(完整版)农杆菌介导法
合集下载
农杆菌及其瞬时转化技术
具体流程简介
• 首先获得目的基因序列，将目的基因插入到表达载体中， 如pBIl2l、pMOG800等，再转化到农杆菌细胞中。目前常 用于介导转化植物的农杆菌有LBA4404、EHAl05、Gv3101、 AGLl等菌株。
• 其次，将含表达载体的农杆菌转接于液体培养基培养至对 数生长期，离心收集菌体，加入浸润缓冲液，重悬至 OD600值约为0．1～1．5，室温静置2～3 h后用于浸润。
农杆菌介导法的优缺点
• 具有操作简单、转化效率较高、重复性好、单拷贝整合、 基因沉默现象少、转育周期短、转化片段较大且插入片段 明显及实验费用低等优点。
• 农杆菌介导法也存在一些问题。首先，在自然条件下，农 杆菌只侵染双子叶植物。对于单子叶植物，虽然可以采用 人工添加酚类物质的方法，诱导农杆菌完成侵染过程，但 是单子叶植物的组织培养有一定的难度。目前，只发现20 多种单子叶植物能被农杆菌侵染。其次，植物细胞壁对农 杆菌介导转化效果有一定影响。再次，影响农杆菌转化效 率的因素较多。在设计农杆菌介导实验时，研究者要考虑 农杆菌菌株类型、质粒载体类型及两者间的匹配情况；外 植体的基因型、来源和发育状态；培养基成分及某些诱导 条件如是否加入酚类物质等。
农杆菌瞬时表达技术的原理
• 将目的基因插入载体中，转化到根癌农杆菌中，后者 经酚类化合物(如乙酰丁香酮)诱导处理，在转录水平 激活Vir区基因，真空渗透或注射使农杆菌与植株叶片 细胞接触，从而实现T-DNA转移进入植物细胞核。大 部分T- DNA 并未整合入植物基因组而是暂时存在于 核内并在植物细胞转录、翻译成分的协助下瞬时表达 T- DNA 基因, 通常在数小时后即可检测到外源基因的 表达, 并在1～2 d 内达到最高值。而少量整合进植物 染色体的T-DNA在瞬时表达中不起作用或极为微弱。
农杆菌转化法基本操作与理论-文档资料
2021/4/6
4
谢谢观看！
2021/4/6
5
专业文档最好找专业
人士起草或审核后使用， 感谢您的下载！
2021/4/6
3
三、操作方法
1、获取目的基因。用限制酶切割下目的基因。 2、基因表达载体的构建。将目的基因与载体（大多 数选用质粒）用DNA连接酶连接起来。 3、将目的基因导入受体细胞。将含目的基因的重组 质粒导入农杆菌（农杆菌为受体细胞）。 4、目的基因的检测与鉴定。用DNA分子杂交技术/分 子杂交技术/抗原-抗体杂交/个体生物学 几种方法 进行检验（根据要求选取不同方法）。 5、最后将成功表达的细胞导入植物体内，对植物体 进行个体生物学水平鉴定。
农杆菌介导转化法
2021/4/6
生物技术08-1 梁荣洪
1
一、简介
农杆菌是普遍存在于土壤中的一种革兰氏阴性细菌， 它能在自然条件下趋化性地感染大多数双子叶植物的受伤 部位，并诱导产生冠痪瘤或发状根。根想农杆菌和发根农 杆菌细胞中分别含有Ti质粒和Ri质粒，其上有一段T—DNA， 农杆菌通过侵染植物伤口进入细胞后，可将T—DNA插入 到植物基因组中。因此，农杆菌是一种天然的植物遗传转 化体系。人们将目的基因插入到经过改造的T—DNA区， 借助农杆菌的感染实现外源基因向植物细胞的转移与整合， 然后通过细胞和组织培养技术，再生出转基因植株。农杆 菌介导法起初只被用于双子叶植物中，近年来，农杆菌介 导转化在一些单子叶植物(尤其是水稻)中也得到了广泛应 用。
2021/4/6：根癌农杆菌和发根农杆菌。
根癌农杆菌能在自然条件下趋化性地感染140多种双子叶 植物或裸子植物的受伤部位，并诱导产生冠瘿瘤。引发冠瘿瘤 的原因是，Ti质粒上的T-DNA上有8个左右的基因在植物细胞内 表达，指导合成一种非常寻常的化合物冠瘿碱，进而引起转化 细胞癌变。而发根农杆菌则诱导产生发状根，其特征是大量增 生高度分支的根系。根癌农杆菌的Ti质粒和发根农杆菌的Ri质 粒上有一段T-DNA，农杆菌通过侵染植物伤口进入细胞后，可 将T-DNA插入到植物基因组中。因此，农杆菌是一种天然的植 物遗传转化体系，被誉为“自然界最小的遗传工程师”。可以 通过将目的基因插入到经过改造的T-DNA区，借助农杆菌的感 染实现外源基因向植物细胞的转移和整合，然后通过细胞和组 织培养技术，得到转基因植物。
发根农杆菌介导的原理
