CCK8实验原理与步骤
cck8细胞增殖实验原理
cck8细胞增殖实验原理CCK-8细胞增殖实验原理引言：细胞增殖实验是生物学和医学研究中常用的一种实验方法，用于测定细胞的增殖能力。
CCK-8（Cell Counting Kit-8）是一种常用的细胞增殖检测试剂，通过测量细胞中的还原型CCK-8转化为溶液中的发色体，从而间接反映细胞增殖的能力。
本文将介绍CCK-8细胞增殖实验的原理及其应用。
一、CCK-8细胞增殖实验原理：CCK-8细胞增殖实验原理基于细胞代谢产物对试剂的还原作用。
CCK-8试剂中含有一种能被还原的黄色酶，当细胞活力高时，细胞内的代谢产物会将CCK-8试剂还原为有色产物。
实验原理如下：1. 细胞培养：将待测细胞接种于培养皿中，培养至适当的细胞数和状态。
2. 细胞处理：根据实际需求，对待测细胞进行处理，例如给予药物处理、基因转染等。
3. CCK-8试剂处理：将CCK-8试剂加入培养皿中，与细胞共同孵育一段时间。
4. 反应终止：孵育一段时间后，加入一种酸性溶液终止反应，阻止进一步的细胞代谢反应。
5. 测量吸光度：将培养皿中的溶液转移到微孔板中，使用酶标仪或多功能酶标仪在450 nm波长下测量吸光度。
6. 数据分析：根据吸光度值，计算细胞增殖的相对程度，比较不同处理组的细胞增殖能力。
二、CCK-8细胞增殖实验的应用：CCK-8细胞增殖实验广泛应用于生物医学研究、药物筛选、细胞毒性评价等领域。
以下列举几个常见的应用场景：1. 药物筛选：CCK-8实验可用于评估药物对细胞增殖的影响。
将细胞分为不同处理组，给予不同浓度的药物处理，通过测量吸光度值，评估药物对细胞增殖的抑制或促进作用。
2. 细胞毒性评价：CCK-8实验可用于评估化合物、材料或环境因素对细胞生存能力的影响。
通过测量吸光度值，判断待测物质对细胞的毒性程度。
3. 细胞增殖动力学研究：CCK-8实验可用于研究细胞增殖的动力学过程。
通过连续测量不同时间点的吸光度值，得到细胞增殖曲线，进一步分析细胞增殖速率和生长特性。
CCK8的原理优势及步骤
CCK8的原理优势及步骤CCK8（Cell Counting Kit-8）是一种常用的细胞活力检测试剂，其原理基于细胞代谢产物还原剂-噻唑蓝（WST-8）的还原反应。
CCK8试剂广泛应用于生物医学研究领域，用于评估细胞的活力、细胞增殖情况以及化合物的毒性。
CCK8试剂的原理是利用细胞内还原酶，将CCK8试剂中的WST-8从黄色变为紫色的水溶性产物。
细胞的活力越高，其代谢能力越强，从而可以还原更多的CCK8试剂，产生更多的紫色产物。
通过测量产生的紫色产物的光密度，可以间接评估细胞的活力。
CCK8试剂的优势有以下几个方面：1.灵敏度高：CCK8试剂对细胞活力的测定具有高灵敏度，可以检测到低浓度下的细胞增殖或细胞毒性。
2.简便快速：CCK8试剂的操作简单快捷，不需要复杂的实验步骤，可以快速获取结果。
3.高通量：CCK8试剂可以适应高通量筛选实验，可以同时处理多个样品，提高实验效率。
CCK8试剂的步骤如下：1.细胞处理：将待检测的细胞分装到96孔板中，可以根据需要处理不同的细胞组和处理条件。
2.添加CCK8试剂：按照推荐浓度，将CCK8试剂溶液加入到每个孔中，使其充分与细胞接触。
3.孵育细胞：将孔板放置在恒温培养箱中，孵育一定的时间，一般为1-4小时，具体时间可根据实验需要进行调节。
4.检测吸光度：孵育完后，使用酶标仪或多功能酶标仪来测量每个孔中的吸光度值。
通过测量吸光度，可以评估细胞的活力。
