血液DNA快速提取方法
磁珠法全血基因组DNA 提取详细步骤及方法
磁珠法全血基因组DNA 提取详细步骤及方法注意事项样品应避免反复冻融，否则会导致提取的DNA片段较小且提取量也下降；◆需要自备材料：无菌水、异丙醇、磁铁或磁架、1.5 ml离心管(最好低吸附的离心管)；需要去除RNA自备RNase A，在蛋白酶K消化这一步加入4 μl RNase A （100 mg/ml）；PBS。
◆已加入抗凝剂的血液样品可在2-8℃储存不超过3天（推荐使用EDTA作为抗凝剂），长期贮存请置于-70℃；◆整个过程请勿离心，以免磁珠不可逆聚集而影响提取效果。
实验准备◆冻存血液应在室温或37℃缓慢解冻，不可高温加热，以免血凝成块；将冻存的血液置于37℃摇床150-200 rpm融化，效果最佳；也可提前一天放在4℃解冻；◆磁珠用前一定要充分混匀；◆56℃加热源◆使用前需在Buffer BGW I中加入相应体积的无水乙醇。
操作步骤1. 裂解：(1)当全血样品量低于200 μl时，在全血中加入200 μl Buffer BGL、20 μl Proteinase K，56℃ 10min；(2)当全血样品量高于200 μl时，12000 rpm离心1分钟，弃上清，加入200 μl PBS缓冲液，再加入200 μl Buffer BGL、20 μl Proteinase K，56℃ 10min；2. 结合：在上述裂解液中加入400 μl 异丙醇和磁珠悬浮液(MB) 30 μl（使用前充分重悬），吹打分散磁珠；将离心管放置于磁力架上，待磁珠完全吸附后吸弃液体。
3.漂洗: (1) 将离心管从磁力架上取下，向离心管中加入500 μl Buffer BGW 0,涡旋振荡5s，充分重悬磁珠，将离心管放置于磁力架上，待磁珠完全吸附后吸弃液体，重复该步骤一次。
(2) 将离心管从磁力架上取下，向离心管中加入500 μl Buffer BGW I,涡旋振荡5s，充分重悬磁珠,将离心管放置于磁力架上，待磁珠完全吸附后吸弃液体。
提取dna的实验步骤原理
提取dna的实验步骤原理DNA提取是一项重要的实验技术，用于从细胞中分离纯净的DNA。
它在生物学、医学、犯罪学等领域具有广泛的应用。
DNA提取的过程可以分为以下几个步骤：样品收集、细胞破碎、蛋白质消化、DNA分离、洗涤、溶解和纯化。
首先，样品收集是DNA提取的第一步。
样品可以来自不同的来源，如血液、唾液、组织样本等。
对于血液样品，静脉采血是最常见的方式。
收集的血液样品需要采用抗凝剂进行预处理，以防止凝血。
细胞破碎是DNA提取的关键步骤之一。
细胞破碎的目的是将细胞膜以及核膜破坏，释放细胞内的DNA。
常用的细胞破碎方法有物理破碎、化学破碎和酶解法。
物理破碎一般采用高速离心仪或超声波处理，通过机械力量破坏细胞结构。
化学破碎使用适当的溶液，如细胞裂解液（例如EDTA、SDS、蛋白酶K等）来分解膜脂质和蛋白质。
酶解法则通过酶的作用来降解膜和核酸。
蛋白质消化是为了去除提取过程中的蛋白质杂质。
蛋白质会干扰DNA的纯化和测定。
在蛋白质消化过程中，常用的方法是加入蛋白酶K或肾脏酸性蛋白酶等蛋白水解酶，通过其酶解作用将蛋白质降解。
DNA分离是将DNA与其他细胞组分分离的过程。
DNA在细胞破碎后呈现为线性或环状的形态。
为了分离DNA，一般采用盐溶液和有机溶剂共同作用的方案，如添加高浓度的盐类（如NaCl）和异丙醇。
这些溶剂会沉淀细胞残渣和蛋白质，而DNA则溶于水相中。
洗涤过程是为了去除残留的蛋白质和盐类。
洗涤液一般为酒精溶液，如酒精和醋酸盐。
洗涤时，将沉淀的DNA加入洗涤液中，通过离心使DNA沉淀，然后去除上清液。
此过程重复一至三次可以有效去除杂质。
溶解是将沉淀的DNA重新溶解于缓冲液中，以便于后续的操作。
溶解液可以是Tris-EDTA缓冲液、无菌纯水等。
在加入缓冲液后，将溶液置于水浴中进行搅拌和温度控制，使DNA彻底溶解。
纯化是最后一步，目的是去除DNA提取过程中的杂质，获得纯净的DNA。
常见的纯化方法有酚-氯仿抽提法和硅胶纯化法。
DNA的提取与保存方法
1．-20度冻存1年是没有问题的，当然越低越好。