发根农杆菌介导的原理发根农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）是一种土壤中常见的细菌，它具有突出的农业和生物技术应用潜力。
其主要特点是能够通过转座子（T-DNA）在植物细胞中插入外来基因，从而导致植物基因组的改变，进而实现基因工程研究和农业生产中的目标。
发根农杆菌介导的原理主要包括以下几个步骤：感知、转送、整合和表达。
首先，发根农杆菌通过感知植物寄主释放的信号物质，如根尖分泌的黄酮类化合物等，刺激其由游走态变为感染态。
这种感染态的农杆菌通过菌长的分裂和导向运动，定位并寻找到适合感染的植物细胞。
然后，农杆菌利用其菌体表面的一种称为T形胞器（T-pilus）的纤毛结构来与植物细胞发生物理接触。
这一接触后，细菌病原体释放一种羧酸感应蛋白（VirA）来感应植物信号，从而激活另一种蛋白质VirG。
VirG激活后，会诱导细菌病原体转录出一组称为Vir基因的透过激素（opine）类基因。
在接触并感应植物信号之后，发根农杆菌开始将其特有的Ti质体（tumor-inducing plasmid）插入到植物细胞中。
Ti质体是一种环状不稳定的DNA结构，其中含有T-DNA片段和一些辅助基因，如辅助合成植物激素的基因、抗生素抗性基因等。
这些辅助基因的存在有助于部分研究，但在基因工程中往往被删除以减小对植物基因组的影响。
最后，T-DNA片段与发根农杆菌质体DNA经由Vir蛋白复合物共运输进入植物细胞质内，然后通过核孔运输至植物细胞核中。
一旦到达细胞核，T-DNA片段会被整合进植物基因组中的染色体DNA或质体DNA中，此过程称为整合。
整合的T-DNA片段携带的外来基因在植物基因组中以遗传方式传递给下一代细胞。
实际上，发根农杆菌感染的结果对植物有很大的多样性。
当T-DNA的插入位置不幸地落在植物编码基因上，往往会导致基因不稳定、突变、失活等不可预测的结果。
然而，在合适的条件下，这种插入可以实现对植物的有益改造，例如抗病性、抗虫性、耐逆性等。
农杆菌转化法基本操作与理论PPT课件
三、操作方法
1、获取目的基因。用限制酶切割下目的基因。 2、基因表达载体的构建。将目的基因与载体（大多 数选用质粒）用DNA连接酶连接起来。 3、将目的基因导入受体细胞。将含目的基因的重组 质粒导入农杆菌（农杆菌为受体细胞）。 4、目的基因的检测与鉴定。用DNA分子杂交技术/分 子杂交技术/抗原-抗体杂交/个体生物学 几种方法 进行检验（根据要求选取不同方法）。 5、最后将成功表达的细胞导入植物体内，对植物体 进行个体生物学容来源于网络， 如有侵权请及时联系我们删除，谢谢配合！
农杆菌介导转化法
生物技术08-1 梁荣洪
一、简介
农杆菌是普遍存在于土壤中的一种革兰氏阴性细菌， 它能在自然条件下趋化性地感染大多数双子叶植物的受伤 部位，并诱导产生冠痪瘤或发状根。根想农杆菌和发根农 杆菌细胞中分别含有Ti质粒和Ri质粒，其上有一段T—DNA， 农杆菌通过侵染植物伤口进入细胞后，可将T—DNA插入 到植物基因组中。因此，农杆菌是一种天然的植物遗传转 化体系。人们将目的基因插入到经过改造的T—DNA区， 借助农杆菌的感染实现外源基因向植物细胞的转移与整合， 然后通过细胞和组织培养技术，再生出转基因植株。农杆 菌介导法起初只被用于双子叶植物中，近年来，农杆菌介 导转化在一些单子叶植物(尤其是水稻)中也得到了广泛应 用。
二、原理
农杆菌主要有两种：根癌农杆菌和发根农杆菌。
根癌农杆菌能在自然条件下趋化性地感染140多种双子叶 植物或裸子植物的受伤部位，并诱导产生冠瘿瘤。引发冠瘿瘤 的原因是，Ti质粒上的T-DNA上有8个左右的基因在植物细胞内 表达，指导合成一种非常寻常的化合物冠瘿碱，进而引起转化 细胞癌变。而发根农杆菌则诱导产生发状根，其特征是大量增 生高度分支的根系。根癌农杆菌的Ti质粒和发根农杆菌的Ri质 粒上有一段T-DNA，农杆菌通过侵染植物伤口进入细胞后，可 将T-DNA插入到植物基因组中。因此，农杆菌是一种天然的植 物遗传转化体系，被誉为“自然界最小的遗传工程师”。可以 通过将目的基因插入到经过改造的T-DNA区，借助农杆菌的感 染实现外源基因向植物细胞的转移和整合，然后通过细胞和组 织培养技术，得到转基因植物。
农杆菌介导遗传转化原理
!
