第三章毛细管电泳法讲述介绍
毛细管电泳法
Capillary Electrophoresis, CE
毛细管电泳是带电粒子在 电场力的驱动下，在毛细 管中按其淌度或和分配系 数不同进行高效、快速分 离的电泳新技术，也称为 高效毛细管电泳。
20世纪30－40年代 蒂塞利乌斯 (A.W.K.Tiselius） 建立了移动界面电泳，将电泳发 展成分离技术 获得1948年诺贝尔化学奖
实验中，只发生电泳时有效淌度
μef =υef ﹒ (L /V) =( l / tm )﹒(L /V)
毛细管有效长度
迁移时间 毛毛细管细电泳管法 总长度
电压
2 电泳和电渗
电渗
与固液界面的双电层有着密切的关系
在毛细管壁双电层的扩散层中的阳离子，相对于毛 细管壁的负电荷表面，形成一个圆筒形的阳离子鞘， 在电场作用下，溶剂化了的阳离子，沿滑动面与紧 密层作相对运动，携带着溶剂一起向阴极迁移，便 形成了电渗流（electroosmotic flow , EOF）。
1981年 J.W.Jorgenson,K.D.Lukacs实验上和理论 上为毛细管电泳的发展奠定了基础。 上一世纪后二十多年分析化学领域中发展最迅速的分离 分析方法。
主要内容
毛细管电泳的原理 分离模式 进样与检测 毛细管电泳的应用
一 毛细管电泳的原理
1 装置
电极 缓冲液
毛细管
数据处理
毛细管电泳法
2 电泳和电渗
µeo正比于Zeta电势和介质的 介电常数
改变电渗流的方法
反比于介质的黏度
Zeta电势正比于双电层厚度 和界面有效电荷密度
1. 改变外加径向电场
反比于介质的介电常数
2. 改变缓冲液成分和浓度
Zeta电势
3. 改变缓冲液pH 4. 加入添加剂
毛细管电泳-毛细管
毛细管活化：1.甲醇5min 洗去毛细管在制作过程中的矿物油和酯类；
2.水2min 冲去甲醇；
3.0.1MNaOH 15~30min 平滑毛细管内表面，活化硅羟基；
4.水10min 冲去NaOH；
5.缓冲液10min 平衡毛细管。
毛细管活化可以用专门冲洗毛细管的装置，也可以在毛细管电泳仪上设置冲洗程序活化。
毛细管涂层：可以使用真空泵涂层，也可以使用毛细管冲洗装置，或者在仪器上设置冲洗程序涂层。
使用冲洗装置涂层效果较好。
毛细管灌胶：毛细管凝胶电泳中需要给毛细管灌胶。
琼脂糖或者聚丙烯酰胺胶。
琼脂糖比较容易灌且不易产生气泡，注意灌胶时要一次搞定，最忌灌入又吸出，这样容易产生气泡。
聚丙烯酰胺比较难灌，分线性和交联。
线性即制胶时不加入Acr-Bis，而是Acr溶液。
毛细管凝胶电泳，一般用线性的，因为当它的交联度大时，虽然孔径变小、机械强度变大、但是其聚合时体积缩小严重，所以降低交联度甚至不加入Bis，使交联度为0.同时将浓度加大，聚合时凝胶体积变化不严重了，既保证机械强度，又避免气泡产生。
高效毛细管电泳法PPT课件
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四、柱效和分离度
（一）理论塔板数和塔板高度
引入与色谱相似的处理和表达方法，用理论塔板数n和 塔板高度H表示柱效。n可以直接由电泳图求出
n
5.54
tm W1/ 2
2
16
tm W
2
tm为起点到谱峰最高点所对应的时间，称为迁移时间。因为 毛细管中，没有固定相，不存在组分在固定相中分配和保留。
（2）阴离子的影响
在其他条件相同，浓度相同而阴离子不同时，毛细管中 的电流有较大差别，产生的焦耳热不同。