但是冻存后，用蛋白酶K法，红细胞不易裂解，必须采用特殊方法裂解。
2．建议裂解红细胞后再冻存于－80度。
因为冻融后红细胞会裂解，而且红细胞会增加蛋白污染，影响DNA抽提3．我们实验室加ACD抗凝血液，保存3年了，抽提DNA没问题（我们是先离心后分层保存，以便后续试验）！血DNA提取技术分离外周血白细胞提取方法：试验步骤：1、取人肘静脉血5ml，EDTA抗凝，2500rpm离心10min。
2、小心吸取上层血浆，分装到3个0.5ml离心管中。
3、在血细胞中加入3倍体积的溶血液，摇匀，冰浴15min。
4、2500rpm离心10min，弃上清。
5、加入10ml溶血液，摇匀，冰浴15min。
6、3000rpm离心10min，弃上清。
7、倒置离心管，去掉残液。
8、得白细胞，－80?C冻存。
试验要求：血至分离白细胞之间隔时间在室温下放置不超过2h，4℃放置不超过5h，以防白细胞自溶。
氯仿法抽提外周血白细胞基因组DNA：试验试剂：Ligsisbuffer：133mMNH4ClNHCl7.12g0.9mMNH4HCO3NH4HCO30.071g0.1mMEDTA0.5mMEDTA0.2ml；最后加灭菌去离子水至1000ml，高压灭菌。
ACD抗凝剂：柠檬酸1.68g柠檬酸钠4.62g葡萄糖5.15g；最后加灭菌去离子水至350ml，高压灭菌。
提取缓冲液（Extractionbuffer）：10mMTrisCl(PH=8.0)1MTris.Cl(PH=8.0)1ml0.1mMEDTA(PH=8.0)0.5mMEDTA(PH=8.0)20ml0 .5%SDS10%SDS0.5ml；最后加灭菌去离子水至100ml，高压灭菌试验步骤：1、在500μl抗凝血中加入ligsisbuffer1000μl，充分颠混至清亮。
以4000rpm，离心5min。
弃上清液。
2、沉淀中加入ligsisbuffer1500μl，充分匀浆。
磁珠法提取dna原理
磁珠法提取dna原理磁珠法提取DNA原理DNA提取是分子生物学研究中的重要步骤，磁珠法是一种常用的DNA提取方法。
磁珠法利用了磁性珠子的特性，使得DNA在磁场作用下能够与磁珠结合，从而实现DNA的快速、高效提取。
磁珠法提取DNA的原理基于亲和层析技术，其中亲和剂是磁性珠子表面的修饰物。
这些修饰物能够与DNA的特定区域结合，例如特定序列、结构或染色体上的特定区域。
磁珠法的基本步骤包括样品裂解、DNA与磁珠结合、磁珠分离、洗涤和DNA的洗脱。
样品需要经过裂解步骤，以破坏细胞膜和核膜，使DNA释放到溶液中。
裂解液中通常包含蛋白酶K和蛋白酶K缓冲液，以消化细胞蛋白质。
然后，磁性珠子被加入裂解液中，这些珠子的表面修饰物能够与DNA结合。
修饰物可以是亲和剂，如亲合素或抗体，也可以是特定的DNA引物。
在结合步骤中，磁性珠子与DNA结合形成复合物。
通过磁场的作用，磁珠复合物被吸附到管壁或磁珠法专用的磁力架上，从而实现DNA的分离。
与传统的离心分离方法相比，磁珠法具有更高的纯度和回收率。
此外，磁珠复合物的形成和分离速度较快，节省了实验时间。
分离步骤通常涉及将磁力架移除至洗涤液中，以去除非特异性结合物质。
洗涤步骤可以使用乙酸盐缓冲液、乙醇或其他洗涤缓冲液来去除冗余的污染物。
洗涤后，磁力架被重新放置到洗脱液中，DNA 从磁珠上解离，溶解在洗脱液中。
洗脱液通常是低盐缓冲液或去离子水，以确保DNA的高纯度。
磁珠法提取DNA的优点不仅在于其高纯度和回收率，还在于其灵活性和可扩展性。
磁珠的表面修饰物可以根据实验需求进行选择，以实现对特定DNA序列或特定组分的选择性结合。
此外，磁珠法可应用于多种样品类型，包括血液、组织、细胞和体液等。
对于大规模的DNA提取，磁珠法可以进行高通量自动化处理，提高操作效率和样品数量。
总结起来，磁珠法提取DNA的原理是利用磁性珠子与DNA的特异性结合，通过磁场的作用将DNA分离和纯化。
这种方法具有高纯度、高回收率、灵活性和可扩展性的优点，广泛应用于分子生物学研究、临床诊断和法医学等领域。
各种检材DNA的提取
酚-氯仿法——注意事项