需要注意的是，CCK8试剂在测定细胞活力时会受到细胞数量和细胞代谢能力的影响，因此在使用CCK8试剂时需要结合其他实验方法和指标进行分析，以获取更准确的结果。
总结来说，CCK8试剂是一种快速、简便且高灵敏度的细胞活力检测试剂，广泛应用于细胞生物学和药物筛选等领域。
其原理是通过测量细胞产生的紫色产物的光密度来评估细胞活力。
CCK8试剂具有操作简单、快速获取结果和适应高通量筛选等优势，是细胞活力检测的重要工具。
cck8法检测细胞活力原理
cck8法检测细胞活力原理CCK8 法检测细胞活力原理在细胞生物学研究中，准确评估细胞的活力是至关重要的。
CCK8法作为一种常用的细胞活力检测方法，具有简便、灵敏、重复性好等优点。
那么，CCK8 法检测细胞活力的原理究竟是什么呢？要理解 CCK8 法的原理，首先需要了解细胞活力的概念。
细胞活力简单来说，就是细胞在特定条件下的生存和增殖能力。
具有高活力的细胞能够正常代谢、分裂和发挥其特定的功能，而活力低的细胞可能处于受损、衰老或凋亡的状态。
CCK8 试剂中的主要成分是水溶性四唑盐——WST-8。
WST-8 在电子载体 1-甲氧基-5-甲基吩嗪鎓硫酸二甲酯（1-Methoxy PMS）的作用下，能够被细胞内的脱氢酶还原为具有高度水溶性的橙黄色甲臜产物（Formazan）。
而细胞内脱氢酶的活性与细胞的活力密切相关。
在活细胞中，存在着多种脱氢酶，如线粒体中的琥珀酸脱氢酶等。
这些脱氢酶在细胞的能量代谢过程中起着关键作用。
当细胞处于健康、有活力的状态时，能量代谢活跃，脱氢酶能够有效地将 WST-8 还原为甲臜。
随着细胞活力的变化，还原生成的甲臜量也会相应改变。
细胞活力越高，参与反应的脱氢酶越多，生成的甲臜也就越多，溶液呈现的颜色就越深；反之，细胞活力越低，生成的甲臜量越少，颜色越浅。
通过使用酶标仪在特定波长（通常为 450nm）处测量溶液的吸光度值（OD 值），可以定量地反映出甲臜的生成量，从而间接反映细胞的活力。
值得注意的是，CCK8 法检测细胞活力具有诸多优点。
首先，它操作相对简便，不需要复杂的预处理步骤。
其次，检测的灵敏度较高，能够检测到较小的细胞活力变化。
此外，CCK8 试剂对细胞的毒性较小，在检测过程中对细胞的影响较小，能够更真实地反映细胞的活力状态。
然而，CCK8 法也并非完美无缺。
例如，它可能受到一些因素的干扰。
某些药物或化合物可能会直接影响脱氢酶的活性，从而导致检测结果出现偏差。
此外，如果细胞培养条件不理想，例如培养基中的营养成分不足、pH 值异常等，也可能影响细胞的活力和检测结果。
cck8法检测细胞活力的基本原理和步骤
文章标题：深度探讨CCK-8法检测细胞活力的基本原理和步骤一、引言CCK-8法是一种常用的细胞活力检测方法，广泛应用于细胞生物学、药理学和医学研究领域。
本文将从CCK-8法的基本原理和步骤入手，深入探讨这一检测方法的应用和意义。
二、CCK-8法的基本原理1. CCK-8试剂的组成和作用机制CCK-8试剂主要由WST-8和辅酶Ⅰ组成。
WST-8可被还原成橙色的水溶性甲烷化产物，其还原程度与细胞代谢活性成正比。
辅酶Ⅰ促进WST-8的还原反应，增强反应敏感度。
2. 检测原理细胞内代谢活跃时，能还原WST-8为橙色产物，其光密度与细胞数量和代谢活性成正比。
通过测定产物的吸光度，可以反映细胞的活力水平。
三、CCK-8法的操作步骤1. 细胞预处理将生长的细胞悬浮液均匀分配至不同的孔板中，使每个孔内细胞数大致相等，保证实验结果的准确性。
2. 添加CCK-8试剂向各孔内加入CCK-8试剂，使其充分接触到细胞。
待反应一定时间后，测定吸光度。
