邓恩桉的组织培养

第４７卷第５期　２　０　１　１年５月　林　业　科　学　

ＳＣＩＥＮＴＩＡ　Ｓ１ＬＶＡＥ　ＳＩＮＩＣＡＥ　Ｖｏ１．４７．Ｎｏ．５　

Ｍａｙ，２　０　１　１　

邓恩枝的组织培养　燕丽萍　夏　阳　毛秀红　刘翠兰　王太明　李　丽　李双云　（山东省林业科学研究院济南２５００１４）　关键词：邓恩桉：组织培养；微繁殖　中图分类号：￥７２３．１　３；Ｑ９４３．１　文献标识码：Ａ　文章编号：ｌＯＯｔ一７４８８（２０１１）０５—０ｌ５７—０５　

Ｔｉｓｓｕｅ　Ｃｕｌｔｕｒｅ　ｏｆ　Ｅｕｃａｌｙｐｔｕｓ　ｄｕｎｎｉｉ　Ｍａｏ　Ｘｉｕｈｏｎｇ　Ｌｉｕ　Ｃｕｉｌａｎ　Ｗａｎｇ　Ｔａｉｍｉｎｇ　Ｌｉ　Ｌｉ　Ｌｉ　Ｓｈｕａｎｇｙｕｎ　（Ｓｈａｎｄｏｎｇ　Ａｃａｄｅｍｙ　ｏｆ　Ｆｏｒｅｓｔｒｙ　Ｊｉｎａｎ　２５００１４）　