酚-氯仿法是目前最常用、最可靠的方法之一，无论 是血液还是血痕标本均适用 所提取的DNA纯度高，可满足各种分子生物学检测技 术的需要
但该法操作较为繁琐、耗时长，影响了其在实践工作 中的广泛应用。
（三）碱性裂解法
碱性裂解法是指在强碱作用下，使构成细胞的蛋白质 成分谷氨酸、天冬氨酸、半胱氨酸、酪氨酸残基等迅 速发生电离，从而快速破坏蛋白质的一级结构。 检材在强碱性pH条件及一定温度状况下能迅速破碎细 胞膜及核膜，使核酸酶变性及DNA释放。
Chelex-100法——步骤
取适量血痕检材置1.5ml EP管中，加入1ml 灭菌无菌 水浸泡20min，>10000rpm离心3min，用1000ul进样器 小心地吸去上清液。 加5％chelex-100 200u1，于水浴锅中56℃水浴30min， 振荡混匀。 沸水中煮10min，取出后立即置于冰上3min，>10000 rpm离心1min。上清液即为DNA提取液，可在2-6℃保 存1个月，在-20℃长期保存。
酚-氯仿法——步骤
取适量血痕检材置于1.5ml EP管中，加入1ml 无菌水 浸泡20min，>10000rpm离心3min，弃去上清。 加入500μ l STE液悬浮沉淀物，加入20μ l 10 % SDS 及10 mg/ ml 蛋白酶K 4 μ l ，54℃水浴消化3小时
离心取上清液至另一EP管中，加入500μ l苯酚/氯仿/ 异戊醇混合物，振荡到出现絮状物，>10000rpm离心 3min。
各种检材DNA的提取
夏
水
秀
一、DNA的提取方法
法医实验室几种常用DNA提取方法及比较
法医实验室几种常用DNA提取方法及比较法医实验室几种常用DNA提取方法及比较(一)Chelex100法原理：Chelex100是一种螯合树脂，由苯乙烯、二乙烯苯共聚体组成，含有成对的亚氨基二乙酸盐离子，起着螯合基团作用，对多价金属离子有极强亲和力。
在低离子强度、碱性及100℃煮沸条件下，可以使细胞膜裂解，并使与DNA结合的蛋白质变性，DNA游离。
检材基质中一般含有大量金属离子，在低离子强度及加热条件下，金属离子可以辅助脱氧核糖核酸酶降解DNA，也可以抑制PCR反应，所以在提取DNA时，加入Chelex100，螯合了金属离子，防止了DNA降解，提高了PCR扩增成功率。
方法：剪取适量血斑、精斑、汗斑、鼻涕斑、指甲、毛根、软组织等等生物检材，置于0.5ml离心管内，加入适量纯水，室温浸泡，13,000rpm离心5min，上清丢弃，管底留约20μl左右液体及检材基质，加入100-200μl 5%Chelex100(有时需加适量PK)56℃15mi n至数10小时不等，100℃8min，13,000rpm离心5mim，上清备用。
评述：1、Chelex100法已经成为DNA提取的基本方法，Chelex100法是万能的。
目前，我们一切纯化方法都在Chelex100法的基础上进行，Chelex100法又不是万能的。
2、Chelex100法提取前的检材清洗非常重要，因为现场检材往往均较脏，脏东西可以抑制PCR反应，所以往往不止清洗一次，清洗检材时可能损失部分DNA。
所以应平衡清洗抑制剂与损失DNA之间的关系。
特别强调清洗时应“把根留住”，很多情况下已知样本DNA检验失败的原因是把根没有留住。
DNA检验时还有另外一句名言：“一个萝卜一个坑”，防止混乱检材。
肝素抑制PCR反应，血红素抑制PCR反应，所以长时的浸泡、多次清洗往往可能洗除肝素及血红素。
在已知样本多次无检验结果疑为肝素抗凝的情况下，多洗是检验成功所必须的。
DNA提取步骤