3. 数据处理和分析根据吸光度值计算细胞活力指数，进一步分析实验结果，获取所需数据。
四、CCK-8法在细胞生物学研究中的应用1. 细胞增殖实验CCK-8法可用于评估细胞增殖速率和抑制剂对细胞生长的影响，为细胞生长调控机制的研究提供重要数据支持。
2. 细胞毒性评价通过CCK-8法可以快速、准确地评估药物对细胞的毒性，为药物筛选和临床用药提供重要参考依据。
五、个人观点和总结CCK-8法作为一种快速、灵敏度高的细胞活力检测方法，对于细胞生物学和药理学研究具有重要的应用价值。
通过本文的探讨，我们对CCK-8法的基本原理和操作步骤有了更深入的理解，相信它将在未来的研究中发挥越来越重要的作用。
结语本文通过对CCK-8法的基本原理和操作步骤的深入探讨，希望能帮助读者更加全面、深入地理解这一重要的细胞活力检测方法。
我们期待更多的学者和研究人员能够运用CCK-8法，推动细胞生物学和药理学研究的发展。
cck8检测原理
cck8检测原理CCK8检测原理CCK8检测是一种常用的细胞活力检测方法，广泛应用于生物医学和药物研究领域。
CCK8（Cell Counting Kit-8）是一种胶体颗粒试剂，其原理基于细胞代谢活性与细胞数量之间的关系。
本文将介绍CCK8检测的原理及其在实验中的应用。
一、CCK8的组成与作用机制CCK8试剂由WST-8（水溶性四氮唑盐）和一种电子媒体组成。
WST-8是一种黄色水溶性化合物，当受到细胞还原酶（如酯酶和脱氢酶）的作用时，会转化为紫色的水溶性产物。
这种转化的过程是可逆的，因此可以通过测量紫色产物的光吸收度来间接反映细胞的代谢活性。
二、CCK8检测的操作步骤1. 细胞处理：将待测细胞接种在培养皿中，根据实验需要进行处理，如添加药物、病原体感染等。
2. CCK8试剂添加：将CCK8试剂按照一定比例加入培养皿中，与细胞共同孵育一定时间。
3. 吸光度测量：在固定时间点，使用酶标仪或分光光度计测量培养皿中溶液的吸光度。
4. 数据分析：根据吸光度值，计算细胞的代谢活性或细胞数量。
三、CCK8检测原理解析CCK8检测的原理基于细胞的代谢活性与细胞数量之间的关系。
细胞在正常生长状态下，具有较高的代谢活性，能够还原CCK8试剂中的WST-8，产生紫色产物。
而当细胞受到损伤或死亡时，细胞的代谢活性降低，无法有效还原WST-8，导致紫色产物的生成减少。
在CCK8检测中，测量的是细胞培养液中紫色产物的光吸收度。
光吸收度与紫色产物的浓度成正比，而紫色产物的浓度与细胞的代谢活性成正比。
因此，通过测量光吸收度可以间接反映细胞的代谢活性。
四、CCK8检测的应用CCK8检测广泛应用于细胞毒性测试、细胞增殖分析、药物筛选和细胞活力评估等领域。
例如，在细胞毒性测试中，可以通过CCK8检测方法评估药物对细胞的毒性作用；在细胞增殖分析中，可以监测细胞的增殖能力和抑制效果；在药物筛选中，可以通过CCK8检测方法筛选具有较高活性的化合物。
CCK-8实验
铺板:要减轻边缘效应，成因主要是温度效应，蒸发效应；
配药：确认药物的最佳处理方式，如溶剂的选择、稀释和过滤 的先后顺序等； 加药：孔板分组要设置空白组； 加CCK-8：不能让孔内产生气泡； 测OD：阴性组OD在1.0左右较好。
CCK-8检测
实验简介 实验原理 操作步骤 同类实验对比 实验细节
实验简介
CCK-8全称Cell Counting Kit-8，简称CCK-8试剂盒； 其基于化合物WST-8与活细胞作用发生显色反应； 广泛用于一些生物活性因子的活性检测、大规模的抗肿瘤药物 筛选、细胞增殖试验、细胞毒性试验以及药敏试验等。
实验原理
实验步骤
1. 2. 3.
