分子标记的实验原理及操作流程
分子标记技术的原理和应用
分子标记技术的原理和应用1. 简介分子标记技术是一种用于标记和检测生物分子的方法。
通过在目标分子上引入特定标记物，可以实现对这些分子进行定量、定位及特异性检测。
本文将介绍分子标记技术的原理和应用。
2. 原理分子标记技术主要通过以下步骤来实现对目标分子的标记和检测：•选择标记物：标记物通常是具有特异性的分子或结构，如荧光染料、酶、金纳米颗粒等。
根据标记物的特性和应用需求，选择合适的标记物。
•引入标记物：将选定的标记物与目标分子进行结合。
这可以通过化学反应、酶促反应或物理吸附等方法实现。
•检测标记物：使用适当的检测方法，如光谱分析、电化学方法等，对标记物进行定量或定性检测。
这些方法可以根据标记物的特性和需求选择。
3. 应用分子标记技术在许多领域都有广泛的应用。
以下是一些主要的应用领域：3.1 生物医学研究•免疫组织化学：通过标记特定抗体来检测组织中的蛋白质，用于研究疾病诊断、治疗反应和组织学研究。
•分子诊断：使用分子标记技术检测体液中的特定生物分子，如DNA、RNA和蛋白质，用于早期疾病诊断和个体化治疗。
•药物研发：利用分子标记技术对药物与靶标的相互作用进行研究，加速药物研发过程。
3.2 食品安全检测•农药残留检测：使用分子标记技术检测食品中的农药残留物，保证食品安全。
•食品成分分析：通过标记特定分子，检测食品中的成分和添加物。
3.3 环境监测•水质检测：使用分子标记技术检测水中的有害物质和污染物，保护环境和人类健康。
•大气污染监测：通过标记特定分子，检测大气中的污染物，评估空气质量。
3.4 基因组学研究•基因定位：使用分子标记技术对基因组中特定序列进行定位和研究。
•基因表达分析：通过标记RNA或蛋白质，研究基因在各个组织中的表达情况。
4. 总结分子标记技术以其高灵敏度、高特异性和高可视性等优势，在生物医学研究、食品安全检测、环境监测和基因组学研究等领域具有广泛的应用前景。
随着技术的不断发展和创新，相信分子标记技术将在未来发挥更大的作用，并为各个领域的研究和应用带来更多的突破。
高中生物分子标记实验教案
高中生物分子标记实验教案
实验目的：通过分子标记实验，掌握分子标记的原理和方法，了解如何利用分子标记技术进行生物研究。
实验材料：离心管、标记试剂、DNA溶液、电泳仪、琼脂糖凝胶板、UV灯等。
实验步骤：
1. 提取样品DNA：将待检测的样品（如甲骨文）通过DNA提取试剂盒提取出DNA溶液。
2. 标记DNA：在离心管中加入标记试剂和提取的DNA溶液，轻轻摇匀，放置一段时间进行反应。
3. 准备琼脂糖凝胶板：将琼脂糖溶液熔化后倒入凝胶板，待凝固。
4. 电泳分析：将已标记的DNA溶液加载到凝胶板上，进行电泳分析，根据标记物在凝胶板上不同位置形成的条带进行分析。
5. 结果分析：观察凝胶板上的条带图案，根据不同条带的位置和强度判断标记DNA的情况，并得出实验结论。
实验注意事项：
1. 操作过程要保持洁净，避免污染样品。
2. 操作中要注意避免标记物的接触，避免误伤。
3. 谨慎操作电泳仪，避免发生安全事故。
实验拓展：
1. 可以尝试不同的标记试剂，比较不同标记试剂的效果。
2. 可以通过改变电泳条件，比如电场强度和运行时间，观察对分子迁移的影响。
实验总结：
通过本实验，学生将掌握分子标记技术的基本原理和方法，培养实验操作能力和数据分析能力，为将来从事生物研究奠定基础。
dna分子标记技术概述
DNA分子标记技术概述1. 引言DNA分子标记技术是现代生物学和医学领域中非常重要的一项技术。
它可以通过特定的标记方法，在DNA分子上进行特异性地标记，从而实现对DNA序列的检测、定位和分析。
本文将对DNA分子标记技术进行全面、详细、完整和深入地探讨。
2. DNA分子标记技术的原理2.1 标记物选择在进行DNA分子标记之前，需要选择合适的标记物。
常用的DNA分子标记物包括荧光染料、辣根过氧化物酶标记物、生物素标记物等。
这些标记物具有不同的优势和适用范围，可以根据具体实验需求来选择合适的标记物。
2.2 标记方法DNA分子标记方法有多种，常用的包括直接标记法和间接标记法。
直接标记法是将标记物直接连接到DNA分子上，常用于荧光标记。
间接标记法是通过先引入标记物、再进行特定的反应来实现标记，常用于酶标记和生物素标记等。
2.3 标记效率和准确性DNA分子标记技术的效率和准确性是衡量其优劣的重要指标。