DNA提取步骤抗凝（20ml血+3.5mlACD）-70℃保存5ml冻存血液，室温水浴中融化+等体积PBS（5 ml），来回颠倒混匀↓（约50次）天平平衡，室温，3500g, 离心15min↓弃上清，沉淀+4ml抽提缓液，混匀（轻轻），以充分溶解沉淀（20ml血+15 ml抽提缓冲液）37℃温育1小时（泡多的DNA多）↓加蛋白酶K至终浓度达100μg/ml（血液），充分混匀（50次）(可多加5-15ml)蛋白酶K20mg/ml20μg/μl （５ml血液可加入30 μl 或35μl ) 5ml---500μg 500/20=25μl↓将裂解细胞的悬液置于50℃水浴3小时，不时旋转混匀↓冷却至室温+等体积盐饱和酚(5ml)，来回颠倒混匀（约50次）↓天平平衡，室温，5000g, 离心15min↓用大口径移液管（出口径为0.3cm）将粘稠的水相移至一洁净离心管中+1/2体积饱和酚 +1/2体积氯仿，混匀（50次）（注意：不要将絮状沉淀吸入，不要将下层血液吸入）↓天平平衡，室温， 5000g, 离心15min↓用移液管将水相移至一洁净离心管中＋１体积氯仿，混匀↓天平平衡，室温， 5000g, 离心15min↓用移液管将水相移至一洁净离心管中＋0.1V 3M乙酸钠＋１V 异丙醇稍混匀，小心别粘在盖子上，用枪头小心挑起丝状物至一干净离管↓×天平平衡，室温， 5000g, 离心 5min↓沉淀用２０％乙醇洗两次，收集DNA（多洗几次，把DNA放在壁上，用枪头吸干乙醇洗４次，无须离心）↓晾干乙醇＋２0-50μl TE液 100μl TE液（溶解DNA）↓摇床12-24小时，直至DNA完全溶解，如隔几天使用，无须摇床，DNA也能完全溶解↓测定DNA样品在260nm和280nm处的光吸收值，计算DNA纯度和浓度↓DNA于４℃下保存。
DNA的粗提取与鉴定PCR蛋白质的提取与分离
3.DNA遇二苯胺(沸水浴)会染成( ) A.砖红色 B.橘黄色 C.紫色 D.蓝色
答：D
4.提取鸡血中的DNA时，为什么要除去血液 中的上清液?
答：DNA的提取，关键是对杂质的去除，由于 上清液是血液中的血浆部分，不含DNA，所以 要除去上清液(含有蛋白质)。
B:(1)向试管中加入0.015mol／L 的 NaCl 溶液 5mL (2)4 mL 二苯胺试剂
目的 ① ② ③ ④ ⑤ ⑥ ⑦ ⑧
⑨
①加入柠檬酸钠溶液的目的是防止血凝固
②加速血细胞破裂 ③溶解DNA ④使2mol/L的NaCl溶液稀释至0.14mol/L使得DNA 最大限度地释出
⑤使含DNA的黏稠物被留在纱布上 ⑥使含DNA的黏稠物尽可能多的溶解于溶液中 ⑦除去含DNA的滤液中的杂质 ⑧提取DNA ⑨ A出现蓝色 B无变化
在高浓度（2mol/L）的氯化钠溶液中，核蛋白易溶 解，析出DNA并溶解在高浓度的氯化钠溶液中 3.DNA的析出与获取。
因为DNA在低浓度（ 0.14mol/L ）的氯化钠溶液中 溶解度小，而蛋白质的在其中的溶解度大。所以在向含 DNA的高浓度的氯化钠溶液中加入大量蒸馏水稀释氯化 钠溶液，从而使DNA溶解度下降，蛋白质溶解度增高。
2.原①理许：多重要的生物大分子，如多肽、
核酸等都具有可解离的基团，在一定的PH下， 这些基团会带上正电或负电。②在电场的作用下， 这些带电分子会向着与其所带电荷相反的电极移 动。③电泳利用了待分离样品中各种分子带电性 质的差异以及分子本身的大小，形状的不同，使 带电分子产生不同的迁移速度，从而实现样品中 各种分子的分离。
4.凝胶色谱法分离蛋白质的原理和具体过程
（二）缓冲溶液
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Rapid Extraction of High Quality DNA from Whole Blood Stored at 4oC for Long Period
Materials and Methods
Standard chemicals
This method uses standard chemicals that can be obtained from any major supplier; we used
chemicals supplied by Sigma Co. as follow:
EDTA M), pH : Add gr of anhydrous EDTA to 800 ml of distilled water. Adjust pH to with
NaOH pellets. Make up to 1 liter with distilled water. Autoclave at 15 for 15 min.