4.
5. 6.
铺板：96孔板，细胞5000个/孔，培养基100ul/孔，培养24h； 配药：溶解并过滤药品，按浓度梯度用培养基稀释药品； 加药：96孔板分组后，依次加入不同浓度的药品，放置培养； 加CCK-8：每个分组加入10ul CCK-8，37℃放置0.5h-4h； 测OD：450nm，酶标仪测定孔板吸光值； 数据处理：整理数据用EXCEL做生长曲线或者用GraphPad Prism 6计算IC50。
实验专栏丨一文掌握CCK-8细胞增殖与毒性检测法，你值得了解！
实验专栏丨一文掌握CCK-8细胞增殖与毒性检测法，你值得了解！今天小编要为大家介绍的是：CCK-8实验的操作步骤和注意事项。
CCK-8，英文全称是Cell Counting Kit-8。
CCK-8试剂盒可用于简便而准确的细胞增殖和细胞毒性分析。
实验原理CCK-8试剂盒中，最主要化学药品是WST-8【化学名为2-(2-甲氧基-4-硝基苯基)-3-(4-硝基苯基)-5-(2,4-二磺酸苯)-2H-四唑单钠盐】，它在电子载体1-甲氧基-5-甲基吩嗪鎓硫酸二甲酯（1-Methoxy PMS）存在的情况下，能够被细胞线粒体内的一些脱氢酶还原成具有高度水溶性的橙黄色甲臜染料(Formazan)。
也就是说，活细胞数量越多，生成的甲臜量就越多，相应地颜色也就越深。
因此可以用这一特性直接进行细胞增殖和毒性分析：细胞增殖越快，颜色越深；细胞毒性越大，颜色则越浅。
（对于同样的细胞，颜色的深浅和细胞数目呈线性关系。
）使用酶标仪在450nm波长处测OD值，可间接性反应活细胞的数量。
是一种高灵敏度，无放射性的比色检测法。
（CCK-8实验原理）因此，CCK-8实验可用于细胞因子等诱导的细胞增殖检测，也可以用于抗癌药物等对细胞有毒试剂诱导的细胞毒性检测，或一些药物诱导的细胞生长抑制检测。
操作步骤（一）实验材料及试剂：酒精灯、移液枪、酶标仪（带有450nm滤光片）、96孔培养板、CO2培养箱、CCK-8、细胞计数板、PBS等。
（二）绘制标准曲线1.制备细胞悬液：选取生长状态良好的对数生长期细胞制作细胞悬液，并计数。
2.在96孔板中接种细胞悬液(100 μL/孔) ：按比例依次用培养基等比稀释成一个细胞浓度梯度，一般要做5-7个细胞浓度梯度（比如，稀释10倍，100倍......），每组4-6个复孔。
3.绘制标准曲线：接种后培养一定时间待细胞贴壁后，然后每100μL培养基加10μL（10%）CCK-8试剂培养一定时间后测定OD 值，制作出一条以细胞数量为横坐标，OD值为纵坐标的标准曲线。
cck8检测细胞增殖原理
cck8检测细胞增殖原理
cck8检测细胞增殖原理是利用细胞内代谢活跃性的指标来测量细胞增殖的情况。
cck8是一种水溶性试剂，它可以被细胞内的代谢酶还原成一种有颜色的产物。
这种产物在吸光度450nm的波长下可以被测量，并且与细胞数量成正比。
当细胞在培养基中得到足够的养分和生长因子时，它们会开始增殖并使用更多的代谢酶来合成DNA和蛋白质。
因此，越多的细胞意味着更多的代谢酶被产生，cck8试剂的还原量也就越多。
通过测量cck8产物的吸光度，可以确定细胞数量的增加情况。
