环境微生物检验原始记录(沉降菌)
关于食品生产企业环境监测沉降菌(空气落菌)和涂抹试验(接触面)的浅见
关于食品生产企业环境监测沉降菌（空气落菌）和涂抹试验（接触面）的浅见各位看官，GB 14881 明确了作为食品生产企业应定期监测生产环境的要求，但是食品相关的检测标准相当匮乏。
在此整理了部分可参考标准及一些个人想法和众伙伴交流，不当疏失之处敬请指正。
首先列举一下参考标准：1、GB 15979-2002 一次性使用卫生用品卫生标准附录E （沉降菌和涂抹）2、GB 15982-2012 医院消毒卫生标准附录A A1-4 （沉降菌和涂抹）3、GB/T 18204.3-2013 公共场所卫生检验方法第3 部分：空气微生物（沉降菌）4、GB/T 16294-2010 医药工业洁净室(区)沉降菌的测试方法（沉降菌）5、SN/T 4426-2016 出口食品加工表面卫生取样方法（涂抹）6、GB 14934-2016 食品安全国家标准消毒餐（饮）具（涂抹）7、GB 31641-2016 食品安全国家标准航空食品卫生规范（周期和限值）其次，沉降菌分为细菌和真菌，细菌可以选择PCA、TSA 等非选择性计数培养基；真菌可以选择孟加拉红、马铃薯葡萄糖、SDA 等适合真菌类计数培养基；且培养条件和日常其他菌落总数、霉菌微生物实验条件保持一致为妥，可以不必要再进行其他温度的校准工作，或者增加培养设备；第四，涂抹有接触碟法和棉拭子法，接触碟法适合面积大较平整规则的接触面取样，棉拭子法适合设备角落、人员手部等不平整不规则接触面的取样；然后是检测结果的表达，无论是取样25cm²，整只手，均可以自己定义最终表示单位，例：CFU/cm²、CFU/25cm²、CFU/手，这是菌落总数的单位，下面说说大肠菌群。
大肠菌群从GB 4789.3 来看有平板计数法也有MPN 法（多管发酵法、最大可能数法）据我了解很多企业采样后沿袭老一套使用MPN 进行后续检验，也有人使用平板法，觉得平板法不用那么多试管比MPN 简便。
沉降菌测试方法..
沉降菌测试方法1、把ф90m m×15mm硼硅酸玻璃培养皿包在报纸里，放入恒温烤箱中加热至180℃后，干烤2小时。
2、取X克培养基放入X克蒸馏水，放入高压消毒锅中加热溶化，冷至45℃时，在无菌操作要求下将培养基注入培养皿，每皿约15ml。
3、待琼脂凝固后，将培养基平皿倒置于33℃恒温培养箱中培养48小时，若培养基平皿上确无菌落生长，即可采样用。
制备好培养皿宜在2—8℃环境中保存。
4、采样时，一般在100级层流罩中放置3个培养皿，在100000级，10000级按面积大小一般放2个培养皿。
打开培养皿盖，使培养基表面暴露0.5小时，再将培养皿盖上后倒置于恒温培养箱33℃培养，时间不小于48小时，采样点位置离地0.8m—1.5m左右。
5、将培养皿举起用肉眼直接计数，用记号笔点记然后用5—10倍放大镜检查是否遗漏，若培养皿上有2个或2个以上菌落重叠，分辨时仍以2个或2个以上菌落计数，不要漏计培养皿边缘生长菌落，并注意细菌菌落与培养基沉淀物区别。
6、沉降菌测试前，被测洁净室已消毒。
被测洁净室温湿度须达到规定要求，静压差、换气次数、空气流速必须控制在规定值内，测试状态有静态和动态两种，测试状态选择须符合生产要求，并在报告中注明测试状态。
7、测试人员必须穿戴符合环境洁净度级别工作服，静态测试时，室内测试人员不得多于2人。
测试时间对单向流100级净化房间及层流工作台，测试应在净化空调系统正常运行不少于10min后开始，对非单向流，100000级以上净化房间，测试应在净化空调系统正常运行不少于30min 后开始。
8、平均菌落数计算：M 1+M 2+M 3 平均菌落数=.........21nMnM M ++ n —培养皿总数 M 1—1号培养皿菌落数 M 2—2号培养皿菌落数 M n —n 号培养皿菌落数用平均菌落数判断洁净空气中微生物。
