常用钛种植体表面纳米化方法

常用钛种植体表面纳米化方法 钛种植体表面纳米化是指采用特殊技术在材料表面形成纳米尺寸的结构，如纳米颗粒、纳米纤维、纳米孔或者由纳米晶体构成的膜等。表面纳米化需要在原子水平上处理物质，其制备方式也较多，下面主要介绍一下目前常用的钛种植体表面纳米化技术(见表1)。 （1） 纳米颗粒紧压法：纳米颗粒紧压法属于物理改性技术，是指在室温高压下使用压力容器将预成的纳米颗粒结合到基底材料上。纳米颗粒紧压法可以保留基底材料表面的化学成分和特性，而只改变其表面形貌、粗糙度等物理性质。Webster 等[2]在室温下使用10GPa 的压力处理5 分钟分别将的Ti 微米级（>10.5μm）、纳米级（0.5-2.4μm） 颗粒结合到基材上，最后在扫描电镜下观察基底材料表面密布着颗粒，AFM 结果显示纳米颗粒表面粗糙度远大于微米颗粒。 （2） 离子束沉积技术：离子束沉积技术（IonBeam Assisted Deposition，IBAD） 是利用等离子枪产生直流电弧将涂层材料加热熔融后用高速气流喷射到金属表面形成涂层，通常使用钛浆或羟基磷灰石进行喷涂沉积。Coelho PG 等[3] 应用离子束沉积技术在种植体表面形成了纳米晶体组成的薄膜，提升了表面的微观粗糙度。离子束沉积技术制备纳米形貌的工艺较为成熟，已经被用于商业种植体材料表面形貌的制备，例如Bicon 种植体的表面纳米处理就采用此技术(Nanotite, Bicon Inc., Boston, MA)，利用IBAD 在表面形成一层羟基磷灰石纳米沉积层。 （3） 表面化学处理：表面化学处理是目前的口腔种植体表面改性研究的热点，是指利用酸或碱处理基材表面得到纳米形貌。张波等[4] 把纯钛在60℃恒温NaOH 溶液中浸泡24 小时，在表面形成多孔网状钛酸钠凝胶，然后在600℃热处理后，凝胶层晶体化，得到100nm 厚的金红石型的TiO2 膜。但该方法获得的TiO2 涂层较薄，存在结合强度低的缺点。Wang 等[5] 使用H2O2/HCl 酸蚀纯钛在表面形成了无定形态的纳米膜结构，并且发现膜的厚度与时间基本呈线性关系。 （4） 阳极氧化及微弧氧化：阳极氧化法是将钛金属试件作为阳极，铜、石墨等作为阴极，置于相应电解液(如硫酸、磷酸、草酸等) 中，在特定条件和外加电流作用下，进行电解，使其表面形成氧化物薄膜，其成本低廉，效果明确。李荐等[6] 在20V 电压下使用0.24wt%HF 溶液作为电解液阳极氧化1 小时，在材料表面制成孔径100～110nm 的管状结构，稳定性良好。微弧氧化法是由阳极氧化改良而来，它采用较高的工作电压，将工作区域由普通的阳极氧化法区域引入到高压放电区域，可以得到厚度均匀的氧化膜，并且微弧氧化的操作时间约3~5min，较阳极氧化节省工作时间。马楚凡等[7] 采用微弧氧化技术处理纯钛试件，得到了内层致密、外层多孔的TiO2 陶瓷膜，膜层的晶粒尺寸为纳米级，材料的耐磨性、耐腐蚀性都得到相应提高。 （5） 溶胶-凝胶转化沉积技术：溶胶-凝胶转化沉积法是采用胶体化学原理实现基材表面纳米化改性或获得基材表面纳米薄膜，其主要过程是将溶胶液涂抹在钛基上凝胶化形成凝胶膜，再经烧结形成纳米级涂层。贺刚等[8] 采用溶胶凝胶法在纯钛表面构建纳米级TiO2 涂层，并采用不同温度烧结，发现在500℃烧结得到最佳的TiO2 膜，高倍电镜下发现该膜由很多树枝状相互交联成网络的纳米晶体构成。沉积技术的主要缺点是沉积层的脱落以及脱落物的毒性问题。Gutwein 和Webster [9] 研究了沉积物颗粒大小与细胞的活性及增殖能力的关系，纳米级颗粒比微米级颗粒对细胞活性和增殖的负面影响更小。 （6） 分子自组装技术：分子自组装技术是通过非共价键力使分子自发结合到特异性的基材上，分子链的末端组最终暴露最终界面上[10]。