cck8检测细胞增殖的优点在于它快速、简便、灵敏、无毒性和高通量。
但它也有一定的局限性，比如在某些细胞类型中可能会出现假阳性结果，需要结合其他实验方法进行验证。
- 1 -。
cck-8的实验原理
cck-8的实验原理CCK-8实验是一种常用的细胞活力检测方法，通过检测细胞的代谢活力评估细胞的存活情况。
CCK-8试剂由WST-8（2-(2-methoxy-4-nitrophenyl)-3-(4-nitrophenyl)-5-(2,4-disulfophenyl)-2H-tetrazolium）和一种电子传递介质（1-Methoxy PMS）组成。
WST-8是一种无色的水溶性试剂，在细胞的线粒体还原酶作用下可以被还原成有色的形式，形成不溶于水的产物，其溶解度很低。
产生的有色产物在波长为450-480nm的光波下有较强的吸光度，通过测量这个吸光度可以评估细胞的代谢活力。
CCK-8实验的操作相对简单，主要包括细胞的培养、处理试剂和测量吸光度等步骤。
下面将详细介绍实验的步骤和原理。
第一步：细胞培养在进行CCK-8实验之前，需要先培养细胞。
将细胞接种在培养皿中，培养条件根据不同的细胞类型而异。
通常情况下，细胞在37°C 的恒温培养箱中，5% CO2的湿度条件下培养24-48小时，直至细胞达到一定的密度。
第二步：处理试剂取出培养好的细胞，根据实验需要将其分组处理。
每个组别的细胞需要添加不同的处理剂，如不同浓度的药物、不同时间的刺激等。
经过处理后，细胞进一步培养一定的时间，以确保处理剂对细胞产生效果。
第三步：添加CCK-8试剂处理好的细胞培养完成后，需要添加CCK-8试剂。
将CCK-8试剂溶解在培养基中，按照一定的比例加入到培养皿中。
CCK-8试剂会与细胞内的还原酶反应，产生可溶于水的有色产物。
此时，细胞会吸收能量，转化为细胞的代谢活力。
第四步：孵育细胞添加CCK-8试剂后，需要将培养皿放入恒温培养箱，继续孵育一定的时间。
在这个过程中，CCK-8与细胞内的还原酶反应进行，产生有色产物。
产生的有色产物数量与细胞的代谢活力成正相关，代谢活力越高，产生的有色产物数量越多。
第五步：测量吸光度经过一定时间的孵育后，可以从恒温培养箱中取出培养皿。
CCK8实验
CCK8实验具体操作步骤：1.将昨日铺的96孔板拿出，在操作台上用直吸管将铺有细胞的60个孔里面的上清液全部吸掉，再加PBS200ul洗一次，最后将96孔板里面所有的液体全部吸掉。
2.96孔板加药：先加药-----再加无血清培养基-----最后再加PBS3.全部加完后，放于混匀振荡器上振荡3分钟。
4.最后放入培养箱中继续过夜培养。
兔骨髓间充质干细胞的提取与体外培养文章来源：2006-7-19 14:41:08兔骨髓间充质干细胞的提取与体外培养第二军医大学学报2000年第21卷第3期徐青镭吴海山周维江摘要目的：评价兔自体骨髓间充质干细胞作为半月板组织工程重建中种子细胞的可能性。
方法：采用体外细胞培养技术将兔骨髓间充质干细胞自骨髓血中分离、纯化和和培养，并研究其增殖及生长特征。
结果：原代培养及传代培养显示，兔自体骨髓间充质干细胞具有活跃的增殖倍增能力。
结论：兔自体骨髓间充质干细胞生物年龄较为年轻，用作半月板组织工程重建的种子细胞具有较强的可行性。