冠瘿碱代谢基因
农杆菌转化植物的过程 •植物受伤部位酚类化合物的分泌 •附着（chvA、chvB） •VirA/G的双组分系统感受受伤信号 （signal to A Pi to G） •其他Vir基因的表达 •T-DNA链的切出（VirD1+VirD2；Border to Border） •T-complex的形成 •运输（从细菌中输出、进入入植物细胞、入入核） •整合
A
B
C
PCR（A）、RT-PCR（B）和 Southern（C）鉴定结果
影响植物农杆菌转化效率的因素 •植物品种（基因型效应）； •农杆菌菌株及载体； •起始材料； •侵染所用用菌浓度（OD值）； •共培养条件(温度、时间、光照、培养基成分)； •共培养之后的筛选方方式； 等等；
农杆菌介导的 植物遗传转化
农杆菌的分类 革革兰氏氏阴性菌、杆状； 按侵染植物的后果分为： •根癌农杆菌（Agrobacterium tumefaciens） 形成冠瘿（crown gall） •发根农杆菌（Agrobacterium rhizogenes） 形成发根（hairy root）
按合成/代谢冠瘿碱（Opine）的种类，根癌农杆菌分为 ： •章⻥鱼碱（Octopine）型 •胭脂碱（Nopaline）型 •农杆碱（Agropine）型
The Plant Cell, Vol. 18, 3350–3352
冠瘿病的害处： 苗木木感病后发育受阻；生生⻓长缓慢；植株矮小小；严重 时叶片片萎蔫、早衰，甚至至死亡； 大大树受害后树势衰弱，生生⻓长不良，提前落叶，果实 变小小，树龄缩短。主干受害降低材质及工工艺价值。
农杆菌能够导致植物产生生冠瘿病的原因： Ti（Ri）质粒
•T-complex的转运 通过细菌细胞壁上由11个VirB蛋白白和VirD4组成的通 道从农杆菌向外输出
农杆菌转化原理及技术
农杆菌侵染过程
❖ 损伤的植物细胞产生植物酚类作为农杆菌的侵染信号;
❖ 这些化学诱导物透过农杆菌的细胞膜,活化virA和 virG 基因,再诱导Vir区的其他基因;
❖ Vir基因的活化,作用于T-DNA的加工及T-DNA的转移; ❖ T-DNA进入植物细胞后整合到核DNA上; ❖ T-DNA在植物细胞中表达产生冠瘿碱及植物激素; ❖ 农杆菌Ti质粒上有专一性的冠瘿碱分解酶基因(ocs),该基
❖ 5.愈伤组织的筛选
❖ 将愈伤转移至选择培养基筛选抗性愈伤，每两周转 接1次。
抗性愈伤
非抗性愈伤
❖ 6.抗性愈伤组织的继代与植株的再生
❖ 每两周将愈伤转移至新选择培养基上，约需三周即 可见瘤状鲜黄色抗性愈伤从褐化干瘪的愈伤中长出。 待愈伤长大后挑选抗性愈伤的一部分转移至分化培 养基上。2周后愈伤开始转绿，3周后即可长出幼芽， 随后根也长出。将幼苗移至生根培养基上，每培养 瓶1个克隆。待幼苗生根长成后，移出培养瓶，洗 净根上的培养基后，移至温室盆栽。
❖ 1.诱导培养基：NB+2,4-D2 mg·L-1 ；pH 5.8-5.9。 ❖ 2.预培养培养基：NB+2,4-D2 mg·L-1 ；pH 5.8-5.9。 ❖ 3.共培养培养基：NB+2,4-D2 mg·L-1 +AS100 µM·L-1 ；pH 5.2。 ❖ 4.选择培养基：NB+2,4-D 2mg·L-1 + 羧苄青霉素 250mg·L-1 + Hyg
+ cytokinin
This procedure is easy for dicotyledone plants
(legumes etc)
Agrobacterium tum efaciens
根癌农杆菌
21
根瘤菌科，农杆菌属
（Agrobacterium）：
