标记免疫分析技术-1
化学发光免疫分析
糖尿病
Albumin C-peptide Insulin
唐氏筛查
PAPP-A free βHCG HCG＋β AFP
心肌标志
骨标志
肝纤维
CK-MB
ß-Crosslaps
LN
Digoxin
25-(OH) Vit. D
HA
Digitoxin
Intact PTH
PIIINP
Myoglobin
Intact PTH
试剂有效期长 有效期可长达1年以上，放射免疫分析由
于放射性同位素的衰变，一般有效期只有一 个月，而酶免的底物贮存性差，都无法与化 学发光相比，有效期长可以降低使用成本， 利于推广应用。
梦想——之以恒、真正为实现纳米科技事业的梦想而奋斗！
3 化学发光免疫分析的优越性
➢ 中国免疫诊断现状
中国
国际（欧美为主）
种类
方法
检测原理
酶联免疫
酶与样本反应，依据颜色变化程度确定结果
免疫 化学发光
诊断
将抗原抗体同样本结合，由磁珠捕捉反应物，加入 发光促进剂加大反应发光速度与强度，进而诊断
根据镧系元素螯合物发光特点，用时间分辨技术测 时间分辨荧光
量荧光，检测波长和时间两个参数进行信号分辨
分子 诊断
PCR 基因芯片
DNA高温变成单链，低温互补配对链合成
激发态ν
的中间体。这种激发态中间体，当其回到稳定的基态时，可同时发射出
光子。利用发光信号测量仪器即可测量光量子产额，该光量子产额与样
品中的待测物质的量成正比。由此可以建立标准曲线并计算样品中待测
能量
h.ν
物质的含量。
基态ν0 梦想——之以恒、真正为实现纳米科技事业的梦想而奋斗！
化学发光
化学发光
化学发光（chemiluminescence）是指伴随化学反 应过程所产生的光的发射现象。某些物质(发光剂) 在化学反应时，吸收了反应过程中所产生的化学能， 使反应的产物分子或反应的中间态分子中的电子跃 迁到激发态，当电子从激发态回复到基态时，以发
㈡ 碱性磷酸酶标记的化学发光免疫分析
该分析系统以碱性磷酸酶 标记抗体(或抗原)，
在与反应体系中的待测标本和固相载体发生
免疫反应后，形成固相包被抗体-待测抗原-酶
标记抗体复合物，这时加入AMPPD发光剂，
碱性磷酸酶使AMPPD脱去磷酸根基团而发光。
碱性磷酸酶标记化学发光免疫分析示意图
电化学发光免疫分析 电化学发光免疫分析
射光子的形式释放出能量，这一现象称为化学发光。
一些化学反应能释放足够 的能量把参加反应的物质激 发到能发射光的电子激发态， 若被激发的是一个反应产物 分子，则这种反应过程叫直 接化学发光。反应过程可简单地描述如下： A十B C* C* C ＋ h· γ 其中γ为光子，C*表示C处于单线激发态。
若激发能传递到另一个未参加化学反应 的分子D上，使D分子激发到电子激发态， D分子从激发态回到基态时发光，这种过 程叫间接化学发光。反应过程可表示如下： A十 B C* C *十 D C 十 D* D* D十 h· γ
思考题
1．什么是化学发光免疫分析？ 2．什么叫化学发光剂？ 3．酶促反应的发光剂有哪些？ 4．什么是化学发光酶免疫分析？ 5. 化学发光免疫分析和放免、酶免相比具 有哪些优势？
小 结
• 发光是指分子或原子中的电子吸收能量后，由 基态跃迁到激发态，然后再返回到基态，并释 放光子的过程。 • 化学发光是吸收了化学反应过程中所产生的化 学能使分子激发而发光。 • 化学发光免疫分析是将化学发光与免疫反应相 结合，用于检测微量抗原或抗体的标记免疫分 析技术，分为直接化学发光免疫分析，化学发 光酶免疫分析和电化学发光免疫分析。
时间分辨荧光免疫分析技术
王征
达瑞抗体
a
1
标记免疫学分析技术发展历程