这个暴露的功能性末端组可以组装上具有成骨诱导作用或者细胞粘附诱导功能的分子，以达到不同的功能要求。Germanier Y 等[11] 在酸蚀喷砂处理过的种植体表面沉积上PEG 膜，然后将RGD 肽序列通过自组装技术结合于其上，在种植体表面形成纳米凸起，并加强了其生物学性能。 2 纳米化钛种植体表面的生物学性能 种植体在机体内接触的界面，如基膜的突触，骨组织有机胶原等都是纳米级结构。细胞粘附在材料表面时，首先由细胞粘附蛋白吸附于材料表面，它与细胞膜的整合素受体结合后能介导细胞的粘附[12]，然后才能进行分化和增殖[13]。学者们尝试种植体表面纳米化，希望能模仿天然骨组织的各个成分的形貌，使机体对种植体的反应更接近对天然骨组织的生理反应。 （1） 仿生矿化：仿生矿化类似于人体环境中骨组织沉积过程，可以反应骨组织中的磷灰石种植体对钙磷等物质。张波等[4] 采用碱热处理制得纳米晶粒TiO2 膜，在模拟体液（SBF） 中浸泡2 天后，发现碱热处理组表面大量沉积物，XRD 结果显示其成分是羟基磷灰石，而碱处理组表面几乎没有沉积物。表面纳米化后种植体的表面形成粗糙的微观结构，具有更高的表面能，更容易提供吸附溶液中Ca2+的位点，形成结晶核心。电镜观察结果显示，浸泡12 小时后磷灰石首先在材料表面纳米膜的微裂缝中沉积，再通过晶体长大扩散到整个表面。 （2） 促进蛋白粘附：种植体材料表面纳米化在导致表面微观粗糙度增加的同时，也形成特定的纳米几何形貌。材料表面粗糙度大幅度的增加为蛋白提供更多结合位点，促进蛋白粘附。Rechendorff等[14] 对比了不同粗糙度的纳米形貌上纤维蛋白原的吸附情况，发现随着表面粗糙度的增加，材料表面积增加了约20%，相应的纤维蛋白原饱和吸附值增加了大约70%。纳米化所形成的特定纳米几何形貌则可从蛋白的运动能力、吸附部位等方面影响蛋白的粘附。Galli 等[15,16] 在原子力显微镜下用局部阳极氧化技术在钛表面制备了与蛋白尺寸相似的纳米凹槽，发现F-肌动蛋白易于沿着高度1-2nm 的纳米凹槽吸附；Denis 等人[17] 将通过分子自组装技术得到纳米凸起结构，发现胶原蛋白在这种表面的吸附量改变不大，但是吸附层的形貌却不相同，这说明蛋白更容易于吸附在某些位点。 （3） 促进成骨细胞粘附：纳米形貌会直接的影响成骨细胞的粘附。陶凤娟等[18] 对材料表面塑性变形纳米化后与MC3T3 细胞共同培养后发现，3小时后未处理纯钛表面细胞呈球状，而纳米化钛板表面细胞呈扁平状，铺展充分并长入纳米空隙内；细胞粘附计数结果也显示纳米钛板组明显高于未处理组。也有学者认为，纳米形貌对细胞粘附的影响不是其单独作用的结果。Lim 等[19] 对比了在不同尺寸的纳米形貌（11-85nm） 上的成骨细胞粘附情况后认为，纳米形貌以及基底表面形貌特征与表面化学的综合因素才是对成骨细胞粘附产生了积极影响的原因。 （4） 促进成骨细胞功能：表面纳米形貌对成骨细胞的成骨活性也有一定影响。Webster 等[20] 采用颗粒紧压技术将纳米（32 nm） 和微米（2.12μm） 颗粒结合到基材上，然后与成骨细胞共培养21 和28 天后，纳米材料上形成的细胞层中碱性磷酸酶的合成和钙含量增加。Isa 等[21] 比较了在亲水性微米和纳米级形貌表面腭间质细胞的分化情况。发现在这两种表面上，间质细胞都出现成骨分化，但是，Runx2 表达只在纳米表面有所增加，此外，其他与成骨分化相关基因的表达，如BSP、OPN、OCN 也发生了上调。