——革兰氏阴性菌，侵染植物伤口进 入细胞后，将T-DNA插入植物基因 组中，导致植物产生冠瘿瘤或毛状 不定根，干扰植物的正常生长
－根癌农杆菌（A. tumefaciens）
Ti质粒(tumor-inducing plasmid) （广泛使用）
纯化和稳定遗传 －不需要特殊的专用设备
缺点： －只能以T-DNA插入的方式导入寄主细胞，没
有方向性
33
也称微弹轰击法：将外源DNA包 被在微小的金粒或钨粒表面，然后 在高压的作用下微粒被高速射入受 体细胞或组织。微粒上的外源 DNA进入细胞后，整合到植物染 色体上，从而实现基因的转化。
可将基因枪分为三种类型： 第一类是以火药作为动力； 第二类是以高压气体作为动力； 第三类是以高压放电作为动力。
14
杀虫晶体蛋白的杀虫作用机理
当昆虫吞食后，ICP在昆虫中肠的碱性消化液和胰蛋 白酶作用下，变成有活性的毒蛋白，并与昆虫中肠 上皮细胞上的特异性受体结合，全部或部分嵌合于 细胞膜中形成离子通道，造成膜穿孔，细胞渗透平 衡受到破坏，代谢终止，昆虫停止进食，最后脱水 死亡。
由于ICP要形成有活性的毒蛋白，必须同时具备碱性 条件和特定的蛋白酶才能产生，因此人畜不受影响。
34
基因枪
35
1) 提高植物的农业价值（产量、品质、抗性）和园艺 价值（花色、花形、花期），eg. 抗虫棉、转基因 矮牵牛等；
2) 作为生物反应器生产某些重要蛋白质和次生代谢物 质，eg. 生长激素、干扰素、白介素-2、 乙肝疫苗、表皮 生长因子等；
3) 研究基因在发育及其他生理生化过程与代谢途径中 的作用
13
Bt能杀死宿主昆虫主要靠其芽孢和毒素（杀虫晶体蛋白， Bt）。
根瘤菌科，农杆菌属
（Agrobacterium）：
——革兰氏阴性菌，侵染植物伤口进 入细胞后，将T-DNA插入植物基因 组中，导致植物产生冠瘿瘤或毛状 不定根，干扰植物的正常生长
－根癌农杆菌（A. tumefaciens）
Ti质粒(tumor-inducing plasmid) （广泛使用）
纯化和稳定遗传 －不需要特殊的专用设备
缺点： －只能以T-DNA插入的方式导入寄主细胞，没
有方向性
33
也称微弹轰击法：将外源DNA包 被在微小的金粒或钨粒表面，然后 在高压的作用下微粒被高速射入受 体细胞或组织。微粒上的外源 DNA进入细胞后，整合到植物染 色体上，从而实现基因的转化。
可将基因枪分为三种类型： 第一类是以火药作为动力； 第二类是以高压气体作为动力； 第三类是以高压放电作为动力。
14
杀虫晶体蛋白的杀虫作用机理
当昆虫吞食后，ICP在昆虫中肠的碱性消化液和胰蛋 白酶作用下，变成有活性的毒蛋白，并与昆虫中肠 上皮细胞上的特异性受体结合，全部或部分嵌合于 细胞膜中形成离子通道，造成膜穿孔，细胞渗透平 衡受到破坏，代谢终止，昆虫停止进食，最后脱水 死亡。
由于ICP要形成有活性的毒蛋白，必须同时具备碱性 条件和特定的蛋白酶才能产生，因此人畜不受影响。
34
基因枪
35
1) 提高植物的农业价值（产量、品质、抗性）和园艺 价值（花色、花形、花期），eg. 抗虫棉、转基因 矮牵牛等；
2) 作为生物反应器生产某些重要蛋白质和次生代谢物 质，eg. 生长激素、干扰素、白介素-2、 乙肝疫苗、表皮 生长因子等；
3) 研究基因在发育及其他生理生化过程与代谢途径中 的作用
13
Bt能杀死宿主昆虫主要靠其芽孢和毒素（杀虫晶体蛋白， Bt）。
植物组织培养：第十三章 植物遗传转化
• 在农杆菌侵染外植体前进行预培 养可以减轻伤害胁迫，调整细胞状 态。
• 接种时所用菌液浓度和侵染时间 是影响转基因植株再生的关键因素 之一。