缓冲溶液离子强度，影响双电层的厚度、溶液黏度和工 作电流，明显影响电渗流大小。缓冲溶液离子强度增加，电 渗流下降。
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4. 温度的影响
毛细管内温度的升高，使溶液的黏度下降，电渗流增大。 温度变化来自于“焦耳热” 焦耳热：毛细管溶液中有电流通过时，产生的热量； HPCE中的焦耳热与背景电解质的摩尔电导、浓度及电场强度成正比。 温度每变化1，将引起背景电解质溶液黏度变化2%～3%；
二、电渗和电渗流
ef i i ep
i
1．电渗现象
当固体与液体相接触时，如果固体表面因某种原因带一 种电荷，则因静电引力使其周围液体带相反电荷，当液体两 端施加一定电压时，就会发生液体相对于固体表面的移动， 我们把这种液体相对于带电固体表面移动的现象叫做电渗。
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目前，高效毛细管电泳大多使用石英毛细管，在内充缓冲 液PH>2时，管壁的硅醇基（－SiOH）开始部分离解成硅醇 基阴离子（－SiO－），使管壁带负电荷，并由此吸引溶液中 的阳离子，在管壁和溶液之间形成双电层。毛细管内壁的双 电层及其电势分布见下图。
毛细管电泳
•
CE开始主要用于蛋白质，多肽的分析,以 后逐渐被广泛应用于生物，化学，医药， 环保等领域。它具有分离效率高，分析速 度快，样品及试剂用量少,洁净无污染等特 点,和HPLC(高效液相色谱法)成为分析化学 中互补的技术。随着生命科学的发展，毛 细管电泳技术也有了广阔的发展空间.目前， 不同分离模式的毛细管电泳技术正成为最 重要的生物样品分离分析手段。
二.毛细管电泳基本原理
1.基本概念
有效长度 (Ld, cm)
迁移时间 (tm min)
毛细管的入口端到检测器窗口的距离；
带电粒子在电场作用下做定向移动的时间；
电泳速度（Ue cm/s） 在单位时间内，带电粒子在毛细管中定向 移动的距离； 电场强度(E V/cm) 在给定长度毛细管的两端施加一个电场后 所形成的电效应的强度；
tm = Lt2/UV
其中， U = Ue/Ueo
可见，在毛细管长度一定，某时刻电压 相同的条件下，迁移时间决定于电泳速 度Ue和电渗流速度Ueo,而两者均随组分 的不同荷质比而异;所以，基于荷质比 的差异就可以实现组分的分离。
Lt---有效长度 V---施加电压 U---溶质总流速 Ue---电泳速度 Ueo---电渗流速度
电泳仪工作示意图
三.毛细管电泳的分离模式
毛细管电泳有多种分离模式，给样品分离提供了不同的 选择机会.根据分离原理可分为:
毛细管区带电泳
毛细管凝胶电泳 CE 胶束电动力学毛细管色谱 毛细管等电聚焦电泳
毛细管区带电泳
毛细管区带电泳(CZE)也 称为自由溶液毛细管电泳, 是毛细管电泳中最简单， 应用最广泛的一种形式。 其分离机理在于：不同离子 按照各自表面电荷密度的差 异也即淌度的差异,以不同的 速度在电解质中移动,而实现 分离。当然，中性物质的淌 度差为零,所以不能以这种形 式分离。
毛细管电泳的分离原理
毛细管电泳的分离原理
毛细管电泳（CE）是一种基于电动力和色谱分离原理的分析技术。
它利用毛细管中载带电荷的离子在电场作用下的迁移速率的差异来实现分离。
在毛细管电泳中，首先将样品注入到一条非常细的毛细管内，然后通过使毛细管两端施加电场来产生电动力。
当电场施加到毛细管上时，带电的分析物会受到电场力的作用而在毛细管内迁移。