洁净室内平均菌落数必须低于所选定的评定标准，（100级≤1个；10000级≤3个；100000级≤10个）。
微生物检验原始记录
检样2
检样3
检样4
检样5
校核：检验：
注：1、培养箱温度36±1℃;培养时间18-24小时；2.证实试验培养箱温度36±1℃;
培养时间24-48小时.产气打+,不产气打-
2
3
4
5
测定步骤：
计算公式：
备注：
样品名称
检验项目
大肠菌群
检验依据
GB 4789.3
仪器设备名称及编号
天平，编号:烘箱，编号：高压灭菌锅，编号：培养箱，编号：
大肠菌群
执行
标准
标准要求fu/ g
样品编号
大肠菌群cfu/ g
结果
单项判定
10-1
10-2
证实
Q/YLM
0001S
n:5
c:2
m:10
M:102
微生物检验原始记录
检验编号：检验日期：年月日
样品名称
检验项目
菌落总数
检验依据
GB 4789.2
仪器设备名称及编号
天平，编号:烘箱，编号：高压灭菌锅，编号：培养箱，编号：
菌
落
总
数
样品编号
执行标准
标准要求cfu/ g
试验数据（CFU/ml,g）
结果（CFU/ml,g）
结论
空白
1
n:5
c:2
m:1000
M:10000
沉降菌的测试方法国家标准
ISC 13.040.30 C 30中华人民共和国国家标准GB/T 16294—2010代替GB/T 16294—1996医药工业洁净室（区）沉降菌的测试方法Test method for settling microbe in cleanroom (zone) of the pharmaceutical industry前言本标准参考了ISO 14698-1《洁净间以及相关环境控制第1部分：微生物控制》，ISO/TS 11133-1：2000（英文版）《食品和动物饲料的微生物学培养基制备和生产指南第1部分：实验室培养基制备的质量保证通用指南》。
本标准代替GB/T 16294-1996《医药工业洁净室（区）沉降菌的测试方法》。
本标准与GB/T 16294-1996的主要区别为：—增加了确定最少采样点数目的方法；—修改了原标准 4.8.3.2，改为“4.10.2 采用大豆酪蛋白琼脂培养基（TSA）配制的培养皿经采样后，在30℃~35℃培养箱中培养，时间不少于2d，采用沙氏培养基（SDA）配制的培养皿经采样后，在20℃~25℃培养箱中培养，时间不少于5d。
”；—本标准增加了5.8“日常监控”的内容，增加了洁净室（区）空气微生物浓度控制的纠偏限度和警戒限度的设立和如何确定取样频次的内容。
本标准的附录A、附录B是规范性附录。
本标准的附录C是资料性附录。
本标准由国家食品药品监督管理局提出并归口。
本标准起草单位：上海市食品药品包装材料测试所、中国食品药品检定研究院医疗器械检验中心。
本标准主要起草人：陆维怡、徐敏凤、冯晓明、王志敏。
本标准所代替标准的历次标本发布情况为：GB/T 16294-1996。
医药工业洁净室（区）沉降菌的测试方法1 范围本标准规定了医药工业洁净室和洁净区中沉降菌测试条件、测试方法。
本标准适用于医药工业洁净室和洁净区，无菌室或局部空气净化区域（包括洁净工作台）的沉降菌的测试和环境的验证。
微生物限度检验原始记录(国标)
无菌室：左_______ 中_______ 右_______ 净化台：左_______ 中_______ 右_______
Hale Waihona Puke 空白对照_______制备方法
项目 稀 平释 板度 数
1
检查结果
大肠菌群 （ 培 养 时 间 24 小 时 ）
1克
0.1 克
0.01 克
2
3
平均值
大肠菌群最多 可能数（100ml 或 g） 溶血性链球菌检查