Ａｂｓｔｒａｃｔ：　Ｉｔ　ｉｓ　ｖｅｒｙ　ｄｉｆｆｉｃｕｌｔ　ｆｏｒ　Ｅｕｃａｌｙｐｔｕｓ　ｄｕｎｎｉｉ　ｔｏ　ｐｒｏｄｕｃｅ　ｒｏｏｔｓ　ｉｎ　ｖｉｔｒｏ．Ｉｎ　ｏｒｄｅｒ　ｔｏ　ｒｅｓｏｌｖｅ　ｔｈｉｓ　ｐｒｏｂｌｅｍ，ｐｒｏｄｕｃｅ　Ｅ．　ｄｕｎｎｉｉ　ｓｅｅｄｌｉｎｇｓ，ａｎｄ　ｃｏｎｄｕｃｔ　ｇｅｎｅ　ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，ａｎ　ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ　ａｎｄ　ｒａｐｉｄ　ｍｉｃｒｏｐｒｏｐａｇａｔｉｏｎ　ｓｙｓｔｅｍ　ｂｙ　ｕｓｉｎｇ　ｓｅｅｄｓ　ａｓ　ｅｘｐｌａｎｔｓ　ｗａｓ　ｅｓｔａｂｌｉｓｈｅｄ　ｆｏｒ　Ｅ．ｄｕｎｎｉｉ．Ｔｈｅ　ｏｐｔｉｍｕｍ　ｍｅｄｉｕｍ　ｆｏｒ　Ｅ．ｄｕｎｎｉｉ　ｗａｓ　ｏｂｔａｉｎｅｄ　ｂｙ　ｍｏｄｉｆｙｉｎｇ　Ｍｅｃｏｗｎ　ａｎｄ　Ｌｌｏｙｄ　ｍｅｄｉｕｍ　（ＷＰＭ），ｔｈａｔ　ｉｓ：ｗｉｔｈ　ＷＰＭ　ｌａｒｇｅ　ｅｌｅｍｅｎｔｓ，ｐｌｕｓ　Ｍｕｒａｓｈｉｇｅ　ａｎｄ　Ｓｋｏｏｇ（ＭＳ）ｔｒａｃｅ　ｅｌｅｍｅｎｔｓ，ＭＳ　Ｆｅ　ｓａｌｔ，Ｓｋｉｒｖｉｎ　ａｎｄ　Ｃｈｕ（ＳＣ）ｏｒｇａｎｉｃ　ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ　ａｎｄ　３０　ｇ・Ｌ　ｇｌｕｃｏｓｅ．Ｔｈｉｓ　ｍｏｄｉｆｉｅｄ　ｍｅｄｉｕｍ　ｗａｓ　ｕｓｅｄ　ｔｏ　ｒｅｓｏｌｖｅ　ｔｈｅ　ｓｅｒｉｏｕｓ　ｐｒｏｂｌｅｍｓ，　ｓｕｃｈ　ａｓ　ｓｅｅｄｌｉｎｇ　ｂｒｏｗｎ　ａｎｄ　ｓｈｏｏｔ　ｔｉｐ　ｄｅａｔｈ，ｉｎ　Ｅ．ｄｕｎｎｉｉ　ｔｉｓｓｕｅ　ｃｕｈｕｒｅ．Ａ　ｍｏｄｉｆｉｅｄ　ＷＰＭ　ｍｅｄｉｕｍ　ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔｅｄ　ｗｉｔｈ　０．５　ｍｇ・Ｌ一　６－ｂｅｎｚｙｌａｍｉｎｏｐｕｒｉｎｅ．０．５　ｍｇ・Ｌ一‘ｋｉｎｅｔｉｎ．０．２　ｍｇ・Ｌ一　ｎａｐｔｈａｌｅｎｅａｃｅｔｉｃ　ａｃｉｄ　ａｎｄ　３０　ｇ・Ｌ一　ｇｌｕｃｏｓｅ　ｗａｓ　ｓｕｉｔａｂｌｅ　ｆｏｒ　ｓｈｏｏｔ　ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ　ｆｒｏｍ　ｄｉｖｉｄｅｄ　ｂｕｄｓ，ａｎｄ　ｔｈｅ　ｓｈｏｏｔ　ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ　ｒａｔｅ　ｏｆ　ｐｌａｎｔｌｅｔｓ　ｉｎｃｒｅａｓｅｄ　ｂｙ　１　８．４３　ｆｏｌｄ．Ｔｈｅ　ｏｐｔｉｍｕｍ　ｇｒｏｗｉｎｇ　ｍｅｄｉｕｍ　ｗａｓ　ｏｂｔａｉｎｅｄ　ｂｙ　ｍｏｄｉｆｙｉｎｇ　ＷＰＭ　ｍｅｄｉｕｍ　ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔｅｄ　ｗｉｔｈ　０．５　ｍｇ‘Ｌ　ＫＴ，０．２　ｍｇ・Ｌ　ＴＤＺ　ａｎｄ　０．０１　ｍｇ・Ｌ一　ＮＡＡ．Ｏｖｅｒ　８４．３％ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ　ｐｌａｎｔｌｅｔｓ　ｗｅｒｅ　ａｂｌｅ　ｔｏ　ｒｏｏｔ　ａｆｔｅｒ　ｔｒａｎｓｆｅｒｒｅｄ　ｔｏ　ｔｈｅ　ｍｏｄｉｆｉｅｄ　ｈａｌｆ—ｓｔｒｅｎｇｔｈ　ＭＳ　ｍｅｄｉｕｍ　ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔｅｄ　ｗｉｔｈ　３．０　ｍｇ・Ｌ　ｉｎｄｏｌｅ一３一ｂｕｔｙｒｉｃ　ａｃｉｄ．０．０１　ｍｇ・Ｌ一　ｎａｐｔｈａｌｅｎｅａｃｅｔｉｃ　ａｃｉｄ．０．０５　ｍｇ・Ｌ—ｋｉｎｅｔｉｎ　ａｎｄ　２０　ｇ・Ｌ　ｓｕｃｒｏｓｅ．Ｗｈｅｎ　ｔｈｅ　ｍｉｃｒｏｐｒｏｐａｇａｔｅｄ　ｐｌａｎｔｌｅｔｓ　ｗｉｔｈ　ｗｅｌｌ—ｄｅｖｅｌｏｐｅｄ　ｒｏｏｔ　ｓｙｓｔｅｍｓ　ｗｅｒｅ　ｔｒａｎｓｆｅｒｒｅｄ　ｔｏ　ｐｌａｎｔｉｎｇ　ｂｅｄ　ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ　ａ　ｍｉｘｔｕｒｅ　ｏｆ　ｓａｎｄ，ｓｏｉｌ　ａｎｄ　ｍｅｄｉｕｍ（４：１：１；　）ｉｎ　ａ　ｇｒｅｅｎｈｏｕｓｅ，９３．８％ｏｆ　ｔｈｅ　ｐｌａｎｔｌｅｔｓ　ｓｕｒｖｉｖｅｄ．　Ｋｅｙ　ｗｏｒｄｓ：　Ｅｕｃａｌｙｐｔｕｓ　ｄｕｎｎｉｉ；ｔｉｓｓｕｅ　ｃｕｌｔｕｒｅ；ｍｉｃｒ０ｐｒ０ｐａｇａｔｉ０ｎ　