• 共培养：接种菌体后的外植体培养 在诱导愈伤组织或不定芽固体培养基 上，在外植体细胞分裂、生长的同时， 农杆菌在外植体切口面也增殖生长， 两者共同培养的过程称为～。
• Horsch等(1985)首创叶盘法，用根 癌农杆菌感染烟草叶片外植体，获得 了转基因烟草。
（一）生物学特性与转 化原理
1.生物学特性
• 根癌农杆菌将Ti质粒的DNA片 段、发根农杆菌将Ri质粒的DNA 片段导入植物细胞的基因组中，导 致植物发生冠瘿瘤和毛状根。
• 根据携带不同Ti质粒的根癌农杆 菌诱导的冠瘿瘤所产生的冠瘿碱类 型，将根癌农杆菌分为章鱼碱型、 胭脂碱型和农杆碱型三种根癌农杆 菌。
一、农杆菌介导法
• Ackermann(1977)，Wullems等 (1981)，De Greve等(1982)和Spano 等(1982)首先在烟草和马铃薯中由Ri质 粒和Ti质粒转化的细胞再生出植株。
• Zambryski等(1983)和De Block等 (1984)以及Horsch等(1985)分别报道 了用切去癌基因的根癌农杆菌和发根 农杆菌进行遗传转化，获得了形态正 常的转基因植物。
第十三章 植物遗传转化
• 植物遗传转化（plant genetic transformation）：是指将外源基因 转移到植物体内并稳定地整合表达与 遗传的过程。
• 农杆菌介导法、基因枪法、植株原 位真空渗入法、电击法、聚已二醇法、 花粉管通道法、显微注射法、激光微 束法、超声波法、生殖细胞浸泡法、 脂质体法
（5） Vir区基因的活化
• 大多数双子叶植物受伤后，植物 细胞会分泌某些酚类化合物，这些 酚类化合物可诱导Vir区基因活化， 使农杆菌转化成为可能。
• 接种时所用菌液浓度和侵染时间 是影响转基因植株再生的关键因素 之一。
• 共培养：接种菌体后的外植体培养 在诱导愈伤组织或不定芽固体培养基 上，在外植体细胞分裂、生长的同时， 农杆菌在外植体切口面也增殖生长， 两者共同培养的过程称为～。
• Horsch等(1985)首创叶盘法，用根 癌农杆菌感染烟草叶片外植体，获得 了转基因烟草。
（一）生物学特性与转 化原理
1.生物学特性
• 根癌农杆菌将Ti质粒的DNA片 段、发根农杆菌将Ri质粒的DNA 片段导入植物细胞的基因组中，导 致植物发生冠瘿瘤和毛状根。
• 根据携带不同Ti质粒的根癌农杆 菌诱导的冠瘿瘤所产生的冠瘿碱类 型，将根癌农杆菌分为章鱼碱型、 胭脂碱型和农杆碱型三种根癌农杆 菌。
一、农杆菌介导法
• Ackermann(1977)，Wullems等 (1981)，De Greve等(1982)和Spano 等(1982)首先在烟草和马铃薯中由Ri质 粒和Ti质粒转化的细胞再生出植株。
• Zambryski等(1983)和De Block等 (1984)以及Horsch等(1985)分别报道 了用切去癌基因的根癌农杆菌和发根 农杆菌进行遗传转化，获得了形态正 常的转基因植物。
第十三章 植物遗传转化
• 植物遗传转化（plant genetic transformation）：是指将外源基因 转移到植物体内并稳定地整合表达与 遗传的过程。
• 农杆菌介导法、基因枪法、植株原 位真空渗入法、电击法、聚已二醇法、 花粉管通道法、显微注射法、激光微 束法、超声波法、生殖细胞浸泡法、 脂质体法
（5） Vir区基因的活化
• 大多数双子叶植物受伤后，植物 细胞会分泌某些酚类化合物，这些 酚类化合物可诱导Vir区基因活化， 使农杆菌转化成为可能。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
1981年，Ooms et al.发现Ti质粒上有致瘤区(virulence region)，Vir区。
Ti质粒
