WB-Western Blot实验步骤及讲解
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β-Actin广泛分布于胞浆，表达量丰富。
内参
Thanks for watching！
实验步骤
3、电转 由于凝胶太脆难以进行抗体与蛋白的自由结合及检测、显影等
操 作 ， 故 需 转 膜 。 目 前 常 用 NC 膜 （ 硝 化 纤 维 膜 ） 、 PVDF 膜 （聚偏二氟乙烯膜）。通过电转移法即将电场加于凝胶——使 蛋白移出并附着在薄膜上。除此之外，为了防止过热导致转膜 板夹层中形成气泡，故转膜时应该置于冰槽中，且注意将冰块 置于黑板所在处。
实验步骤
5、一抗孵育 根据目的蛋白选择对应的一抗及合适的稀释比例，用封闭液对抗体
进行稀释。一抗孵育条件：4℃冰箱，过夜（＞12h）。
建议孵育抗体之前一定要仔细看抗体说明书， 了解抗体的种属来源和抗体的建议稀释比例。
实验步骤
6、洗涤一抗。PBST，摇床（80-90r/min），3次×15 min或4次×10 min 。
蛋白提取步骤
0.6 0.5 0.4 0.3 0.2 0.1
0 0
y = 0.8302x + 0.1174 R² = 0.9988
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
0.6
蛋白提取步骤
蛋白提取步骤
10. 蛋白变性。按照蛋白原液体积：5×上样缓冲液=4:1的比例，在对应 样本中加入5×上样缓冲液后煮沸5min，室温冷却后置-80℃冰箱保存。
蛋白煮沸变性一般是 95~100 °C，5~10 min，水浴锅煮沸时，可用 带夹 EP 管防止 EP 管盖弹开，使水浴锅内的水进入而使样品废掉。
前期准备
材料：蛋白样本（已变性） 器械：玻璃板（厚板及薄板）、玻璃板架、梳子、枪头、移液枪、 PVDF膜、滤纸、口罩、手套
前期准备
1
配胶试剂盒
碧云天/博士德
Western Blot
概念
通过特异性抗体对凝胶电泳处理过的细胞或生物组织样品 进行着色，通过分析着色的位置、深度获得特定蛋白质在 所分析的细胞或组织中表达情况的信息。
一个基因表达终极结果是产生相应的蛋白质（或酶）。 因此检测蛋白质是测定基因表达的主要标志。
分类
➢ SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)
SDS-PAGE中的蛋白需先变性展开再进行研究，主要是根据蛋 白的质量在凝胶中进行分离，特别适用于评估蛋白质量的变化。
➢ Native-PAGE
原理
前期准备——蛋白提取
器材：匀浆器、EP管（10ml、1.5ml、100ul）、弯镊、96孔板、冰盒 酶标仪、低温离心机、电子秤等
试剂：蛋白裂解液、PMSF工作液/蛋白酶抑制剂、磷酸酶抑制剂、 BCA蛋白浓度测试盒、5×蛋白上样缓冲液
实验步骤
实验步骤
2、SDS 凝胶电泳 （1）配制电泳液及电转液（电转液的甲醇在使用前添加，加入后置于4度冰 箱待用）。 （2）将玻璃板安装于电泳槽架子上以后，向内加入少许电转液观察是否有漏 液，若无即可放入电泳槽中，若有漏液需重新夹取玻璃板。 （3）轻轻拔出凝胶中的梳子，两侧用力均匀保证加样孔无歪斜。 （4）将电泳槽内外均加入足量电泳液以后，开启电泳仪电源，将电压调为 60V，预电泳15min，疏通凝胶分子孔径。 （5）预电泳完成后进行蛋白加样。若有多余孔道需用1×Buffer封边，并设置 一孔加入预染Marker。 （6）电泳。电压调为80V使蛋白样品在浓缩胶内电泳，然后将电压调为110V 使蛋白样品在分离胶内电泳，至所需目的蛋白充分分离后停止（根据Marker所 标记位置估计切胶宽度≥1cm）。
