分子生物学实验技术实验内容

2006年《分子生物学实验技术》实验内容

一、RT-PCR

（一）总RNA的提取

实验安排：

每两人抽提一管。为了使操作同步以节省时间，各组样品请一起离心。

操作步骤：

1、将100μl液体样品加入1.5ml Ep管中，再加入900μl冰预冷的LS-Biotragents TM（苯酚和异硫氰酸胍的混合物）。

2、将样品剧烈混合后，在室温放置5min。

3、加入200μl氯仿，颠倒Ep管混和两次，并剧烈振荡混和10s。

4、在4℃条件下，以10000×g离心15min。

5、将上层水相转移到一个新的Ep管中，加入等体积的异丙醇（Isopropanol）并混匀，

然后在4℃放置至少10min。

6、在4℃条件下，以10000×g离心15min后，小心并尽可能地去除全部上清夜。

7、用1ml 75%乙醇洗涤RNA沉淀和管壁。

8、将RNA沉淀进行干燥（不能完全干燥）处理后，用10μl无RNase污染的水（RNase-Free Water）将RNA溶解并于-20℃保存。

注意事项：

1、所有的玻璃器皿均应在使用前于180℃的高温下干烤6hr或更长时间。

2、所用的塑料材料，如吸头、离心管等需用0.1% DEPC水浸泡过夜。

3、配制的溶液应尽可能用0.1% DEPC，在37℃处理12hr以上。然后用高压灭菌除去残

留的DEPC。不能高压灭菌的试剂，应当用DEPC处理过的无菌双蒸水配制，然后经0.22μm滤膜过滤除菌。

4、操作人员需在超净工作台上操作，并戴一次性口罩、手套，实验过程中手套要勤换。

（二）反转录

实验安排：

每人做一管。

反应体系（20μl）：按下列顺序加样

反应条件：42℃ 1h

注意事项：

1、加样时，一般从体积大的开始加，样品最后加。如在一般的PCR反应体系中，应先

加水、Buffer、dNTPs、引物，最后加酶和模板。

2、液体应直接加到管底，且每加一种试剂后应更换新的吸头。

3、加完所有试剂后，应用手指轻弹混匀，然后低速离心数秒以收集管壁上沾有的液体。

4、酶类试剂应放置在冰盒上取用，用完后立即放回-20℃，以防酶失活。

（三）PCR

实验安排：

每人做一管。

反应体系（50μl）：按下列顺序加样

反应程序：

预变性94℃2min

变性94℃30s

退火50℃45s

延伸72℃1min

30 cycles

终延伸72℃10min

PCR产物的检测：琼脂糖凝胶电泳

1、电泳缓冲液TBE(10×)的配制：

称取Tris-base 54g，硼酸27.5g，并加入0.5M EDTA(pH8.0) 20ml，定溶至1000ml。

2、1.5%琼脂糖凝胶的配制：

称取1.5g琼脂糖于三角瓶中，加入10ml 10×TBE缓冲液，并加水定容至100ml，加热溶解后加入5μl EB(10mg/ml)，摇匀后倒入插有梳子的电泳槽，待其凝固后拔去梳子即可用于电泳。

3、电泳检测：

取PCR产物5μl与Loading Buffer 1μl混合，加入到琼脂糖凝胶点样孔中，同时在样品孔旁加入5μl DL2000 DNA Marker作对照，以100V电压，50mA电流进行电泳，约15min后于紫外灯下观察结果。

注意事项：

1、EB有致癌性，电泳操作需戴手套进行。

2、禁止将盛有EB的器皿随意乱放，且不要戴有EB污染的手套随意拿其它无EB的试

剂或仪器。

（四）PCR产物的纯化

实验安排：

每两人的PCR产物合并后作为一管，用PCR产物回收试剂盒（E.Z.N.A. Gel Extraction Kit）回收目的DNA。

操作步骤：

1、PCR产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳后，切下凝胶中含目的条带的胶粒，放入预先称好

重量的空1.5ml Ep管中。

2、将装有胶粒的Ep管放在电子天平上再次称重，计算胶粒的重量。

3、按1g胶加1ml的量加入Binding Buffer，置于55℃－65℃水浴中约7min，其间要摇

动Ep管2－3次，使胶粒完全溶解。

4、将上述溶胶液加入到HiBind spin-column中，10000×g离心1min，弃去收集管中的

液体。

5、加入300μl Binding Buffer，10000×g离心1min，弃去收集管中的液体。

6、加入750μl SPW Buffer，静置2min，10000×g离心1min，弃去收集管中的液体。

7、重复步骤6。

8、空管10000×g离心1min，以弃去DNA回收柱中的残余液体。

9、将DNA回收柱放入新的1.5ml Ep管中，并加入30μl DNA Elution Buffer至膜的中央，

10000×g离心1min，以收集纯化的DNA，经琼脂糖凝胶电泳检测后于－20℃保存。

注意事项：

1、电泳时应换用新配制的TBE buffer，否则会由于电泳缓冲液pH升高而降低DNA的

产量。

2、在切下含目的DNA的凝胶时，要衬以干净的塑料薄膜（如一次性手套），使用无DNA

污染的新刀片，其目的在于防止外源DNA的污染。

3、切胶过程要尽可能短，防止DNA在紫外线下长时间暴露引起突变，且要把含有目的

DNA的胶块尽可能小的切下，以利于后续步骤的进行。

4、DNA的洗脱效率与Elution Buffer的pH有关，因此用ddH2O洗脱DNA时，应调节

ddH2O的pH值至8.0。

二、基因的克隆

（一）DNA片断与载体的连接

本实验做PCR回收产物与pMD-18T载体的连接，应用TaKaRa公司的试剂盒进行。

TA克隆原理：

利用Taq酶能够在PCR产物的3’末端加上一个非模板依赖的A，而T载体是一种带有3’T突出端的载体，在连接酶作用下，可以快速地、一步到位地把PCR产物直接插入到质粒载体的多克隆位点（MCS）中，主要用于PCR产物的克隆和测序。

实验安排：

每两人做一管。