活螨： □检出 □未检出
其他检验方法：
结 论□
检验者： 日 期：
(均)符合规定 □
校对者： 日 期：
(均)不符合规定
审核者： 日 期：
样品编号 批号
XX 市 XXX 有限公司
xxx-xxx
微生物限度检验原始记录
(国 标 )
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温度(℃)：
相对湿度(%)：
样品名称
规格
检验依据
生产国及厂 家名称
仪器型号及 编号
超净工作台 细菌培养（35℃） 霉菌培养（25℃）
取样量
仪器编号：0388 仪器编号：136 仪器编号：234
沉降菌落数
葡萄糖肉浸液肉汤增菌 培养时间： 24 小时
血平板 革兰氏染色 24 小时
阴性对照：
阳性对照：
供试品：
结论：□检出 □未检出
xxx-xxx
志贺氏菌检查 25 克+GN225ML 增菌 EMB 或 SS 平板 三糖铁琼脂斜面
培养时间：_______________________________________________________ 阴性对照： 阳性对照： 供试品： 结论：□检出 □未检出
微生物检测原始记录
菌落总数与大肠菌群检验原始记录
主检：年月日校核：年月日
菌落总数和大肠菌群检测原始记录
主检：年月日校核：年月日
水质微生物检验原始记录
主检：年月日校核：年月日
乳酸菌与大肠菌群检测记录
主检：年月日校核：年月日
致病菌检验原始记录
主检：年月日校核：年月日
XXXX检测有限公司
霉菌和酵母菌检验原始记录
菌落计数：
培养温度：28±1℃培养时间：年月日时--- 年月日时
主检：年月日校核：年月日
XXXX检测有限公司
商业无菌检验原始记录
共页第页
主检：日期：校核：日期：。
沉降菌检测
微生物检测一、沉降菌：用标准提及的方法收集到的活微生物粒子，通过专用的培养基，在适宜的生长条件下繁殖到可见的菌落数。
二、测试方法：采用沉降法，即通过自然沉降原理收集在空气中的生物粒子于培养基平皿（一般多采用90mm直径硼硅酸玻璃培养皿，俗称沉降碟），经若干时间，在适宜的条件下让其繁殖到可见的菌落数进行计数，以平板培养皿中的菌落数来判定洁净环境内的活微生物数，并以此来评定洁净室的洁净度。
三、采集的沉降菌为静态检测。
四、所需物料：（1）90mm培养皿：72个；（2）棉拭子：10个；五、沉降菌检测步骤：1、检测布点：生物安全柜（6个）；水平层流台（6个）；调配间（8个）；一更（3个）；二更（3个）；清洗间（3个）；2、通常的检测应在风机开启至少30min以上，紫外线照射30min，关闭紫外灯后开始采样。
3、将培养皿按采样点布置逐个放置，从内向外放置，摆放距离地面不低于60cm，培养皿暴露时间不得少于30min，不得大于4h。
操作台调配间一更/二更/清洗4、全部采样结束后，将二批杨敏倒置放置，随后送至检验科进行培养（2小时内送检）；每批均应有培养基对照实验，检验培养基本身是否污染，可每批做对照实验，与采样皿同法操作但不需暴露采样。
5、注意事项：（1）布置采样点时，至少应尽量避免尘粒较集中的回风口，采样时，测试人员应站在采样口的下风侧，并尽量减少走动；（2）采样前应仔细检查每个培养皿的质量，如发现变质、破损或污染的应剔除；（3）采样时摆放顺序为从里向外，净化台-调配间-二更-清洗间-一更。
回收培养皿时顺序相反。
（4）从检验科取来的培养皿不用时应在冷藏柜（2-8℃）保存。
（5）净化台沉降菌检测可轮流做，不必每个净化台都做检测；（6）二更和调配间均为万级，可轮流做检测；一更和清洗间为十万级，也可轮流做检测。