二抗是能与荧光酶等结合并能识别一抗→使目标蛋 白易于检测，并具有放大效应（一个二抗可以结合多 个一抗），最后通过其能与辣根过氧化物酶聚合并产 生光（HRP法）或其他方法等进行曝光检测。
7、二抗孵育
选用针对一抗来源的二抗，配制成工作浓度后，均匀滴加于PVDF膜上。
二抗孵育条件：37度，摇床（40r/min），1h。
脂肪层 蛋白质溶液
组织沉淀
蛋白提取步骤
7. 打开96孔板，标记加样，进行蛋白浓度测定。
蛋白提取步骤
7. 根据BCA测试盒说明书，计算所需A液和B液的量。以每一个小孔里面加 入 200ul 混 合 液 计 算 ， 例 如 需 要 用 到 96 孔 板 中 的 24 个 孔 ， 则 需 配 制 混 合 液 24×200=4800ul，其中A液：B液=50：1，考虑到加样过程中会有液体损失， 适当增加配液总体积，可直接加入4800ulA液，4800/50=96ulB液，吹打混匀。 8. 向96孔板里面依次加入200ul的AB混合液，再依次加入各蛋白样本，完毕 后敲打孔板侧身使混合液与蛋白样本充分混匀。 9. 96孔板置于37℃烤箱孵育30min。
蛋白提取步骤
为了防止蛋白降解、去磷酸化，各种蛋白 酶抑制剂、磷酸酶抑制剂都是必须的。
1. 于-20℃冰箱取出蛋白裂解液及PMSF等，常温下溶解；BCA测试盒、5×Buffer置冰 上备用；将已高压消毒的匀浆器及弯镊置冰上冷却备用；开启低温离心机调至4℃ 备用、烤箱调至37℃备用。
2. 组织样本于冰上冻融后，称取适量组织（约30-50mg）放入匀浆器中，准确记录所 夹取组织重量。
选择二抗抗体取决于一抗抗体的种属来源。 例如，如果一抗抗体是小鼠来源单克隆抗体，二抗抗 体必须是抗小鼠的抗体；如果一抗抗体是兔来源多克 隆抗体，二抗抗体必须是抗兔的抗体。
实验步骤
8、洗涤二抗。PBST，摇床（80-90r/min）， 3次×15 min或4次×10 min 。 9、化学发光法显色
准备一个蜡板用于铺膜；按照1:1的比例配 制化学发光液，均匀滴加于蜡板上铺好的的 PVDF膜上后，操作电脑进行曝光。 10、曝光完毕后，整理实验器材，及时拷取 实验数据进行分析。
实验步骤
3、电转
➢ 根据被转移的蛋白分子量大小，选择不同孔径的印迹膜。因为随 着膜孔径的不断减小，膜对低分子量蛋白的结合就越牢固。
➢ 通常用 0.45 μm 和 0.22 μm 两种规格的印迹膜。 ➢ 大于 30 KD 的蛋白可用 0.45 μm 的膜。 ➢ 小于 30 KD 的蛋白就要用 0.2 μm 的膜。
蛋白提取步骤
5. 上述裂解液于低温离心机内离心，12000rpm×15min，4℃。 6. 离心完成后，小心取出离心管，可见液体分成3层，上层为白色脂肪层，中层为 澄清蛋白质溶液，下层为组织沉淀，用适当量程的移液枪小心吸取中间层蛋白溶 液于1.5mlEP管中，记录所吸取体积（ul）。 注意：宁可少吸不可多吸！
封闭条件：37度，摇床，50r/min。
➊ 脱脂奶是最常用的经济配方。