Ti质粒是根癌农杆菌 细胞核外存在的一种 环状双链DNA分子， 长度约200kb，平均 周长54.1－75 .4 um， 分子质量为（90－ 150）×106 Da。在温 度低于30℃的 条件下， Ti质粒可稳定地存在 于根癌农杆菌细胞内。
的冠瘿碱类型分为三类：章鱼碱(octopine)类 胭脂碱(nopaline)类 农杆碱（agropine） 类。
Ti质粒携带着既能分解又能合成这些化合物的酶类和相应 基因，然而冠瘿碱合成基因却不能在根癌农杆菌中表达， 它们只有进入植物细胞后才能表达，Ti质粒上的冠瘿碱分 解基因产物却能分解冠瘿碱，为宿主细胞提供能源、氮源 和碳源。
子的刺激，Ti质粒vir区毒性
基因被激活和表达。
目前已经发现9种信号因子，均为水溶性酚类化合物。 其中乙酰丁香酮（acetosyringone，AS）和羟基乙酰 丁香酮（OH-AS）的作用较强，儿茶酚、原儿茶酚、没 食子酸、焦性没食子酸、二羟基苯甲酸、香草酚和对羟 基苯酚处理农杆菌时也对Vir区的基因表达起促进作用。
脂碱型根癌农杆菌Ti质粒中TDNA的左右两侧是一段24bp 的重复序列,构成T-DNA的边 界序列(border sequence), 分别称为左边界(left border,LB)和右边界(right border,RB).在某些章鱼碱型 根癌农根癌农杆菌Ti质粒中TDNA是以两个分开的独立片 段形式存在，即T-DNA左边 区段和T-DNA右边区段。研 究表明，插入在T-DNA边界 序列之间的任何DNA都可被 转到植物染色体中。因此Ti质 粒可用做外源目的基因的载 体。
农杆菌介导转化法
农杆菌是普遍存在于土壤中的一种革兰氏阴性细菌， 它能在自然条件下趋化性地感染大多数双子叶植物的受伤 部位，并诱导产生冠瘿瘤或发状根。
农杆菌 感染柳树
产生 冠瘿瘤
原理： 根癌农杆菌和发根农杆菌细胞中分别含有Ti质粒和Ri
质粒，其上有一段T-DNA，农杆菌通过侵染植物伤口 进入细胞后，可将T-DNA插入到植物基因组中。
Story 冠瘿瘤病：双子叶植物经常发生，因肿瘤着生地面在近地面
的根茎交界处，形似帽状而得名。 1907年， Smith & Townsent 农杆菌诱发冠瘿瘤病。 1947年， Braun et al. 证实俩者的关系，但发现有的菌株不
致病。提出了假说：tumour-inducing principle,TIP.肿瘤 诱导因子 。 60’s , 肿瘤组织中含高浓度的氨基酸（octopine , nopaline） 总称冠瘿碱（opine) 。 Petit et al.证实肿瘤组织 合成的冠瘿碱取决于菌株，而且菌株能专一地利用 冠瘿碱作为菌株生存的唯一的碳源和氮源。(证实了TIP)
区左侧，包含义个毒性遗传点（virA、virＢ、virC、 virＤ、virＥ和virG）。
vir基因的控制着Ｔ－ＤＮＡ的转移。
virＥ virＤ virC virG virＢ virA
植物细胞受伤后，细胞壁破 裂，分泌物中含有高浓度的 创伤诱导分子（酚类化合 物）：如乙酰丁酮 （acetosyringone，AS）和 α-羟基酰丁香酮（αhydroxacetosyringone， OH-AS）。 根癌农杆菌对这一类物质具 有趋化性，在植物细胞表面 附着后，受这些创伤诱导分
Hale Waihona Puke T-DNA 区域中的 这 些 基因只有在T-DNA插入 到植物基因组后才能激 活表达. 植物生长素和细胞分裂 素,可调节植物细胞的生 长和发育,它们的过量表 达刺激植物细胞大量快 速增长而形成冠瘿。
冠瘿碱也是在细胞内合 并成分泌出来的,构成根 癌农杆菌生长所须的碳 源和氮源.