免疫荧光分析(Coons, 1941) 放射免疫分析(Berson和Yalow, 1960) 酶免ELISA (Engvall, 1971) 金标免疫分析(Faulk和Taylor, 1971) 化学发光免疫分析(Arakawa， 1977) 时间分辨荧光免疫分析(Soini和Hemmila，1979) 电化学发光免疫分析(Leland, 1990) 液相芯片(美国Luminex公司, 1997)
孵育
+
铕标记抗原
+
Eu
a
14
中和法示意图(回滴定法)
孵育
+
+
中和抗原 待测抗体
孵育
+
Eu
铕标记抗体
+ 增强液
Eu
a
Eu
+ Eu
15
小分子抗原竞争抑制示意图
固相包被二抗 孵育
+
一抗
+
+
孵育
Eu
待测抗原
铕标抗原
Eu
+ 增强液
Eu
a
+ Eu
16
时间分辨技术重点和难点
固定相（96孔板） 标准品 铕标记物
肿瘤科检查 传染病检查 妇产科检查
糖尿病系列：insulin、C-Peptide
生长激素：hGH
其他：Cortisol
AFP、CEA、tPSA 、β2-MG 、hTG、 CA-242、CA-724 、 CA-50 、 fPSA 、 NSE 、 cyfra 211 、 CA-199、CA-125、 CA153
临床免疫学检验技术-01-第一章 概论
第三节 免疫学技术的发展与临床免疫检验
一、免疫学技术的发展历程
经典免疫学技术
• 免疫凝集试验 • 免疫沉淀试验 • 补体结合试验
现代免疫学技术
• 标记免疫学技 术（特异性及 敏感性提高）
自动化免疫学技术
• 自动化免疫分 析仪（反应进 行加快）
（一）经典免疫学技术
1. 免疫凝集试验 （1）直接凝集试验： 1）肥达试验 2）外斐试验 3）交叉配血凝集试验 （2）间接凝集试验： 1）间接血凝试验 2）胶乳凝集试验 3）自身红细胞凝集试验
总结
免疫器官
中枢免疫器官：骨髓、胸腺 外周免疫器官：淋巴结、脾脏、粘膜伴随淋巴组织
免
淋巴细胞：T细胞、B细胞、NK细胞
疫
系 统
免疫细胞
免疫辅助细胞：单核巨噬细胞、树突状细胞、中性粒细 胞、肥大细胞等
免疫分子
免疫球蛋白 补体系统 细胞因子 黏附分子 人类白细胞分化抗原
四、免疫与免疫应答
免疫（immunity）是机体识别和排斥抗原性异物的一 种生理功能。
重点提示
1、免疫系统组成及功能 2、免疫学检验技术的的发展
第一节 免疫学基础简介
免疫学（immunology）
免疫学是研究免疫系统的结构与功能，并通过对其在免 疫应答过程中所产生的免疫保护与免疫损伤机制的研究，探 讨有效的免疫措施，实现以防病、治病为目的的一门现代医 学学科
免疫系统（immune system）
1960
学者
贡献
J.Bordet
补体与溶菌活性
H.Durham，M.von Gruber
特异凝集反应
G.Widal，A．Sicad
肥达试验
R.Kraus
免疫分析法
人改型抗体（reshaped humanized antibody）；
小分子抗体； 双特异性抗体（bispecific antibody）等。
在体内发生的抗原抗体反应为体液免疫应答的效
应作用。体外的抗原抗体结合反应主要用于抗原
或抗体的检测，用于免疫学诊断。
在药物分析中，免疫分析法的 应用主要集中在以下几方面：
(1) 在实验药物动力学和临床药物学中，测定生物利用度 和药物代谢动力学参数等生物药剂学中的重要数据，以 便了解药物在体内的吸收、分解、代谢和排泄情况； (2) 在药物的临床检测中，对治疗指数小、超过安全剂量 易发生严重不良反应或最佳治疗浓度和毒性反应浓度有 交叉的药物血液浓度进行监测； (3) 在药物生产中，从发酵液或细胞培养液中快速测定有 效组分的含量，以实现对生产过程的在线监测； (4) 对药品中是否存在特定的微量有害杂质进行评价。