6、结果测定：（1）每个测点的沉降菌平均菌落数必须低于所选定评定标准的界限；（2）在静态测试时，若某测点的沉降菌平均菌落数超过评定标准，则应重新采样两次，两次结果均为合格才能判为符合；（3）洁净室沉降技术要求：洁净室沉降菌技术要求六、物体表面检测项目：1、物体表面检测：对静配中心洁净区内的各物体表面（操作台面、门把手、传递窗、大小推车、洁净服等）存在的病原微生物进行监控，达到规定标准，以保证所调配的输液质量。
车间洁净区沉降菌测试办法
4.1检验依据：GB/T16294-2010 医药工业洁净室(区)沉降菌的测试方法YY0033-2000 无菌医疗器具生产管理规范4.2方法概述：采用沉降法，即通过自然沉降原理收集空气中的生物粒子于培养基平皿，经若干时间在适宜的条件下让其繁殖到可见的菌落进行计数，以平板培养皿中的菌落数来判定洁净环境中的活微生物数，并以此来评定洁净室（区）的洁净度。
4.3仪器和设备：高压蒸汽灭菌锅恒温培养箱培养皿，¢90mm×15mm硅硼酸玻璃培养皿培养基，大豆酪蛋白琼脂培养基（TSA）或沙氏培养基（SDA）4.4准备操作：将¢90mm培养皿置于121℃湿热灭菌20min或180℃干热灭菌2h。
按比例配置营养琼脂培养基，将其装入三角烧瓶，置于121℃湿热灭菌30min。
将加热溶化并冷却至45℃，在无菌操作要求下将培养基倒入培养皿，一般15ml/皿。
4.5采样方法：将已制好的培养皿按相关要求放置，打开培养皿盖（口向下），使培养基表面暴露0.5h，再将培养皿盖盖上后倒置。
4.6培养：全部采样结束后将培养皿倒置于恒温培养箱中培养。
大豆酪蛋白琼脂培养基，培养温度34℃，培养时间：2d；沙氏培养基，培养温度：24℃，培养时间：5d。
每批培养基选定3只培养皿做对照培养。
4.6菌落计数：用肉眼直接计数，然后用5~10倍放大镜检查，有否遗漏。
若培养皿上有2个或2个以上的菌落重叠，可分辨时仍以2个或2个以上的菌落计数。
计数时一般透射光于培养皿背面或正面仔细观察，不要漏计培养皿边缘生长的菌落。
4.7结果评定：用平均菌落数判断洁净室（区）空气中的微生物。
4.8注意事项：4.8.1测试用具要作灭菌处理，以确保测试的可靠性、正确性。
4.8.2对培养基、培养条件及其他参数作详细的记录。
4.8.3采样前应仔细检查每个培养皿的质量，如发现破损或污染的应剔除。
5.0测试规则：5.1测试状态：5.1.1沉降菌测试前，被测试洁净室（区）的温湿度须达到规定的要求，静压差、换气次数、空气流速必须控制在技术指标规定值内。
沉降菌检测操作规程
沉降菌检测操作规程受控状态文件编号 ZHSS03—09—01版环境监测沉降菌检测操作规程(试行本)编制:审核:批准:发布日期: 实施日期:北京京中宏塞思生物技术有限公司北京中宏赛思生物技术有限公司受控状态沉降菌检测操作规程文件编号 ZHSS03—09—01版1. 目的规范检测人员对有洁净要求的洁净区域的沉降菌指标进行检测的操作方法的行为。
2. 范围适用于本工厂内洁净生产车间、微生物实验室和百级工作台等洁净区域。
3. 职责质量控制负责人、微生物检验员对本标准的实施负责。
4. 检测方法4.1 检测依据引用标准《医药工业洁净厂房设计规范》标准号 GB50457—2008执行标准《医药工业洁净室(区)沉降菌的检测方法》标准号 GB/T1629—20104.2 仪器设备立式压力蒸汽灭菌器、恒温培养箱、百级工作台4.3 玻璃仪器Φ90mm培养皿、三角烧杯4.3 检测药品大豆酪蛋白琼脂、纯化水4.4 培养基制备4.4.1 将大豆酪蛋白琼脂按照比例加水配置，并加热溶解。
4.4.2 将溶解后的培养基置于立式蒸汽压力灭菌器中，121?灭菌20min。
4.4.3 将灭菌合格的培养基，冷却至60?左右，移入百级工作台，以每皿约20ml 的量分装在平皿中，待凝固备用。
4.5 采样4.5.1 测试前培养皿表面严格消毒。
4.5.2 将制备好的培养皿按照采样布点图的位置放好，然后由里到外逐个打开，使培养基表面完全暴露在空气中。