Vir区
Vir区（Vir-region），即毒性区，其长度约为35kb。 它们控制根癌农杆菌附着于植物细胞和Ti质粒进入细胞 有关部位，与感染后冠瘿形成有关。Vir区位于T-DNA
1974年，Zaenen et al, Schell, Van Larebeke et al. 从致瘤农杆菌中分离出一类巨大的质粒 (tumor inducing plasmid)，称为Ti质粒。 Ti=TIP
1977年，Chilton et al.分子杂交技术证实肿瘤细胞中存 在外源的DNA ,与Ti质粒的DNA有同源性，是整 合到了植物染色体的农杆菌质粒DNA片段， T- DNA (transferred DNA),其内有致瘤和冠瘿 碱合成酶等基因。
长度：160-250 kb 6大功能区： 1)致癌区，这个区主要合成植物
生长素和细胞分裂素； 2)冠瘿碱合成区； 3)冠瘿碱分解区； 4)Ti质粒接合转移区(tra)； 5)毒性区（Vir）； 6)DNA复制区（Rep）。
T-DNA
在致癌区和冠瘿碱合成区的两侧 存在着一个24 bp直接重复序列， 由这三部分所构成的DNA区域叫 做T-DNA， 插入植物染色体中的Ti质粒片段 只有T-DNA。 由于T-DNA插入植物细胞染色体 中的位置不相同的，因此植物染 色体上可能并没有可供T-DNA插 入的专一性DNA序列。
Ti质粒除上述上述诱导受侵染的植物组织产生冠瘿瘤 外， 还具有以下几种重要功能：
赋予根癌农杆菌附着于植物细胞的能力； 赋予根癌农杆菌分解代谢冠瘿碱的能力； 根癌农杆菌的寄主植物范围； 决定所诱导的冠瘿形态和冠瘿碱的成分； 参与寄主细胞合成植物激素吲哚乙酸和一些细胞分裂素 的代谢活.
1) Ti质粒的结构 来自于不同野生型根癌农杆菌的Ti质粒可根据其产生
因此，农杆菌是一种天然的植物遗传转化体系。人们 将目的基因插入到经过改造的T-DNA区，借助农杆菌的 感染实现外源基因向植物细胞的转移与整合，然后通过 细胞和组织培养技术，再生出转基因植株。
农杆菌介导法起初只被用于双子叶植物中，近年来， 农杆菌介导转化在一些单子叶植物（尤其是水稻）中也 得到了广泛应用。
Ti质粒
Ti质粒是根癌农杆菌 细胞核外存在的一种 环状双链DNA分子， 长度约200kb，平均 周长54.1－75 .4 um， 分子质量为（90－ 150）×106 Da。在温 度低于30℃的 条件下， Ti质粒可稳定地存在 于根癌农杆菌细胞内。
的冠瘿碱类型分为三类：章鱼碱(octopine)类 胭脂碱(nopaline)类 农杆碱（agropine） 类。
Ti质粒携带着既能分解又能合成这些化合物的酶类和相应 基因，然而冠瘿碱合成基因却不能在根癌农杆菌中表达， 它们只有进入植物细胞后才能表达，Ti质粒上的冠瘿碱分 解基因产物却能分解冠瘿碱，为宿主细胞提供能源、氮源 和碳源。
子的刺激，Ti质粒vir区毒性
基因被激活和表达。
目前已经发现9种信号因子，均为水溶性酚类化合物。 其中乙酰丁香酮（acetosyringone，AS）和羟基乙酰 丁香酮（OH-AS）的作用较强，儿茶酚、原儿茶酚、没 食子酸、焦性没食子酸、二羟基苯甲酸、香草酚和对羟 基苯酚处理农杆菌时也对Vir区的基因表达起促进作用。
脂碱型根癌农杆菌Ti质粒中TDNA的左右两侧是一段24bp 的重复序列,构成T-DNA的边 界序列(border sequence), 分别称为左边界(left border,LB)和右边界(right border,RB).在某些章鱼碱型 根癌农根癌农杆菌Ti质粒中TDNA是以两个分开的独立片 段形式存在，即T-DNA左边 区段和T-DNA右边区段。研 究表明，插入在T-DNA边界 序列之间的任何DNA都可被 转到植物染色体中。因此Ti质 粒可用做外源目的基因的载 体。
农杆菌介导转化法
农杆菌是普遍存在于土壤中的一种革兰氏阴性细菌， 它能在自然条件下趋化性地感染大多数双子叶植物的受伤 部位，并诱导产生冠瘿瘤或发状根。
农杆菌 感染柳树