为了满足人们对木材与木质纤维的需求，桉树　已成为南方工业原料林的主要造林树种，并不断北　移扩大栽植。因大多数桉树不耐寒，限制了许多速　生桉树的北移栽植。邓恩桉（Ｅｕｃａｌｙｐｔｕｓ　ｄｕｎｎｉｉ）原　产澳大利亚，抗寒，速生，树干通直，木质粗细均匀，　耐干旱，抗病性强，用途广泛，可作刨花板材、纸浆　材、木片材等，已成为推广扩大桉树人工林种植范围　的首选树种，抗寒性是选择该树种向北引种的重要　因子。但从目前市场形势看，国内大面积种植邓恩　桉还有很多问题尚待解决。由于邓恩桉在澳大利亚　分布有限，产种量少，而国内邓恩桉难以开花结实，　不能生产种子，种子价格昂贵，纯度较高的种子平均　售价高达７万元・ｋｇ～，且遗传性状不稳定，严重制　约了该树种的发展。因此，进行邓恩桉组培快速繁　殖对开发和利用桉树资源具有重要的意义。　Ｃｏｒｔｅｚｚｉ　Ｇｒａｑａ等（１９８９）首先用茎段诱导获得　邓恩桉组培再生植株。Ｔｅｒｍｉｇｎｏｎｉ等（１９９６）以３日　生种苗为材料诱导了体细胞胚胎的发生，陈研华等　（２００４）、易敏等（２００５）、马英等（２００６）、易霭琴等　（２００７）、王以红等（２００５；２００８）、宋建英（２００８）主要　采用下胚轴、萌芽条的茎段、半木质化的带芽茎段、　种子实生苗的带芽茎段和种子等为外植体，通过不　同基本培养基、不同激素组合、谷氨酸、抗氧化剂以　及不同的光源和光强对邓恩桉组培试管苗不定芽的　分化和增殖进行研究，芽的增殖系数较低，为２～４。　欧阳磊（２００６）和林彦等（２００７）研究了生长素　（ＡＢＴ，ＩＢＡ，ＮＡＡ）、活性炭、大量元素、微量元素、有　机物、蔗糖、温度及光照等对组培苗生根的影响，结　

收稿１３期：２０１０—０３—３０；修回日期：２０１０—０５—１０。　基金项目：山东省农业良种工程项目（２００６１ｚｌ２－０２）；国家科技部成果转化项目（２００６ＧＢ２Ｃ６００１６７）。　夏阳为通讯作者。　ｌ５８　林业科学　果表明不同无性系之间的生根率差别非常大，大部　分株系生根率很低，约为２０％。彭信海等（２００２）申　请了“邓恩桉组培育苗方法”的专利，试管苗的繁殖　系数仅为３，生根率未见报道。虽然近几年关于邓　恩桉已做了不少的研究，无论组织培养还是扦插育　苗，至今还未能应用于生产实践，培育无性系苗一直　是该树种生产上的一大难题。尤其是邓恩桉生根极　为困难，已成为目前国内外组培中的难点。本文对　邓恩桉的增殖培养、壮苗培养和生根进行了研究，通　过三步诱导，探索出了一套邓恩桉的离体快速繁殖　体系，解决了培养中遇到的顶端死亡等问题，为邓恩　桉无性快繁工厂化育苗提供了有力的理论与实践基　础，同时为下一步的转基因育种工作提供重要的　试材。　１材料与方法　１．１　试验材料　由中国林业科学研究院提供的邓　恩桉种子。　１．２试验方法　１）无菌材料培养　选无病害饱满　邓恩桉种子，放人经过灭菌处理的１．５　ｍＬ离心管　中，７Ｏ％乙醇处理３０　Ｓ，再用０．１％ＨｇＣ１，处理３　ｍｉｎ，用无菌水漂洗４次。将灭菌后的种子转人无菌　培养皿中，用元菌滤纸吸干多余水分后，将种子放于　ＭＳ培养基上，每瓶５粒，１２瓶，共６Ｏ粒种子，置于　（２３±２）ｃＩ二培养室内黑暗培养。　２）芽增殖和壮苗试验　以改良ＷＰＭ为基本培　养基，添加３０　ｇ・Ｌ　的葡萄糖和５　ｇ・Ｌ。。的琼脂，ｐＨ　值５．６（下同）。进行３因素３水平设计Ｌ　（３　）正交　试验，共９个处理，每一处理接人５个不定芽，重复６　次。２５天左右统计增殖系数、平均苗高等生长情况，　筛选最适继代培养基及激素配比。培养条件（下同）　为：温度（２５±２）ｏＣ，光照强度２　０００～３　０００　１ｘ，光照　时间１２～１４　ｈ・ｄ～，培养室空气相对湿度７０％左右。　３）生根培养　将壮苗培养中生长一致、株高　３～４　ｃｍ的苗接种于改良１／２　ＭＳ和１／２　ＭＳ各种培　养基上，每一处理１５瓶，每瓶４株，２０天后统计生　根情况。　４）炼苗与移栽试管苗生根后，将生根苗的瓶　盖逐渐打开，在驯化培养室内过渡培养，取出小苗，　洗净根部培养基，将生根的试管苗移植于用０．１５％　多菌灵预处理的不同混合基质中，保湿培养，移栽于　大田，２５天后调查成活率。　２结果与分析　２．１　增殖培养　１）邓恩桉增殖基本培养基的筛　选从表１可以看出，增殖培养过程中，培养基大量　元素的种类直接影响试管苗发芽的数量以及质量，　最佳的增殖培养基是改良ＷＰＭ，其试管苗生长良　好，粗壮，不定芽褐化明显减轻，增殖系数达到１３倍　以上。而ＭＳ则是生长情况最差的培养基，不仅整　个试管苗的增殖系数较低，并且试管苗伴随着一定　的玻璃化，不定芽褐化较重。　