关键词：间充质干细胞；骨髓；半月板骨髓组织中除含有造血干细胞外，还含有多量的间充质干细胞（MSC）。
如同多能造血干细胞的存在赋予骨髓组织以强大的造血功能以维系血液系统的新陈代谢一样，这些MSC的存在为骨软骨组织的损伤提供了潜在的修复能力。
但是与造血干细胞相比，骨髓中MSC的含量并不丰富。
本实验拟通过体外细胞培养的方法将MSC自骨髓血中分离出来并加以纯化，并进一步在体外培养条件下研究其增殖及生长特性，从而探讨为半月板的组织工程重建提供种子细胞的可能性。
1 材料和方法1.1 兔骨髓MSC的分离取成年新西兰兔10只，6个月龄，雌雄不拘，平均体质量3.2 kg (2.8～3.7 kg）；用3%戊巴比妥钠按1 mg/kg的剂量施以全身麻醉，另用1%利多卡因于手术部位施以局麻；无菌操作下于右胫骨上端内侧部用锐性穿刺锥于骨皮质上开出一直径约2～3 mm的孔，使通达髓腔；用18号硬膜外穿刺针接5 ml注射器，内含3000 U/ml 的肝素0.1 ml，沿骨皮质上的孔穿入髓腔，抽出骨髓血约2 ml；抽出的骨髓血用平衡液洗涤两次后，离心180×g，5 min；弃去上清液，沉淀用Ham f12-10%FBS培养液重新打匀；用灭菌的0.17 mol/L饱和NH4Cl溶液按1∶5的体积比加入已重新打匀的悬液中，4℃下保留10 min，取出再离心180×g，5 min；弃去上清后，以几滴平衡液再悬浮后，用细胞计数板作细胞计数，确认有核骨髓细胞量达106～107后，即可进行原代培养接种用。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
CCK8实验
1、在96孔板中配置100μl的细胞悬液。
将培养板在培养箱预培养24小时（37℃，5% CO2）。
2、向培养板加入10μl不同浓度的待测物质。
3、将培养板在培养箱孵育一段适当的时间（例如：6、12、24或48小时）。
4、向每孔加入10μl CCK8溶液（注意不要在孔中生成气泡，它们会影响OD值的读数）。
5、将培养板在培养箱内孵育1-4小时。
6、用酶标仪测定在450nm处的吸光度。
7、若暂时不测定OD值，可以向每孔中加入10μl 0.1M的HCL溶液或者1% w/v SDS溶液，并遮盖培养板避光保存在室温条件下。
24小时内测定，吸光度不会发生变化。
PS：1% w/v SDS溶液配制方法：
组份浓度：10% (W/V)SDS
配制量：100ml
配制方法：
1.称量10g高纯度的SDS置于100-200ml烧杯中，加入约80ml的去离子水，68℃加入溶解
2.滴加浓盐酸调节pH值至7.2
3.将溶液定容至100ml后，室温保存。
注意：如果待测物质有氧化性或还原性的话，可在加CCK8之前更换新鲜培养基（除去培养基，并用培养基洗涤细胞两次，然后加入新的培养基），去掉药物影响。
当然药物影响比较小的情况下，可以不更换培养基，直接扣除培养基中加入药物后的空白吸收即可。
活力计算：
细胞活力*（％）=[A(加药)-A（空白）]/[A（0加药）-A（空白）] ×100
A（加药）：具有细胞、CCK8溶液和药物溶液的孔的吸光度