产生 冠瘿瘤
原理： 根癌农杆菌和发根农杆菌细胞中分别含有Ti质粒和Ri
质粒，其上有一段T-DNA，农杆菌通过侵染植物伤口 进入细胞后，可将T-DNA插入到植物基因组中。
Story 冠瘿瘤病：双子叶植物经常发生，因肿瘤着生地面在近地面
的根茎交界处，形似帽状而得名。 1907年， Smith & Townsent 农杆菌诱发冠瘿瘤病。 1947年， Braun et al. 证实俩者的关系，但发现有的菌株不
致病。提出了假说：tumour-inducing principle,TIP.肿瘤 诱导因子 。 60’s , 肿瘤组织中含高浓度的氨基酸（octopine , nopaline） 总称冠瘿碱（opine) 。 Petit et al.证实肿瘤组织 合成的冠瘿碱取决于菌株，而且菌株能专一地利用 冠瘿碱作为菌株生存的唯一的碳源和氮源。(证实了TIP)
区左侧，包含义个毒性遗传点（virA、virＢ、virC、 virＤ、virＥ和virG）。
vir基因的控制着Ｔ－ＤＮＡ的转移。
virＥ virＤ virC virG virＢ virA
植物细胞受伤后，细胞壁破 裂，分泌物中含有高浓度的 创伤诱导分子（酚类化合 物）：如乙酰丁酮 （acetosyringone，AS）和 α-羟基酰丁香酮（αhydroxacetosyringone， OH-AS）。 根癌农杆菌对这一类物质具 有趋化性，在植物细胞表面 附着后，受这些创伤诱导分
Hale Waihona Puke T-DNA 区域中的 这 些 基因只有在T-DNA插入 到植物基因组后才能激 活表达. 植物生长素和细胞分裂 素,可调节植物细胞的生 长和发育,它们的过量表 达刺激植物细胞大量快 速增长而形成冠瘿。
冠瘿碱也是在细胞内合 并成分泌出来的,构成根 癌农杆菌生长所须的碳 源和氮源.
Vir区
Vir区（Vir-region），即毒性区，其长度约为35kb。 它们控制根癌农杆菌附着于植物细胞和Ti质粒进入细胞 有关部位，与感染后冠瘿形成有关。Vir区位于T-DNA
1974年，Zaenen et al, Schell, Van Larebeke et al. 从致瘤农杆菌中分离出一类巨大的质粒 (tumor inducing plasmid)，称为Ti质粒。 Ti=TIP
1977年，Chilton et al.分子杂交技术证实肿瘤细胞中存 在外源的DNA ,与Ti质粒的DNA有同源性，是整 合到了植物染色体的农杆菌质粒DNA片段， T- DNA (transferred DNA),其内有致瘤和冠瘿 碱合成酶等基因。
长度：160-250 kb 6大功能区： 1)致癌区，这个区主要合成植物
生长素和细胞分裂素； 2)冠瘿碱合成区； 3)冠瘿碱分解区； 4)Ti质粒接合转移区(tra)； 5)毒性区（Vir）； 6)DNA复制区（Rep）。
T-DNA
在致癌区和冠瘿碱合成区的两侧 存在着一个24 bp直接重复序列， 由这三部分所构成的DNA区域叫 做T-DNA， 插入植物染色体中的Ti质粒片段 只有T-DNA。 由于T-DNA插入植物细胞染色体 中的位置不相同的，因此植物染 色体上可能并没有可供T-DNA插 入的专一性DNA序列。
Ti质粒除上述上述诱导受侵染的植物组织产生冠瘿瘤 外， 还具有以下几种重要功能：
赋予根癌农杆菌附着于植物细胞的能力； 赋予根癌农杆菌分解代谢冠瘿碱的能力； 根癌农杆菌的寄主植物范围； 决定所诱导的冠瘿形态和冠瘿碱的成分； 参与寄主细胞合成植物激素吲哚乙酸和一些细胞分裂素 的代谢活.
1) Ti质粒的结构 来自于不同野生型根癌农杆菌的Ti质粒可根据其产生
因此，农杆菌是一种天然的植物遗传转化体系。人们 将目的基因插入到经过改造的T-DNA区，借助农杆菌的 感染实现外源基因向植物细胞的转移与整合，然后通过 细胞和组织培养技术，再生出转基因植株。
农杆菌介导法起初只被用于双子叶植物中，近年来， 农杆菌介导转化在一些单子叶植物（尤其是水稻）中也 得到了广泛应用。