1 M Tris-HC1, pH : Dissolve gr of Tris base in 800 ml of distilled water. Adjust pH with
concentrated HCl. Allow mixture to cool to room temperature before finally correcting pH. Make up to
1 liter with distilled water. Autoclave at 15 for 15 min.
Preparation of Red blood cell lysis buffer: M Tris-HCl pH , 320 mM sucrose, 5 mM MgC12, 1%
Triton X 100. Add 10 ml of 1 M Tris, gr of sucrose, gr MgC12, adjust pH to and finally add 10 ml of
Triton X-100 to 800 ml of distilled water, and make up to 1 liter with distilled water. Autoclave at 15
for 10 min. Sugars at high temperature can cause caramelization (browning), which degrades the sugars
[5].
Preparation of Nucleic lysis buffer: M Tris-HC1, mM sodium citrate, 1 mM EDTA, 1 % sodium
dodecyl sulphate (SDS). Take 10 ml of 1 M Tris-HC1 (pH , gr of anhydrous EDTA (pH , 10 gr SDS, gr of
sodium citrate, and adjust pH to . Make up to 1 liter with distilled water. Autoclave 15 min at 15
TE Buffer, pH : Take 5 ml of 1 M Tris-HCl, pH , 2 mL of M EDTA, pH 8, and make up to 1 liter with
distilled water. Adjust pH to and autoclave 15 min at 15.
Chloroform prechilled to 4°C.
Ethanol (100%) prechilled to -20°C.
Procedure of DNA Extraction
Before starting DNA extraction, liquid blood venogects should be shake gently by rotating blood
mixer (vortex)
1. Pour 500 μl of blood into a ml eppendorf tube and add 1000 μl of red cell lysis buffer.
2. Shake microfuge tube gently (up to homogenizing), then spin for 2 minutes at 7000 rpm.
3. Discard supernatant and repeat steps 1-3 two or three more times to remove hemoglobin. It is
important to breakdown the pellet by vortexing and rinses it well in red blood cell lysis buffer in order
to clean the white blood cells from residual of hemoglobin.
4. Placing the tube on tissue paper for few seconds downward. Be careful from cross-contamination
between different samples.
5. Add 400 μl of nucleic lysis buffer to eppendorf tube. Note: if the pellet formed, you must pipette
the pellet up to dissolve it.
6. Add 100 μl of saturated NaCl (5M) and 600 μl of chloroform to eppendorf tube and mix on a
rotating blood mixer at room temperature then spin it for 2 minutes at 7000 rpm.
7. Transfer 400 μl of supernatant to a new ml tube.
8. Add 800 μl of cold (-20°C) absolute Ethanol and shake it gently then vortex it. DNA should appear
as a mucus-like strand in the solution phase.
9. Spin the microfuge tube for one minute at 12000 rpm to precipitate, then discard supernatant
carefully and let tube be completely dried in room temperature (Place Eppendorf tube downward on
the tissue paper).
10. Add 50μl of TE to it then vortex; keep eppendorf tube of DNA in 4°C or -20°C for later uses. We
routinely use about one μl per PCR reaction without adverse affects. DNA can be quantified and diluted
to a working concentration at this point or simply use 1 μl per PCR reaction. We expect that the yield of
this procedure be 100 to 300 ng/μl, DNA. Using the above method, high quality DNA samples from a
sheep population were extracted for gene mapping studies.