药物和诊断药物。
7.生物技术药物的特性：分子结构复杂，具种属特异性，治疗针对性强、疗效高，稳定性差，基因稳定性，免疫原性、重复给药会产生抗体，体内半衰期短，受体效应，多效性和网络效应，质量控制的特殊性，生产系统的复杂性。
8.生物技术制药特征：高技术，高投入，长周期，高风险，高收益。
9.基因诊断：指采用分子生物学的方法在DNA水平或RNA水平对基因的结构和功能进行分析从而对特定的疾病进行诊断。
第二章基因工程制药1.利用基因工程技术生产药品的优点：（1）可以大量生产过去难以获得的生理活性蛋白和多肽（如胰岛素、干扰素、细胞因子等），为临床使用提供有效的保障；（2）可以提供足够数量的生理活性物质，以便对其生理、生化和结构进行深入的研究，从而扩大这些物质的应用范围；（3）利用基因工程技术可以发现、挖掘更多的内源性生理活性物质；（4）内源性生理活性物质在作为药物使用时存在的不足之处，可通过基因工程和蛋白质工程进行改造和去除；（5）利用基因工程技术可获得新型化合物，扩大药物筛选来源。
2.基因工程技术就是将目的基因插入载体，拼接后转入新的宿主细胞，构建工程菌（或细胞），实现遗传物质的重新组合，并使目的基因在工程菌内进行复制和表达的技术。
生物技术制药知识点总结
生物技术制药知识点纲要生物技术制药:采用现代生物技术，借助某些微生物、植物、动物生产药品。
生物技术药物一般来说，采用DNA重组技术或其他生物新技术研制的蛋白质或核酸类药物。
生物药物：生物技术药物是重组产品概念在医药领域的扩大应用，并与天然药物.微生物药物.海洋药物和生物制品一起归类为生物药物。
生物技术：基因工程、细胞工程、酶工程、发酵工程、生化工程、蛋白质工程、抗体工程等。
基因工程是生物技术的核心和关键，是主导技术；细胞工程是生物技术的基础；酶工程是生物技术的条件；发酵工程是生物技术获得最终产品的手段。
生物技术：从广义角度来看，是人类对生物资源（包括微生物、植物、动物）的利用、改造并为人类服务的技术。
第三代生物技术是海洋生物技术我国科学家承担了人类基因组计划1%的测序工作现代生物技术包括:⑴重组DNA技术⑵细胞和原生质体融合技术⑶酶和细胞的固定化技术⑷植物脱毒和快速繁殖技术⑸动物和植物细胞的大量培养技术⑹动物胚胎工程技术⑺现代微生物发酵技术⑻现代生物反应工程和分离工程技术⑼蛋白质工程技术⑽海洋生物技术现代生物技术的发展趋势主要体现在下列几个方面：①基因操作技术日新月异，不断完善。
②新技术、新方法一经产生便迅速地通过商业渠道出售专项技术，并在市场上加以应用。
③基因工程药物和疫苗的研究和开发突发猛进。
④新的生物治疗制剂的产业化前景十分光明，21世纪整个医药工业将面临全面的更新改造。
⑤转基因植物和动物取得重大突破⑥现代生物技术在农业上的广泛应用将给农业和畜牧业生产带来新的飞跃。
⑦阐明生物体基因组及其编码蛋白质的结构与功能是当今生命科学发展的一个主流方向，⑧基因治疗取得重大进展，有可能革新整个疾病的预防和治疗领域。
⑨蛋白质工程是基因工程的发展，它将分子生物学、结构生物学、计算机技术结合起来，形成一门高度综合的学科。
⑩信息技术的飞跃发展渗透到生命科学领域中，形成形成引人注目、用途广泛的生物信息学。
生物技术药物的特性是什么？生物技术药物的特征是：（1）分子结构复杂（2）具有种属差异特异性（3）治疗针对性强.疗效高（4）稳定性差（5）免疫原性（6）基因稳定性（7）体内半衰期短（8）受体效应（9）多效应和网络效应（10）检验特殊性生物技术发展的不同阶段的技术特征和代表产品（1）传统生物技术的技术特征是酿造技术，所得产品的结构较为简单，属于微生物的初级代谢产物。
生物技术制药重点(1)(1)