种植体骨结合过程涉及多种细胞和生物分子，骨结合形成的快慢和质量取决于细胞对种植体的反应。种植体表面形貌是影响细胞行为的关键因素之一。种植体表面形貌根据尺寸大小可分为宏观的、微米级、纳米级和微纳米复合形貌。大量研究显示微米形貌有利于种植体初期骨结合[37, 38]。微米级形貌的喷砂酸蚀、微弧氧化和钛酸钙种植体表面形貌设计已作为产品应用于临床[39, 40]，且相关的临床研究显示该种植体能够诱导更快更好的骨结合，取得了较好的临床效果[41, 42]。目前主要有三个理论解释微米级表面形貌促进骨结合的现象：一是微米级形貌增加了骨接触面积；二是微米形貌能够提高种植体与骨组织之间的机械嵌合；三是Hansson和Norton提出的生物力学理论，该理论认为骨细胞为生理刺激感受器[43]，材料表面机械力学刺激通过信号通路系统传递到细胞内部，调节骨细胞行为。虽然微米形貌具有较好的生物活性，但是目前普遍认为它们直接调控种植体周围组织细胞的能力有限。 近年来研究发现，当材料表面粗糙尺寸在原子水平（1-100纳米），即纳米形貌时，该形貌相比宏观和微米形貌而言能够直接调控细胞对材料的反应。众多的研究提示，纳米结构的生物材料更接近天然骨组织形貌和化学特性，因此可能为骨组织的再生提供更加理想的生长支持环境[30]。学者们制备出纳米晶[44]、纳米羟基磷灰石[45]、电纺纳米纤维丝绸[46]和钛表面纳米结构[47, 48]，并且通过生物学实验发现细胞能够非常敏感的感知这些纳米级形貌，纳米结构能更好的诱导成骨细胞和BMSCs的碱性磷酸酶（ALP）活性、骨形成能力和细胞外骨基质矿化能力等多种生物学功能。但是，对于细胞是如何感知材料形貌并做出相应的生物学反应的机制，目前尚处于初步研究的阶段。 细胞与材料表面相互作用过程中存在复杂的分子调控机制。材料暴露在体内或是体外培养环境中不到 1 秒钟，体液或是培养液中蛋白就会选择性地吸附到材料表面形成细胞外基质蛋白层（extracellular matrix，ECM）。继而，体内纤维蛋白血凝块、血细胞、间充质干细胞或体外培养的成骨细胞会粘附聚集在 ECM 表面，然后逐渐分化成熟，形成类骨质和最终的矿化成熟的骨组织。ECM 主要含有纤连蛋白、胶原蛋白、弹性蛋白等成分。材料表面的多种性质，比如化学成分、表面能、表面张力、润湿性、表面粗糙度、结晶度、表面电荷、特性尺寸（微米级/纳米级）、弹性及其他机械性能，都会影响 ECM 中蛋白吸附的种类、折叠和功能团表型，进而影响了细胞对材料的感知和反应。ECM 除了作为结构蛋白提供细胞一个空间生长支架，还能够将材料的表面信息通过它内部蛋白的组成和构象的变化传递给细胞。成骨细胞与ECM 之间存在着复杂的相互作用，这种相互作用主要经胞膜表面的整合素受体介导。整合素是成骨细胞内外信息交流的桥梁，起到连接细胞外基质环境和细胞内信号传导纽带的作用，其表达水平和活性可随细胞功能状态发生改变。 整合素（integrin）为细胞黏附分子家族的重要成员之一，主要介导细胞与 ECM之间的相互粘附，并介导细胞与 ECM 之间的双向信号传导[49]。整合素是细胞膜表面的一组跨膜糖蛋白，由 16 种和 9 种亚基经非共价键连接构成异源二聚体。整合素受体胞外段与 ECM 中配体（如 RGD 多肽片段）结合后聚集成簇形成细胞粘附位点，与细胞外基质中的粘连蛋白形成粘着斑（focal adhesion，FA），将细胞与细胞外基质进行连接。整合素胞内段会募集一系列相关的结构蛋白（包括ɑ-辅肌动蛋白（ɑ-actin）、纽蛋白（vinculin）、踝蛋白（talin）、张力蛋白（tensin）、及吻蛋白（paxillin）等）和蛋白激酶（如粘着斑激（FAK）、Shc、Cas 和丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）等），并通过这些蛋白和蛋白酶与细胞骨架系统相连[50]。整合素与其胞内段结合的蛋白激酶根据 ECM 的构象和成分激活多条胞内信号途经，共同将细胞外环境的信号传递给细胞骨架蛋白（如 F-actin，vinculin 等），使得细胞骨架重组，并最终将外界刺激传递进入细胞核，调控与细胞的伸展、增殖、功能分化等行为相关的基因转录和表达[51]。