❷ 脱脂奶粉不能与生物素化的抗体一起使用，因为脱脂奶 粉含有糖蛋白和生物素；建议使用 BSA。
❸ 分析磷酸化蛋白须用 BSA。脱脂奶粉含磷酸酶，用磷酸 化特异性抗体分析磷酸化蛋白受到影响，因为磷酸酶与膜 上的磷酸化蛋白接触可使之去磷酸化；也不适用于碱性磷 酸酶（AP）检测系统。
2
5×上样Buffer
碧云天
3
蛋白Marker
赛默飞
4
Tris Base
生工
5
甘氨酸
生工
6
SDS粉末
Baidu Nhomakorabea生工
7
脱脂奶粉
博士德
8
BSA（牛血清白蛋白） Sigma
9
PBS或TBS粉末
中杉金桥
10 Tween-20
11 化学发光液（ECL）
12 甲醇
实验步骤
1. 配制SDS凝胶 （1）将玻璃板对应安装至玻璃架，配制相应浓度的分离胶（按照每块凝胶需 5ml混合液的量计算）。 （2）加入TEMED混匀后，立即灌入两块玻璃板之间的空隙，每块凝胶约需分 离胶4ml。灌胶完成后立即用无水乙醇封边。 （3）室温静置待胶凝固，倒掉上层封边液体，并用滤纸吸干上层空间。 （4）配制浓缩胶，每块凝胶约需2ml，加入分离胶的上层空间后，立即插入相 应尺寸的梳子。 （5）室温静置。 注意：清洗玻璃板！防止起泡产生！注意TEMED毒性，避免吸入和接触！
3. 计算应加入裂解液和PMSF的体积：蛋白裂解液（ul）=组织重量（mg）×12、 PMSF（ul）=组织重量（mg） ×0.2。根据上述数值将液体分别加入匀浆器中。
4. 于匀浆器中碾磨，至无肉眼可见组织即可，用移液枪将碾磨后的液体转移至1.5ml EP管内，静置30min，每5min摇晃混匀以便裂解液和组织充分发生反应。
实验步骤
4、封闭
因为用于WB的膜对蛋白包括抗体具有高度亲和力， 故加抗体前可通过封闭→减少非特异性抗体与膜结合， 封闭剂内的蛋白可覆盖膜上尚未结合蛋白的区域。
电转完成后，直接取出PVDF膜，可见预染Marker，放入5%新鲜配
制牛奶/BSA封闭1-1.5h（5g牛奶/BSA+100mlPBST,注意保质期问题），
实验步骤
内参
➢ 免疫印迹（Western blot, WB）是分子生物学中检测复杂生物提取物中特 定蛋白质存在的最常用方法之一。
➢ WB必须控制上样量以确保目标蛋白变化具有可比性，通常选择在所有组 织中普遍分布的具有相对恒定量的蛋白质作为内参（Loading control）。
内参
➢ 当然WB实验中的内参选择也是至关重要，毕竟它以表达水平不变的 蛋白作为对照，能确保不同操作孔中所加样品量相接近，减少误差。 选择的依据主要是分子量大小、表达水平、表达因素等，常用的如 β-Actin、GAPDH等。
实验步骤
实验步骤
➢ 结合SDS-PAGE原理，加样前蛋白样品会先加热→ 蛋白去折叠。电泳槽中含有缓冲液，使得电流通过 凝胶传导。加入蛋白样品和Marker后进行电泳。放 置电极时注意将负电极置于顶部而正电极置于底部。
➢ Marker中的标准蛋白（由多种已知分子量 大蛋白组成）可对照形成蛋白阶带→测量 凝胶电泳后蛋白的分子量。
实验步骤
3、电转 （1）电泳完成后，切胶，电转。电转时按照海 绵（1层）、滤纸（2-3层）、凝胶、PVDF膜、 滤纸（2-3层）、海绵（1层）的顺序依次铺平， 膜和所切下来的凝胶大小对应。注意：避免膜和 胶之间的气泡！ （2）开启电转仪，设置电流为250mA，根据目 的 蛋 白 分 子 量 大 小 确 定 电 转 时 间 ,1kd 大 约 转 膜 1min。