热力学分析： 半抗原和载体蛋白结合后热力
学特征会有变化，差异可通过差示扫描量热法 （DCS）等方法测定。
定量测定方法 相对含量测定法： 通过 ELISA 法比较半抗原
与载体蛋白的相对结合量。
绝对含量测定法： 半抗原具有与载体蛋白完
全不同的广谱吸收特征，且半抗原在此特定波 长下具有较强的吸收；或能利用特定的化学反 应定量测定半抗原的量，且不与载体蛋白发生 反应。
主要内容
一、概述
二、抗原
三、抗体与免疫反应
四、免疫分析方法及应用
五、免疫扩散法
免疫分析实际上是一种特殊的试剂分析， 特点是抗体/抗原成为分析试剂。
1、抗体的结构与功能
抗体泛指机体经抗原刺激由免疫活性细胞 产生的一组免疫球蛋白，通常由两条相同 的重链和两条相同的轻链组成 常用的是IgG分子，其在血清免疫球蛋白 中的含量约70%
几种胶体金技术详解
胶体金免疫分析技术详解随着免疫分析日益广泛应用于以临床为主以及非临床领域的诊断工业，免疫分析正在向两个方向发展:一类为全自动化的免疫分析;另一类为以硝酸纤维膜为载体的快速免疫分析。
前者需要价格昂贵的全自动仪器及与仪器严格配套的各种试剂盒，目前只能在医疗及检测中心应用,虽也能较快速给出结果，但仍需一定时间，不适合远离医疗及检测中心的地区，更不能用于“患者床旁检验”和普查的需要，在酶免疫分析的基础上，主要以硝酸纤维素膜为载体的快速诊断方法迅速和广泛地发展起来.这类方法目前在文献及市场上的命名还很不统一.它实际上属于快速斑点免疫结合分析，主要有以下两种方法：斑点免疫渗滤分析DIFA和斑点免疫层析分析DICA.本篇主要介绍以金作为标志物的胶体金免疫分析技术。
金标记免疫分析技术也称免疫胶体金技术,是于1971年建立的一种信号显示技术.此技术最初用于免疫电镜检查,由胶体金颗粒标记抗原或抗体，与组织或细胞中相应的抗体或抗原相结合，在电子显微镜的检查时可起特异的示踪作用。
此后，此技术与银染技术相结合建立的免疫金银染色法，使抗原抗体特异反应信号可在光学显微镜下观察。
近10多年来，利用硝酸纤维素膜（NC）等为固相载体，以胶体金标记的抗原或抗体与特异配体的反应在膜上进行，建立了快速的金标记免疫渗滤技术和金标记免疫层析技术，并在传染病、心血管病、风湿病、自身免疫病的免疫学检测中广泛应用.胶体金是指金微小粒子（0—100nm)分散在另一种物质中所形成的体系，通常指金以微小粒子分散在溶液中所形成的金溶胶,用此金溶胶标记蛋白质（抗原、抗体或SPA、SPG），胶体金颗粒具有高电子密度的特性，故在金标蛋白的抗原抗体结合处,显微镜下可见黑褐色颗粒；当这些标记物在相应的标记处大量聚集时,可在载体膜上呈现红色或粉红色斑点，从而用于抗原或抗体物质的半定量或定性。
与ELISA不同之处便是反应时间大大缩短，仅需要数分钟就完成了ELISA需数小时才能显示的结果。
南开大学免疫学讲义-第十四章 免疫标记技术
免疫标记技术免疫标记技术指用荧光素、放射性同位素、酶、铁蛋白、胶体金及化学(或生物)发光剂等作为追踪物，标记抗体或抗原进行的抗原抗体反应；并藉助于荧光显微镜，射线测量仪，酶标检测仪，电子显微镜和发光免疫测定仪等精密仪器，对实验结果直接镜检观察或进行自动化测定，可以在细胞、亚细胞、超微结构及分子水平上，对抗原抗体反应进行定性和定位研究；或应用各种液相和固相免疫分析方法，对体液中的半抗原、抗原或抗体进行定性和定量测定。
因此，免疫标记技术在敏感性、特异性、精确性及应用范围等方面远远超过一般免疫血清学方法。
根据试验中所用标记物的种类和检测方法不同，免疫标记技术分为免疫荧光技术，放射免疫技术，免疫酶技术，免疫电镜技术，免疫胶体金技术和发光免疫测定。