生物技术制药重点第一章绪论2.生物技术：又称生物工程，是指人们以现代生命科学为基础，结合先进的工程技术手段和其他基础学科的科学原理，按照预先的设计改造生物体或加工生物原料，为人类生产出所需产品或达到某种目的的技术。
3.生物技术药物：是指采用DNA重组技术或其他生物技术生产的用于预防、治疗和诊断疾病的药物，主要是重组蛋白或核酸类药物，如细胞因子、纤溶酶原激活剂等。
4.生物技术制药：是指利用基因工程、细胞工程、发酵工程、酶工程、蛋白质工程等生物技术的原理和方法，来研究、开发和生产用于预防、治疗和诊断疾病的药物的一门科学。
第二章基因工程制药1.基因工程：又称重组DNA技术，即在体外将DNA片段与载体连接，形成重组DNA在宿主细胞中复制、扩增和表达蛋白质所用的方法和技术。
2.基因工程制药：利用重组DNA技术将外源基因导入宿主菌或宿主细胞进行大规模培养和诱导表达以获得蛋白质药物的过程。
3.基因工程制药的基本流程：①目的基因的获得；②表达载体的选择；③目的基因与表达载体的连接；④重组DNA转入受体细胞；⑤重组子的筛选与鉴定；⑥工程菌株发酵表达重组蛋白；⑦重组蛋白产品的纯化；⑧重组蛋白制剂的生产。
4.限制性核酸切酶：主要指来自于细菌、能够识别DNA特定序列、并在识别位点或其周围切割双链DNA的—类切酶。
具有专一性。
5.DNA连接酶：可以催化DNA片段中两个相邻的3-0H和5'-磷酸基团(互相配对的两个粘性末端连接起来) 形成3'，5'-磷酸二酯键，从而使DNA片段或单链断裂形成的缺口连接起来。
6.获得目的基因的主要方法：①化学合成法：已知目的基因的核苷酸序列或其编码产物的氨基酸残基序列。
v 100个碱基。
小片段粘接法：12-15个碱基，退火形成双链；大片段酶促法：100个碱基以下，利用聚合酶和连接酶形成。
②PCR (已知目的基因的序列)根据生物体DNA复制原理在DNA聚合酶催化和dNTP参与下，弓I物依赖DNA模板特异性地扩增DNAPCF体外扩增常容易带入突变，为保证目的基因片段序列的正确性，一般建议使用高保真的DNA聚合酶和相对保守的PCRT增条件。
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生物技术制药 第一章 绪论 ★生物技术与生物技术药物的概念 生物技术药物的分类 按用途分类：治疗药物、预防药物、作为诊断药物(免疫诊断试剂、酶诊断试剂、器官功能诊断药物、放射性核素诊断药物、诊断用单克隆抗体(McAb)、诊断用DNA芯片)
按作用类型分类：细胞因子类药物、激素类药物、酶与辅酶类药物、疫苗、单克隆抗体药物、反义核酸药物、RNA干扰(RNAi)药物、基因治疗药物
按生化特性分类：多肽类药物、蛋白质类药物、核酸类药物、聚乙二醇(PEG)化多肽或蛋白质药物 ★生物技术药物的特性
理化性质特性：相对分子量大、结构复杂、稳定性差 药理学作用特性：活性与作用机制明确、作用针对性强、毒性低、体内半衰期短、有种属特异性、可产生免疫原性
生产制备特性：药物分子在原料中的含量低、原料液中长存在降解目标产物的杂质、制备工艺条件温和、分离纯化困难、产品易受有害物质污染
质量控制特性：质量标准内容的特殊性、制造项下的特殊规定、检定项下的特殊规定(原液、半成品及成品检定等等)
第二章 基因工程制药 蛋白类药物的特点：结构确证不完全性、具有种属特异性、多功能性、免疫原性
临床前安全性评价的特殊性：蛋白类药物安全性担忧的性质和来源；受试物的纯度；相关动物的选择；给药剂量的选择；免疫原性；遗传毒性和致癌性(一般不进行常规的遗传毒性实验)；药代动力学 真核细胞表达制品的安全性问题：生产细胞DNA残留的影响、生产用血清的影响
基因工程药物稳定性研究的相关问题：药物浓度、温度、湿度和水分、氧、光照、pH
基因工程药物的缺陷：生物利用度低，半衰期短；异体蛋白具有免疫原性