内参
Thanks for watching！
实验步骤
3、电转 由于凝胶太脆难以进行抗体与蛋白的自由结合及检测、显影等
操 作 ， 故 需 转 膜 。 目 前 常 用 NC 膜 （ 硝 化 纤 维 膜 ） 、 PVDF 膜 （聚偏二氟乙烯膜）。通过电转移法即将电场加于凝胶——使 蛋白移出并附着在薄膜上。除此之外，为了防止过热导致转膜 板夹层中形成气泡，故转膜时应该置于冰槽中，且注意将冰块 置于黑板所在处。
实验步骤
5、一抗孵育 根据目的蛋白选择对应的一抗及合适的稀释比例，用封闭液对抗体
进行稀释。一抗孵育条件：4℃冰箱，过夜（＞12h）。
建议孵育抗体之前一定要仔细看抗体说明书， 了解抗体的种属来源和抗体的建议稀释比例。
实验步骤
6、洗涤一抗。PBST，摇床（80-90r/min），3次×15 min或4次×10 min 。
蛋白提取步骤
0.6 0.5 0.4 0.3 0.2 0.1
0 0
y = 0.8302x + 0.1174 R² = 0.9988
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
0.6
蛋白提取步骤
蛋白提取步骤
10. 蛋白变性。按照蛋白原液体积：5×上样缓冲液=4:1的比例，在对应 样本中加入5×上样缓冲液后煮沸5min，室温冷却后置-80℃冰箱保存。
蛋白煮沸变性一般是 95~100 °C，5~10 min，水浴锅煮沸时，可用 带夹 EP 管防止 EP 管盖弹开，使水浴锅内的水进入而使样品废掉。
前期准备
材料：蛋白样本（已变性） 器械：玻璃板（厚板及薄板）、玻璃板架、梳子、枪头、移液枪、 PVDF膜、滤纸、口罩、手套
前期准备
1
配胶试剂盒
碧云天/博士德
Western Blot
概念
通过特异性抗体对凝胶电泳处理过的细胞或生物组织样品 进行着色，通过分析着色的位置、深度获得特定蛋白质在 所分析的细胞或组织中表达情况的信息。
一个基因表达终极结果是产生相应的蛋白质（或酶）。 因此检测蛋白质是测定基因表达的主要标志。
分类
➢ SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)
SDS-PAGE中的蛋白需先变性展开再进行研究，主要是根据蛋 白的质量在凝胶中进行分离，特别适用于评估蛋白质量的变化。
➢ Native-PAGE
原理
前期准备——蛋白提取
器材：匀浆器、EP管（10ml、1.5ml、100ul）、弯镊、96孔板、冰盒 酶标仪、低温离心机、电子秤等
试剂：蛋白裂解液、PMSF工作液/蛋白酶抑制剂、磷酸酶抑制剂、 BCA蛋白浓度测试盒、5×蛋白上样缓冲液
实验步骤
实验步骤
2、SDS 凝胶电泳 （1）配制电泳液及电转液（电转液的甲醇在使用前添加，加入后置于4度冰 箱待用）。 （2）将玻璃板安装于电泳槽架子上以后，向内加入少许电转液观察是否有漏 液，若无即可放入电泳槽中，若有漏液需重新夹取玻璃板。 （3）轻轻拔出凝胶中的梳子，两侧用力均匀保证加样孔无歪斜。 （4）将电泳槽内外均加入足量电泳液以后，开启电泳仪电源，将电压调为 60V，预电泳15min，疏通凝胶分子孔径。 （5）预电泳完成后进行蛋白加样。若有多余孔道需用1×Buffer封边，并设置 一孔加入预染Marker。 （6）电泳。电压调为80V使蛋白样品在浓缩胶内电泳，然后将电压调为110V 使蛋白样品在分离胶内电泳，至所需目的蛋白充分分离后停止（根据Marker所 标记位置估计切胶宽度≥1cm）。