近年来，随着分子生物学、细胞生物学、基础免疫学和免疫化学等学科的进展以及应用现代高新技术建立的仪器分析日趋发展，免疫标记技术也不断完善和更新。
各种新技术和新方法不断涌现，至今已发展成为一类检测微量和超微量生物活性物质的免疫生物化学分析技术。
在医学和其他生物学科的所究领域及临床检验上作中应用十分广泛。
第一节免疫荧光技术免疫荧光分析(Immunofluorescence assay，IFA)始创于40年代韧，1942年Coons等曾次报道用异氰酸荧光素标记抗体．检查小鼠组织切片中的可溶件肺炎球菌多糖抗原，当时内于此种荧光素标记物的性能较差，未能推广使用。
直至50年代末期，Riggs等(1958)合成性能较为优良的异硫氰酸荧光黄。
Mashall等(1958)对荧光抗体的标记方法又进行改进，从而使免疫荧光技术逐渐推广应用。
一、基本原理免疫荧光技术是将抗原抗体反应的特异性和敏感性与显微示踪的精确性相结合。
以荧光素作为标记物，与已知的抗体(或抗原)结合、但不影响其免疫学特性。
然后将荧光素标记的抗体作为标准试剂，用于检测和鉴定未知的抗原。
在荧光显微镜下，可以直接观察呈现特异荧光的抗原抗体复合物及其存在部位。
标记免疫分析实验方法学进展
１ ｇ ｍＬ ， ０ ／ ） 该技术 利用抗 体 （ ） 为结 合剂 ， Ａｂ 作 使反 应特异 性大 幅度地 提高 ， 在临床疾 病 诊断 和科
～
Ｒ ｃ ｅ 司 的 Ｃ ＡＳ Ｃ Ｅ 为 代 表 的 “ 式 酶 ｏｈ 公 ＯＢ ＯＲ 管
２ 酶 免 疫 分 析
分 析仪 以聚苯 乙烯 塑料珠 为 固相 载体 ， ＡＰ为标 以
记 物 ， ＡＭＰ Ｄ［ － ２’ 旋 金 钢 烷 ）４ 甲 氧 基 以 Ｐ ３（ 。 螺 一一
（” 酰 氧基 ） 基一 ， ３磷 苯 １ ２二 氧 乙 烷］ 发 光底 物 ， 为 其 测定灵 敏度 已能 达 到 １ ｇ 使 超 精 ＴＳ 等项 目 ０ ， Ｈ （ 灵敏 度为 ０ ０ ２ ｌ ｍＬ 得 以实现 。 ． ０ ｕ Ｕ／ ）
多种方法 、 多种 标 记 物用 在 同一 测 定 中 ， 如 酶 标 记 例
光底 物后 ， 为酶 免疫荧 光 分析 （ Ｉ Ａ） 由于荧 光 成 ＥＦ ， 的强 度可 大于激 发 光 １ ０倍 之 多 ， 可 有效 地 提 高 故 检测灵 敏度 ， 由于荧 光测量 的范 围 比吸收 光测 量 又 范 围宽 ， 即线 性范 围加 大 （ 高一个 数量 级 ） 提 。如 美
电子 计算机 等 的发 展 ， 酶 、 光 、 以 荧 发光 、 金 属 离 重 子和稀 土元 素替 代 放射 性 核 素 的非 放 射性 标 记 技 术 层 出不穷 ， 括 Ｒ Ａ一 起统 称 为标 记 免疫 分 析 。 包 Ｉ 随着方法 学 和设 备 的改进 ， 射性 计数 正被 光 的吸 放
美 国学者 Ｙａｏ 和 Ｂ ｒｏ ｌｗ ｅｓｎ于 １ ６ ９ ０年建 立 的 ＲＩ 使 医学 生 物学 检 测 进 入 了超 微 量 分 析 （０ Ａ， １
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标记免疫分析技术-1
一、标记分析技术概述
1959年，美国学者Yalow和Berson建立了放射免疫分析技术，这种技术
以免疫反应的特异性，和放射性同位素标记的灵敏性显示了其在微量
检测方面的优势，吸引着各国的生物医学工作者。
标记免疫分析技术
进入了一个崭新的时期。
从而使免疫分析，从定性分析和半定量分析
走向了定量分析。
医学检测技术也从常量分析走向微量与超微量分析。
标记免疫分析技术的优势主要表现在两个方面：1、高灵敏度：不是直
接测定待测物而是探测待测物上的标记信号，利用标记物的放大效应，提高了信噪比，降低了待测物的可测下限。