表１邓恩桉在不同基本培养基上生长差异　Ｔａｂ．１　Ｇｒｏｗｔｈ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ　ｏｆ　Ｅｕｃａｌｙｐｔｕｓ　ｄｕｎｎｆｆ　ｏｎ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ　ｐｒｉｍａｒｙ　ｍｅｄｉａ　培养基　平均芽体长度　平均每个外植体出芽数　Ｍｅｄｉｕｍ　Ａｖｅｒａｇｅ　ｂｕｄ　ｌｅｎｇｔｈ／ｃｍ　Ａｖｅｒａｇｅ　ｂｕｄ　ｎｕｍｂｅｒ　ｐｅｒ　ｅｘｐｌａｎｔ　

①同列内不同字母表示邓肯氏新复极差法检验在Ｐ≤０．５水平　上差异显著。下同。Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ　ｌｅｔｔｅｒｓ　ｗｉｔｈｉｎ　ａ　ｃｏｌｕｍｎ　ｉｎｄｉｃａｔｅ　ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ　ａｔ　Ｐ≤０．５　ｂｙ　Ｄｕｎｃａｎ’ｓ　ｍｕｌｔｉｐｌｅ　ｒａｎｇｅ　ｔｅｓｔｓ．Ｔｈｅ　ｓａｍｅ　ｂｅｌｏｗ．　

２）碳源对邓恩桉茎顶端死亡的影响　在３种　碳源的对比试验中，在葡萄糖作为碳源的培养基上，　顶端死亡的现象得到了很好的控制，９７．８％植株生　长良好。而使用蔗糖以及果糖的培养基试管苗则出　现明显的顶端死亡现象，死亡率达到２０％以上，二　者无显著差异。因此在下一步的试验中碳源使用葡　萄糖作为邓恩桉离体培养的碳源。　综上所述，邓恩桉最佳的增殖生长的基本培养　基为改良ＷＰＭ培养基，即ＷＰＭ大量元素＋ＭＳ微　量元素＋ＭＳ铁盐＋ＳＣ有机成分＋３０　ｇ・Ｌ　葡萄　糖。该培养基解决了组培苗褐化、顶端死亡等组培　中比较严重的问题。　３）不同生长调节剂对芽增殖的影响　将获得　的无菌实生苗接种到芽增殖培养基上，培养７天后，　每组芽都有所增殖，并且多组茎段基部切口处出现　少量绿色砂砾状或小米粒状愈伤组织。当培养到第　１５天时，芽增殖率最高与芽质量最优的分别是第４，　５，６组，愈伤组织变化不大。由表２可以看出３因　素极差的大小，对芽增殖率高低产生的效应由主到　次的因素顺序依次是６－ＢＡ，ＫＴ，ＩＢＡ，对其进行方差　分析，得出６－ＢＡ表现差异显著，ＫＴ与ＩＢＡ均不显　著，说明６－ＢＡ浓度的变化会引起芽增殖率的显著　变化，而ＫＴ与ＩＢＡ浓度的变化不会引起芽增殖率　的显著变化。极差分析表明３个因素的最佳水平组　合为６－ＢＡ　ＫＴ：ＩＢＡ　，刚好是试验的第５组合改良　ＷＰＭ＋０．５　ｍｇ・Ｌ一　６．ＢＡ＋０．５　ｍｇ・Ｌ一　ＫＴ＋　０．５　ｍｇ・Ｌ～ＩＢＡ＋３０　ｇ・Ｌ　葡萄糖＋５　ｍｇ・Ｌ　琼