不同的物质由于自身的特性，比如大小、电荷等，会以不同的速率迁移。
具体来说，有两种常用的毛细管电泳模式：
1. 毛细管凝胶电泳（CGE）：在该模式下，毛细管内填充了哑离子聚合物凝胶，通过凝胶的孔道来实现分离。
样品中的离子在电场作用下，根据尺寸的不同，在凝胶中迁移速度也不同，从而实现分离。
2. 毛细管毛细管区带电泳（CZE）：在该模式下，毛细管内不填充任何分离介质。
样品中的离子自行在毛细管中迁移，根据大小和电荷的不同，迁移速度也不同，从而实现分离。
总的来说，毛细管电泳的分离原理是利用样品中离子在电场作用下的迁移速率差异，根据大小和电荷特性，在毛细管中实现分离。
毛细管电泳
毛细管电泳科技名词定义中文名称：毛细管电泳英文名称：capillary electrophoresis;CE定义1：以毛细管为分离通道、高压电场为驱动力的电泳分离分析法。
包括毛细管自由流动电泳、毛细管区带电泳等。
应用学科：生物化学与分子生物学（一级学科）；方法与技术（二级学科）定义2：以毛细管为分离通道、高压电场为驱动力的电泳分离分析法。
包括毛细管自由流动电泳、毛细管区带电泳、毛细管等电聚焦等。
应用学科：细胞生物学（一级学科）；细胞生物学技术（二级学科）以上内容由全国科学技术名词审定委员会审定公布求助编辑百科名片毛细管电泳（capillary electrophoresis，CE）又称高效毛细管电泳（high performance capillary electrophoresis，HPCE），是一类以毛细管为分离通道、以高压直流电场为驱动力的新型液相分离技术。
毛细管电泳实际上包含电泳、色谱及其交叉内容，它使分析化学得以从微升水平进入纳升水平，并使单细胞分析，乃至单分子分析成为可能。
长期困扰我们的生物大分子如蛋白质的分离分析也因此有了新的转机。
目录基础理论双电层Zeta 电势淌度、绝对淌度和有效淌度电渗、电渗流和表观淌度分类特点仪器系统影响分离因素缓冲液pH值分离电压温度添加剂进样测定药物与蛋白结合常数质谱联用微全分析系统应用综述CE在药物制剂分析中的应用CE在药物杂质检查中的应用CE在中药分析中的应用CE在手性药物分析中的应用生物样本中的药物及其代谢产物分析展望基础理论双电层Zeta 电势淌度、绝对淌度和有效淌度电渗、电渗流和表观淌度分类特点仪器系统影响分离因素缓冲液pH值分离电压温度添加剂进样测定药物与蛋白结合常数质谱联用微全分析系统应用综述CE在药物制剂分析中的应用CE在药物杂质检查中的应用CE在中药分析中的应用CE在手性药物分析中的应用生物样本中的药物及其代谢产物分析展望展开编辑本段基础理论双电层双电层是指两相之间的分离表面由相对固定和游离的两部分离子组成的与表面异号的离子层，凡是浸没在液体中的界面都会产生双电层。
毛细管电泳法
毛细管电泳法分离水杨酸、苯甲酸及阿司匹林中的含量测定毛细管电泳法分离水杨酸、苯甲酸及阿司匹林中的含量测定毛细管电泳又称高效毛细管电泳( High Performance Capillary Electrophoresis, HPCE) 是一种仪器分析方法。
通过施加10-40kV 的高电压于充有缓冲液的极细毛细管，对液体中离子或荷电粒子进行高效、快速的分离。
现在，HPCE 已广泛应用于氨基酸、蛋白质、多肽、低聚核苷酸、DNA 等生物分子分离分析，药物分析，临床分析，无机离子分析，有机分子分析，糖和低聚糖分析及高聚物和粒子的分离分析。
人类基因组工程中DNA 的分离是用毛细管电泳仪进行的。