基因工程菌的修饰改造方法：构建突变体、构建融合蛋白、PEG修饰(降低免疫原性、增加水溶性、延长t1/2) 基因工程制药基本环节 上游阶段：制备目的基因→构建重组质粒→构建工程细胞 下游阶段：培养工程细胞→分离纯化产物→除菌→半成品、成品检定→包装 基本工具：目的基因、各种酶(切割酶、连接酶、修饰酶等)、载体、宿主细胞
➢ 酶切结果：5’粘性末端、3’粘性末端、平头末端 ➢ 1U核酸内切酶的酶活性：指在最佳反应条件下反应1小时，完全水解1mg标准DNA所需的酶量 ➢ 影响限制性内切酶反应的因素： DNA样品的纯度： DNA的甲基化程度：核酸限制性内切酶不能够切割甲基化的核苷酸序列。在基因克隆中要使用甲基化酶缺陷型细菌菌株制备质粒DNA。
酶切反应的温度 DNA的分子结构 反应缓冲液组成 反应时间、反应体积等 ➢ 工具酶 核酸限制性内切酶：识别、水解外源的双链DNA分子上特定的核苷酸序列。主要存在于原核微生物中。 • 同裂酶：指来源不同，识别序列相同的酶；进行同样的切割，产生相同的末端 • 同尾酶：来源不同，识别序列不同，但产生相同的粘性末端 DNA甲基化酶：具有宿主专一性，对宿主自身DNA上特定核苷酸进行甲基化修饰，避免被自身限制性内切酶水解 DNA连接酶 • T4噬菌体连接酶：连接双链DNA切口，或带粘性末端或平头末端的DNA片段 • 大肠杆菌DNA连接酶：连接双链DNA切口，或带粘性末端的DNA片，不能连接带平头末端的DNA片段
聚合酶：以DNA或RNA为模板，将核苷酸连续加至3’-OH末端，合成方向为5’→3’。DNA聚合酶、RNA聚合酶
• 大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ：5’→3’DNA聚合酶活性；5’→3’DNA外切酶活性；3’→5’DNA外切酶活性；RNA H酶活性
• Klenow酶：不具备5’→3’DNA外切酶活性 • T4噬菌体DNA聚合酶：不具备5’→3’DNA外切酶活性。外切酶活性比Klenow酶强200倍，对单链DNA作用强于双链DNA
• T7噬菌体DNA聚合酶：不具备5’→3’DNA外切酶活性 • Taq DNA聚合酶 • 反转录酶：催化以RNA或DNA为模板，合成DNA；具有RNA H酶的活性 • 末端脱氧核苷酸转移酶：催化dNTP沿5’→3’聚合，逐个加于线性DNA分子的3’末端；不需要模板 ➢ 载体：(vector)来源于质粒、噬菌体或病毒的DNA分子，可供插入或克隆目的基因或DNA，并具有运载外源DNA导入宿主细胞的能力。
质粒载体：共价闭合环状DNA(cccDNA)；开环DNA(ocDNA)；线状DNA(lDNA) • 质粒的三个重要性质：遗传传递的能力；遗传交换的能力；不相容性 • 用于克隆的质粒的三个要素：复制子、选择标记、多克隆位点 • 常用质粒载体：克隆载体、表达载体、突变载体、报告载体 λ噬菌体载体：插入型载体、置换载体 • 来源于噬菌体DNA，因可以插入较大DNA片段，常用于构建基因组文库和cDNA文库。 ➢ 目的基因的常用制备方法 化学合成法：前提：基因的DNA的序列已知。小于100bp的片段：直接合成，最常用固相亚磷酸三酯法。 大片段目的基因：小片段粘接法、大片段酶促法
PCR法：前提：已知待扩增目的基因或DNA片段两侧的序列，根据该序列化学合成聚合反应必需的双引物。