4.5.3 静态测试时，培养皿暴露时间为30min以上;动态监测时，培养皿暴露时间不大于4h。
4.5.4 全部采样结束，将培养皿倒置于恒温培养箱中进行培养。
4.6 培养:采用大豆酪蛋白琼脂培养基采样结束后，在30?~35?培养箱中培养不少于2d。
4.7 每批培养基应有对照试验，检验培养基本身是否有污染。
每批做3个对照培养。
4.8 菌落计数4.8.1 用肉眼对培养皿上所有的菌落计数，然后用5~10倍放大镜检查，是否有遗漏。
沉降菌检测
洁净区微生物检测操作规程名称：洁净区微生物检测操作规程关键词：洁净区、微生物检测目的：规范洁净区微生物检测背景知识：略原理：略适用范围：100级、1万、10万、30万级洁净区环境。
1.沉降菌检测1)在万级洁净区内的关键操作点和洁净室内每周检测一次沉降菌和浮游菌；在10万级洁净区内其检测频次为每月检测一次。
30万级每季度检测一次沉降菌。
2)由微生物检测员按《养基的配制操作规程的要求配制肉汤琼脂培养基，培养皿使用Φ90mm×15mm，于121℃湿热灭菌20分钟，取出备用。
3)做好洁净区消毒工作，开启洁净区净化空调系统，正常运行不少于30分钟；对单向流如100级的净化工作台和层流罩要在净化系统运行10min后开始。
4)静态测试在除测试人员外，室内无生产人员的情况下进行，动态测试在已处于正常生产状态下进行。
5)采样点布置选用对角线法，要求布置地面四个方向，工作线上左右，关键设备顶上放置一个。
6)万级、10万级、30万级的最少采样点数可按下表确定。
在满足最少测点数的同时，还宜满足最少培养皿数，见下表7)百级区只有净化工作台下的局部范围，其面积小于10m2，因此百级区取样点至少为3个。
8)测试人员按洁净室级别规定的程序更换洁净服进入洁净区；静态测试时，室内人员不得多于2人。
9)将制备好的肉汤琼脂培养基按采样点布点位置离地0.8～1.5m处放置，打开培养皿盖，暴露30分钟，检测人员及时填写记录，记录房间温湿度，压差及测试状态。
10)盖好皿盖，将培养皿倒置于恒温培养箱内，在30～35℃中培养48小时，并用3只培养皿作对照。
11)用透射光于培养皿背面或正面仔细观察平皿上所有菌落数，要注意菌落与培养基沉淀物的区别，然后用5～10倍放大镜检查有否遗漏。
12)计算平均菌落数=（M1＋M2……＋Mn）／n，式中M1：1号培养皿菌落数，M2：2号培养皿菌落数，n：培养皿数。
13)用平均菌落数判断洁净室空气中的微生物，洁净区的平均菌落数（静态测试）：100级≤1个/皿，万级≤3个／皿，10万级≤10个／皿，30万级≤15个／皿。
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环境微生物检验原始记录（沉降菌）
编号：BF/JL YF-16A
样品名称样品编号
采样地点采样日期
检测地点检测环境T：℃RH：% 检测起止日期年月日～年月日
检测依据□《医药工业洁净室（区）沉降菌的测定方法》依据GB/T16294—1996 □《公共场所空气微生物检验方法》GB/T18204.1-2000
检测仪器□（SANYO）MLS-3750型高压蒸汽灭菌器
□ESCO-AC2-4S1生物安全柜
□（OLYMPUS）CKX31生物显微镜
□PW/10-002型台式保温培养箱
□ HPX-9052型数显电热恒温培养箱
□GMSX-280手提式高压蒸汽灭菌器
□电子天平
□pH计
□YLN-30A型菌落计数器
培养基□普通营养肉汤琼脂培养基
□营养琼脂培养基
空气菌落总数（自然沉降法）培养温度℃，时间
空白对照平皿编号
平皿菌落数
平均数：
检测结果：
注：采用直径9cm的培养基平皿，在采样点暴露min。
其它：
检测者：审核者：
保存期限：四年生效日期：2011年03月01日。