毛细管电泳较高效液相色谱有较多的优点。
其中之一是仪器结构 简单（见图1）。
它包括一个高电压源，一根毛细管，紫外检测器及计算机处理数据装置。
另有两个供毛细管两端插入而又可和电源相连的缓冲液池。
high-v oltagepower supply BufferV ialBuffer V ial Detector Recording dev icecapillaryElectrode Electrode图1 CE 仪器组成示意图毛细管中的带电粒子在电场的作用下，一方面发生定向移动的电泳迁移，另一方面，由于电泳过程伴随电渗现象，粒子的运动速度还明显受到溶液电渗流速度的影响。
粒子的实际流速 V 是电泳流速度 Vep 和渗流速度 Veo 的矢量和。
即:V = Vep + Veo (1)电渗流是一种液体相对于带电的管壁移动的现象。
溶液的这一运动是由硅/水表面的Zeta 势引起的。
CE 通常采用的石英毛细管柱表面一般情况下(pH>3)带负电。
当它和溶液接触时，双电层中产生了过剩的阳离子。
高电压下这些水合阳离子向阴极迁移形成一个扁平的塞子流，如图2。
毛细管管壁的带电状态可以进行修饰，管壁吸附阴离子表面活性剂增加电渗流， 管壁吸附阳离子表面活性剂减少电渗流甚至改变电渗流的方向。
毛细管电泳法的特点和CE-MS的构造-PPT课件
CE-ESI-MS接口主要分为鞘液接口和 无鞘液接口两种。
鞘液接口技术
鞘液接口技术是最早出现，其优点在于通过提高样 品流速使得喷雾更加稳定,有利于形成稳定的电流回 路,同时可改变CE运行缓冲液的组成, 使其满足ESI 源的检测要求。主要有低流速( low-flow )鞘液接口， 多通道的CE-ESI-MS联用鞘液接口。Chang等设计 了低流速鞘液接口,他们将毛细管末端套在装有鞘液 的离心管中,鞘液低速流出与CE 流出物混合,离心管 中插入一铂丝作为电极以构成电流回路; 低流速可 以降低鞘液的稀释作用,同时铂丝构成电流回路可以 避免因流速低所造成的断流。
CE-MS的结构
电喷雾技术
用来产生MS分析的所需的离子技术，特别适 用于与大分子的质谱分析，采用ESI，大分子 在离子化过程中不会碎裂。
电喷雾技术的优点
接口技术
接口技术是实现CE-MS 联用的关键所在。CE-MS 联用分为在线联用和离线联用。CE-MS离线联用的 关键是对已分离样品的有效收集,并不涉及真正意义 上的联用接口技术;而且与离线联用相比, CE-MS在 线联用具有样品损失少、自动化程度高、分析速度 快等优点,其应用要比离线联用广泛得多。CE-MS 在线联用需要设计合适的接口,能够将已分离的样品 全部转移到质谱仪中,同时实现样品快速高效的离子 化，同时接口对技术要求很高。
芯片CE与ESI-MS联用的方法主要分 为两类:
一类是将ESI源和CE 微芯片整合在一起, 另 一类是把毛细管喷雾器附加在CE 微芯片内。 后者的应用更为广泛, 其
毛细管电泳(CE)与质谱(MS) 联用技术(CE-MS)
能快速分离微体积样品中的化合物，及其高效分离 和基于分子量鉴定化合物的能力，使它成为分析复 杂生物样品的一种非常有价值的方法。 另外，在各种广泛的诸如毛细管区域电泳，毛细管 等电点调焦，和在线等速电泳等技术已经和MS结 合。这些优点使得CE-MS在分析复杂生物混合物中 广泛使用。CE-MS已经成功地广泛应用于复杂化合 物地分析包括氨基酸，蛋白质消化，蛋白质混合物， 单个细胞，寡核苷酸，和各种小分子相关的制药工 业。