二抗是能与荧光酶等结合并能识别一抗→使目标蛋 白易于检测，并具有放大效应（一个二抗可以结合多 个一抗），最后通过其能与辣根过氧化物酶聚合并产 生光（HRP法）或其他方法等进行曝光检测。
7、二抗孵育
选用针对一抗来源的二抗，配制成工作浓度后，均匀滴加于PVDF膜上。
二抗孵育条件：37度，摇床（40r/min），1h。
脂肪层 蛋白质溶液
组织沉淀
蛋白提取步骤
7. 打开96孔板，标记加样，进行蛋白浓度测定。
蛋白提取步骤
7. 根据BCA测试盒说明书，计算所需A液和B液的量。以每一个小孔里面加 入 200ul 混 合 液 计 算 ， 例 如 需 要 用 到 96 孔 板 中 的 24 个 孔 ， 则 需 配 制 混 合 液 24×200=4800ul，其中A液：B液=50：1，考虑到加样过程中会有液体损失， 适当增加配液总体积，可直接加入4800ulA液，4800/50=96ulB液，吹打混匀。 8. 向96孔板里面依次加入200ul的AB混合液，再依次加入各蛋白样本，完毕 后敲打孔板侧身使混合液与蛋白样本充分混匀。 9. 96孔板置于37℃烤箱孵育30min。
蛋白提取步骤
为了防止蛋白降解、去磷酸化，各种蛋白 酶抑制剂、磷酸酶抑制剂都是必须的。
1. 于-20℃冰箱取出蛋白裂解液及PMSF等，常温下溶解；BCA测试盒、5×Buffer置冰 上备用；将已高压消毒的匀浆器及弯镊置冰上冷却备用；开启低温离心机调至4℃ 备用、烤箱调至37℃备用。
2. 组织样本于冰上冻融后，称取适量组织（约30-50mg）放入匀浆器中，准确记录所 夹取组织重量。
选择二抗抗体取决于一抗抗体的种属来源。 例如，如果一抗抗体是小鼠来源单克隆抗体，二抗抗 体必须是抗小鼠的抗体；如果一抗抗体是兔来源多克 隆抗体，二抗抗体必须是抗兔的抗体。
实验步骤
8、洗涤二抗。PBST，摇床（80-90r/min）， 3次×15 min或4次×10 min 。 9、化学发光法显色
准备一个蜡板用于铺膜；按照1:1的比例配 制化学发光液，均匀滴加于蜡板上铺好的的 PVDF膜上后，操作电脑进行曝光。 10、曝光完毕后，整理实验器材，及时拷取 实验数据进行分析。
实验步骤
3、电转
➢ 根据被转移的蛋白分子量大小，选择不同孔径的印迹膜。因为随 着膜孔径的不断减小，膜对低分子量蛋白的结合就越牢固。
➢ 通常用 0.45 μm 和 0.22 μm 两种规格的印迹膜。 ➢ 大于 30 KD 的蛋白可用 0.45 μm 的膜。 ➢ 小于 30 KD 的蛋白就要用 0.2 μm 的膜。
蛋白提取步骤
5. 上述裂解液于低温离心机内离心，12000rpm×15min，4℃。 6. 离心完成后，小心取出离心管，可见液体分成3层，上层为白色脂肪层，中层为 澄清蛋白质溶液，下层为组织沉淀，用适当量程的移液枪小心吸取中间层蛋白溶 液于1.5mlEP管中，记录所吸取体积（ul）。 注意：宁可少吸不可多吸！
封闭条件：37度，摇床，50r/min。
➊ 脱脂奶是最常用的经济配方。
❷ 脱脂奶粉不能与生物素化的抗体一起使用，因为脱脂奶 粉含有糖蛋白和生物素；建议使用 BSA。