2、高特异性：以抗原、抗
体作试剂替代了传统的无机或有机试剂，使检测特异性大大提高。
作为经典的标记免疫分析技术——放射免疫分析技术的缺点是：1、试
剂稳定性欠佳，同位素的衰变影响结果。
2、放射性污染问题。
3、测
定方法难以全自动化。
为了克服放射免疫分析技术的缺点，研制放射性同位素以外的标记物——拓宽体外微量分析技术，成了热门的课题。
此后酶、化学发光、
生物发光、荧光标记等新标记不断涌现，相应的标记免疫分析技术相
继问世。
标记分析技术的历史沿革:
1923年 Hevesy：放射性核素示综法。
1959 年 Yalow 和 Berson：放射免疫分析技术。
（Radioimmunoassa y， RIA）
1986 年?Miles 和 Hales：免疫放射分析技术。
（immunoradiometricassay IRMA）
60年代酶标记示踪检测技术（EIA，ELISA）
70年代 Halmann 和 Velan：化学发光免疫分析（Chemiluminescence Immunoassay，CLIA）
1978年 Halman 和 Barach：化学发光酶免疫标记技术
1979年 Guesdon:生物素－亲合素标记技术。
1979年 Soini 和 Hemmia：时间分辨荧光分析技术。
二、以酶作标记的免疫检测技术
根据抗原或抗体的附着不同，可分为1、“板式酶标”——抗体与微孔板连接，应用得最普遍。
2、“管式酶标”——抗体与试管连接，国内应用不多。
3、“微粒子捕获法”——抗体与微粒连接
各种酶标的特点：
1、板式酶标：孔间均一性欠佳，显色体积太小，比色光径不足，重复性不够理想，精度难以达到ng以下，量程难以达到3个数量级。
2、管式酶标：增加了比色光径与显色体积，部分弥补了“板式酶标”之不足。
如：美国ABBOTT公司的Commarder；德国BM公司的ES300；瑞士Serono公司的SR-1。
n ES -300采用链亲和素包被管和生物素化抗体，以增加抗体结合量、增加放大效果。
n ES-300 采用了ABTS， SR-1采用了磷酸酚酞作显色剂，大大提高了显色稳定性。
n SR-1 采用异硫氰基荧光素（FTTC）连接第一抗体和通用的抗FTTC磁化颗粒作B/F分离。
3、微粒子捕获法：微粒子的表面与抗体连接反应面积增加，检测的量程增加。
根据底物不同可分为：1、酶免疫显色；2、酶免疫荧光；3、酶免疫发光。
1、酶免疫显色：底物成色反应后，底物颜色在可见光范围内。
常用
的底物有邻苯二胺、甲基联苯胺等。
2、酶免疫荧光：酶反应的底物改为荧光底物。
（EIFA）
磷酸4-甲基伞型酮
↓
碱性磷酸酶
↓
发荧光的甲基伞型酮
（ABBOTT公司）
3、酶免疫发光：酶免疫反应的底物为发光底物
（EILA）
磷酸金刚烷
↓
碱性磷酸酶
↓
金刚烷
（不稳定，分解时发射光子）
（DPC公司）
三、荧光免疫分析：直接用荧光物质标记抗体或抗原
荧光物质有：
F 异硫氰基荧光素（FTTC）
F 四乙基罗丹明（RB 200）
F 四甲基罗丹明（RB 200）
F 稀土元素（铕(Eu)、铽(Tb)、钐(Sm)和镝(Dy)）
美国ABBOTT公司生产的药物血浓度检测仪TDX，即利用荧光标记药物和
样品中药物与抗体的竞争结合来进行测定，当药物分子与抗体结合后，其在偏振光激发下产生偏振，而游离的标记物失去偏振。
镧系元素标记的时间分辨荧光检测技术（TRFIA或DELFIA），以具有双
功能基因的镧系元素螯合物作示踪剂，标记抗原或抗体，当解离下来
的镧系元素与特制的扩增液形成新的螯合物时，其荧光明显增强而持久。
用延迟测量的办法可消除样品自身的早期背景荧光而大大提高检
测灵敏度。