A（空白）：具有培养基和CCK8溶液而没有细胞的孔的吸光度
A（0加药）：具有细胞、CCK8溶液而没有药物溶液的孔的吸光度*细胞活力：细胞增殖活力或细胞毒性活力
CCK-8 可以用于细胞增殖和毒性分析。
其基本原理为:该试剂中含有WST-8，它在电子载体(1-Methoxy PMS)的作用下被细胞线粒体中的脱氢酶还原为具有高度水溶性的黄色甲瓒染料，生成的甲瓒物的数量与活细胞的数量成正比,因此可以用这一特性直接进行细胞增殖和毒性分析。
其使用方法在增殖和毒性试验中有所区别:
细胞增殖试验:
1.接种细胞悬液100微升于96孔板,预先置于37度,5%CO2饱和湿度的培养箱内培养
2.在每孔内加入10微升的CCK-8试剂.
3.把培养板放培养箱内1-4小时(根据细胞类型其时间有所不同)
4 在450nm波长处测定吸光值,参比波长为600nm或以上波长.
毒性分析试验:
1.接种100微升细胞悬液(5000个/孔)于96孔板
2.预先放置37度5%CO2饱和湿度培养箱培养24小时
3.加入10微升不同浓度的毒性物质到孔内培养基
4.在培养箱内培养48小时.
5.在每孔内加入10微升CCK-8试剂,在培养箱内培养1-4小时;
6在450nm波长处测定吸光值,参比波长为600nm或以上.
以上步骤摘自CCK-8的说明书,由于涉及到某些原因,我省去了上面的一些推销用语)
(内有标价,1245元/1000孔)
写在前面：
一直都像个新手，从未老道过。
所有新手的迷茫与无奈我最能体会。
看到园子里有一些同学在问有关CCK8试验的事情，当初我也和他们一样，像个被蜘蛛丝缠住头的迷茫苍蝇一头扎进园子里，期待能找到些解决谜团的只言片语。
希望我写的这些非专业文字能够帮助那些在实验室里没有前行者指点迷津的筒子们。
当然仁者见仁智者见智，我
写的只是个人实验心得，仅供参考。
欢迎大家拍砖共同进步。
实验是简单的，道路是曲折的，时间就是用来浪费的，科研就是自娱自乐使劲折腾。
我没有做过MTT实验，但其实原理及目的都是一样的（反应机理不一样）。
都说CCK8简单点而且数据更稳定，所以就用了这个试剂盒。
CCK8的说明书大家一定要认真阅读，里面很多细节的问题都有提到。
而且说明书里提供的一些关于各种细胞的种板数都很有参考价值，因为那是反复验证过的最佳数值。
但无论如何，做这个试验一定要摸条件。
你就算再懒，这个懒不得，否则你都只是在做无用功。
以下言论全部以细胞毒性试验为前提，如果你做的是促进细胞生长的药物的药效实验那就另当别论了。
摸条件包括1、种板数；2、种板后细胞的贴壁生长时间；3、加药后的孵育时间；4、CCK8试剂加入量；5、CCK8试剂加入后细胞孵育时间。
看起来很多，其实这就是一个实验。
而且都是种的空白板，也就是不加药物，只加细胞和CCK8。
1、种板数：这个要查文献，看你所用细胞别人有无做过，把范围大致找出。
记住还要参考说明书，这个很重要。
然后稀释一系列浓度种板。
首先你要观察多长时间细胞可贴壁完全，一般贴壁生长24小时。
然后还有在你的实验时间内，不同细胞数下孔内生长情况。
比如我拟定考察4天的时间，那么在4天内，细胞是刚好铺满还是堆积生长？因为每块板都会设置对照孔，也就是含有细胞的培养基+CCK8，这个数值是板上的最大数值，CCK8试验最佳OD值在1.0附近，所以这