基因文库法：鸟枪法：适用于原核细菌目的基因的克隆分离 cDNA文库法(与mRNA互补的DNA)并非所有的mRNA分子都具有polyA结构；仅限于克隆蛋白质编码基因；mRNA含量少且t1/2短，对酶和碱极为敏感，分离纯化困难 第一链：mRNA模板，引物 (polyT) ，逆转录酶，dNTPs 第二链：自身引导法：取得的双链cDNA5’端会有几对碱基缺失(NaOH，煮沸；Klenow酶，dNTPs；S1内切酶) 引导合成法：获得的cDNA能保持完整的5’端序列(TdT, Dctp；NaOH；退火；Klenow酶，dNTPs) 基因文库的完备性：指在构建的基因文库中任一基因存在的概率，它与基因文库最低所含克隆数N之间的关系可用下式表示：N= ln(1–P) /ln(1–f)，P=完备性，f=克隆片段的平均大小/生物基因组的大小
双酶切产生的粘性末端，最常用，可以确保连接方向的正确性 影响连接效率的因素：连接方式；目的基因与载体的浓度比例摩尔数比大于1；连接温度、时间、酶的活性、反应缓冲体系
➢ 重组DNA导入宿主细胞 导入大肠杆菌：CaCl2法；转染法 导入酵母：电转化法；化学转化法；原生质转化法 导入链霉菌：原生质转化法；电穿孔法 重组DNA导入哺乳动物细胞：显微注射法；DEAE葡聚糖转染法；DNA-磷酸钙转染法；阳性脂质体介导法；电穿孔法；细胞融合法；病毒感染法 ➢ 重组子的筛选与鉴定 遗传标记筛选法：抗生素抗性筛选法；α互补筛选法(蓝白斑筛选——载体含有LacZα基因，X-gal培养基，成功导入的菌落显示为蓝斑)；营养缺陷型筛选法；噬菌斑筛选法
核酸分子杂交法：菌落原位杂交法；DNA印迹法；RNA印迹法 限制性内切酶图谱法：琼脂糖凝胶电泳鉴定各片段分子量，含有目的基因的为阳性克隆 DNA序列测定法 目的基因表达产物测定法 原核细胞表达的特点及选择
大肠杆菌(首选,遗传背景研究清楚；适合大规模生产(成本低，周期短，效率高，操作简单)、芽孢杆菌、链霉菌等
缺点：缺乏翻译后修饰系统；容易以包涵体形式存在；外源蛋白容易被宿主酶系统水解 ★ 外源基因表达的调控原件：复制子、启动子(表达效率的关键因素)和终止子、核糖体结合位点(即SD序列及SD序列到起始密码子AUG的距离)、识别翻译后修饰信号 用于原核表达的载体必须具备的条件：具有复制子、灵活的克隆位点和方便的选择标记、很强的启动子、阻遏子(一般有)、强的终止子，所产生的mRNA应具有翻译起始信号(起始密码子AUG以及SD序列) ★ 外源基因在大肠杆菌中的表达方式 胞内表达： 非融合蛋白表达：蛋白质接近天然状态，易被降解，易形成包涵体。有原核多肽基因 融合蛋白表达：表达效率高；产物稳定；可以切除原核多肽，获得天然外源蛋白 分泌表达：有信号肽基因，形成周质表达或细胞外表达 ★ 外源蛋白表达效率的影响因素
外源基因密码子：大肠杆菌具有偏好密码子和稀有密码子，外源基因应尽量设计成为大肠杆菌的偏好密码子
mRNA的结构：改变一级结构；降低5’端二级结构稳定性；调控3’端非翻译区二级结构 表达载体的选择：表达方式；强的复制子(拷贝数高)；强的启动子(转录效率高)；高效率的核糖体结合位点；强的终止子(提高mRNA稳定性)；适应范围广；稳定性高；产物易纯化。
外源蛋白的稳定性：采用融合蛋白形式表达；采用蛋白酶缺陷的突变菌株 真核细胞表达的特点及选择
➢ 常用的真核表达系统：酵母表达系统、昆虫细胞表达系统、哺乳动物细胞表达系统 大肠杆菌和酵母表达系统的比较
大肠杆菌 巴斯德毕赤酵母 载体 原核载体 穿梭载体 调控序列 原核 原核和真核 表达形式 包涵体、融合蛋白、分泌 分泌 翻译后修饰 基本无 有 生产方式 发酵，操作简单、经济 发酵，操作较简单、较经济 ★ 酵母表达体系的影响因素 外源基因的结构 外源基因5’端非翻译区的序列和长度影响mRNA的翻译效率 起始密码子两侧若容易形成RNA二级结构，将阻止翻译进行 富含A-T序列导致转录提前终止 密码子的偏好性 高度复杂的胱氨酸结构基序影响表达效率 表达形式及信号肽的选择：无信号肽常胞内表达；有信号肽，胞外分泌型表达 启动子：多数毕赤酵母采用乙醇氧化酶AOX1、AOX2启动子 转化子的拷贝数：拷贝数越高，表达水平也越高