❸ 分析磷酸化蛋白须用 BSA。脱脂奶粉含磷酸酶，用磷酸 化特异性抗体分析磷酸化蛋白受到影响，因为磷酸酶与膜 上的磷酸化蛋白接触可使之去磷酸化；也不适用于碱性磷 酸酶（AP）检测系统。
2
5×上样Buffer
碧云天
3
蛋白Marker
赛默飞
4
Tris Base
生工
5
甘氨酸
生工
6
SDS粉末
Baidu Nhomakorabea生工
7
脱脂奶粉
博士德
8
BSA（牛血清白蛋白） Sigma
9
PBS或TBS粉末
中杉金桥
10 Tween-20
11 化学发光液（ECL）
12 甲醇
实验步骤
1. 配制SDS凝胶 （1）将玻璃板对应安装至玻璃架，配制相应浓度的分离胶（按照每块凝胶需 5ml混合液的量计算）。 （2）加入TEMED混匀后，立即灌入两块玻璃板之间的空隙，每块凝胶约需分 离胶4ml。灌胶完成后立即用无水乙醇封边。 （3）室温静置待胶凝固，倒掉上层封边液体，并用滤纸吸干上层空间。 （4）配制浓缩胶，每块凝胶约需2ml，加入分离胶的上层空间后，立即插入相 应尺寸的梳子。 （5）室温静置。 注意：清洗玻璃板！防止起泡产生！注意TEMED毒性，避免吸入和接触！
3. 计算应加入裂解液和PMSF的体积：蛋白裂解液（ul）=组织重量（mg）×12、 PMSF（ul）=组织重量（mg） ×0.2。根据上述数值将液体分别加入匀浆器中。
4. 于匀浆器中碾磨，至无肉眼可见组织即可，用移液枪将碾磨后的液体转移至1.5ml EP管内，静置30min，每5min摇晃混匀以便裂解液和组织充分发生反应。
实验步骤
4、封闭
因为用于WB的膜对蛋白包括抗体具有高度亲和力， 故加抗体前可通过封闭→减少非特异性抗体与膜结合， 封闭剂内的蛋白可覆盖膜上尚未结合蛋白的区域。
电转完成后，直接取出PVDF膜，可见预染Marker，放入5%新鲜配
制牛奶/BSA封闭1-1.5h（5g牛奶/BSA+100mlPBST,注意保质期问题），
实验步骤
内参
➢ 免疫印迹（Western blot, WB）是分子生物学中检测复杂生物提取物中特 定蛋白质存在的最常用方法之一。
➢ WB必须控制上样量以确保目标蛋白变化具有可比性，通常选择在所有组 织中普遍分布的具有相对恒定量的蛋白质作为内参（Loading control）。
内参
➢ 当然WB实验中的内参选择也是至关重要，毕竟它以表达水平不变的 蛋白作为对照，能确保不同操作孔中所加样品量相接近，减少误差。 选择的依据主要是分子量大小、表达水平、表达因素等，常用的如 β-Actin、GAPDH等。
实验步骤
实验步骤
➢ 结合SDS-PAGE原理，加样前蛋白样品会先加热→ 蛋白去折叠。电泳槽中含有缓冲液，使得电流通过 凝胶传导。加入蛋白样品和Marker后进行电泳。放 置电极时注意将负电极置于顶部而正电极置于底部。
➢ Marker中的标准蛋白（由多种已知分子量 大蛋白组成）可对照形成蛋白阶带→测量 凝胶电泳后蛋白的分子量。
实验步骤
3、电转 （1）电泳完成后，切胶，电转。电转时按照海 绵（1层）、滤纸（2-3层）、凝胶、PVDF膜、 滤纸（2-3层）、海绵（1层）的顺序依次铺平， 膜和所切下来的凝胶大小对应。注意：避免膜和 胶之间的气泡！ （2）开启电转仪，设置电流为250mA，根据目 的 蛋 白 分 子 量 大 小 确 定 电 转 时 间 ,1kd 大 约 转 膜 1min。