个最大数值最好能控制在1.0左右。
我的实验经验是不要让细胞长满，一旦长满了很难去判断是否堆积生长了，对药物能否顺利进入细胞有影响此为其一，其二生长不均匀易导致孔间OD值数据偏差大，而且OD值也很大。
2、贴壁生长的时间我一般就直接让它贴壁长24h了，这个时间细胞已经贴壁完全，而且这样设置时间对自己安排实验时间也方便。
没人愿意大半夜爬起来做实验吧。
3、加药后的孵育时间，我的实验摸了3个时间，24h，48h，72h。
然后根据数据的稳定性（RSD）、OD值的范围（1.0左右）这些来选择最好的时间。
太长了就没有必要了，细胞呆在孔里几天不换液结果可想而知了。
4、CCK8试剂加入量，说明书中明确写出建议加入量为培养基体积的10%。
这里有一个问题：假设我要孔内是200微升的体系，即细胞悬液+药液+CCK8=200微升呢，还是细胞悬液+药液=200微升，CCK8不算在体系内呢。
关于这一点文献报道不一致。
本人最终采用的是后者。
5、cck8试剂加入后孵育时间，随着时间的增加，OD值就会增大。
总之原则就是把OD值控制在1.0左右。
这里我考察了0.5h、1.0h、2.0h。
再说一下关于种板设置问题。
众所周知周围一圈孔因为边缘效应都是不用来做实验的。
一般每组样品我会设置6个复孔，得到的OD值去掉最大值与最小值，其余取平均值。
我用的是排枪，会省很多力气，
但是也会增大组内误差。
这个只有通过校正移液枪和选用最适枪头了。
做这个实验我想大家遇到的最大问题应该是数据不稳定，组内数据偏差大。
讲了很多怎样摸条件，其实就一个原则，把OD值控制在1.0左右。
数据不稳定也只能通过增大样品数，借助数据处理来弥补。
还有实验操作一定要仔细小心，尽量平行操作。
能力有限，表达不清的大家凑合着看看吧。
有疑问的欢迎大家留言讨论，我们的目标是共同进步，哈哈。
补充：谢谢大家的热烈讨论。
突然想起用酶标仪检测的时候还有一些细节问题，园子里也有前辈提过。
比如孔里不能有气泡，如果有气泡，就用吸耳球吹掉，气泡会很影响检测结果。
样品板要擦拭干净，当然了，盖子一定要记得拿掉啊
补充说明：这几天有同学提出了一个问题，这个问题非常好也非常关键：将OD值控制在1.0这个说法是否有依据？
这里我还是想提醒大家一定要认真阅读试剂盒的说明书，试想一个试剂盒的上市并且作为技术手段得到认可需要经过多少试验反复验证。
我购买的是同仁化学研究所的CCK8试剂盒，说明书的P7Q23：OD 值在什么范围比较合适？答：一般情况下OD值在0.1-2.0都可以，在1.0附近比较好。
再说到自己的实验设计，酶标仪的原理其实和紫外分光光度计是一样的，所以UV上很多减小误差的注意事项在酶标仪上同样受用。
这就能够理解为什么不能有气泡，为什么要擦拭干净样品板了。
再者熟悉
UV原理的同学会了解利用紫外检测有一个最佳检测范围，超过了这个范围，数值就会呈现出不稳定，无规律。
（大家可以把自己的数据统计分析看看是不是数值控制在1.0附近更稳定。
）而更有甚者就是超出了仪器的检测范围，仪器读数为—。
我在摸条件的时候，cck8加入2.0h后检测就出现过酶标仪读不出数据的情况。