高效率和准确性可以保证实验结果的可靠性和准确性。
因此，在选择标记物和标记方法时，需要考虑到其标记效率和准确性，以及对实验结果的影响。
3. DNA分子标记技术的应用领域3.1 DNA测序和基因组学研究DNA分子标记技术在DNA测序和基因组学研究中有广泛的应用。
通过标记技术，可以对DNA序列进行检测和定位，从而实现对基因组的研究和分析。
3.2 分子诊断和疾病检测DNA分子标记技术在分子诊断和疾病检测中起到关键作用。
通过标记技术，可以检测和分析与疾病相关的基因或基因突变，从而实现早期诊断和治疗。
3.3 人类遗传学研究DNA分子标记技术对人类遗传学研究具有重要意义。
通过标记技术，可以进行人类遗传多样性和遗传变异的研究，为疾病发生机制和个体差异提供重要的参考和依据。
3.4 动植物遗传改良DNA分子标记技术在动植物遗传改良中有广泛应用。
通过标记技术，可以进行动植物基因分型和基因定位，为遗传改良工作提供重要的科学依据和技术支持。
3-分子标记技术原理、方法及应用
细胞学标记
植物细胞染色体的变异：包括染色体核型（染 色体数目、结构、随体有无、着丝粒位置等） 和带型（C带、N带、G带等）的变化。
优点: 能进行一些重要基因的染色体或染色 体区域定位
缺点: (1)材料需要花费较大的人力和较长 时间来培育，难度很大; (2) 有些变异难以用细 胞学方法进行检测
生化标记
主要包括同工酶和等位酶标记。分析方法是从 组织蛋白粗提物中通过电泳和组织化学染色法 将酶的多种形式转变成肉眼可辩的酶谱带型。
优点: 直接反映了基因产物差异，受环境影 响较小
缺点: (1)目前可使用的生化标记数量还相 当有限; (2)有些酶的染色方法和电泳技术有一 定难度
分子标记
主要指能反映生物个体或种群间基因组中某种 差异特征的DNA片段，它直接反映基因组DNA 间的差异，也叫DNA标记。
2/片段迁移率的变化要反映分子量的差异 ————DNA在聚丙烯酰胺凝胶上迁移率也受构象 变化影响
RFLP 基 本 步 骤
RFLP patterns in Pinus densata
RFLP
优点: 无表型效应，不受环境条件和发育阶段的影响
共显性，非常稳定 起源于基因组DNA自身变异，数量上几乎不受限制
分子标记技术原理、方法 及应用
黄健子 2011.10
一、遗传标记的类型及发展 二、几种常见分子标记的原理及方法 三、分子标记技术的应用
一、遗传标记的类型及发展
遗传标记(genetic marker):指可追踪染色体、染
色体某一节段、某个基因座在家系中传递的任何一 种遗传特性。它具有两个基本特征，即可遗传性和 可识别性；因此生物的任何有差异表型的基因突变 型均可作为遗传标记。包括形态学标记、细胞学标 记、生化标记和分子标记四种类型。
ISSR(inter-simple sequence repeat)分子标记的实验原理及操作流程
ISSR（inter-simple sequence repeat）分子标记的实验原理及操作流程ISSR（inter-simple sequence repeat）标记是一种类似RAPD，但利用包含重复序列并在3’或5’锚定的单寡聚核酸引物对基因组进行扩增的标记系统，即用SSR引物来扩增重复序列之间的区域。
其原理具体是，ISSR 标记根据生物广泛存在 SSR的特点，利用在生物基因组常出现的SSR本身设计引物，无需预先克隆和测序。
关键词：标记分子ISSRinter-simplesequencerepeatSSR引物RAPD分子标记单寡聚核酸ISSR标记ISSR（inter-simple sequence repeat）标记是一种类似RAPD，但利用包含重复序列并在3’或5’锚定的单寡聚核酸引物对基因组进行扩增的标记系统，即用SSR引物来扩增重复序列之间的区域。
其原理具体是，ISSR标记根据生物广泛存在SSR的特点，利用在生物基因组常出现的SSR本身设计引物，无需预先克隆和测序。
用于扩增的引物一般为16-18个碱基序列，由1-4个碱基组成的串联重复和几个非重复的锚定碱基组成，从而保证了引物与基因组DNA 中SSR的5’或3’末端结合，导致位于反向排列、间隔不太大的重复序列间的基因组节段进行PCR扩增。
一、实验材料不同来源的DNA(30-50ng/ul)。
二、实验设备PCR仪，PCR管或硅化的0.5ml eppendorf管，电泳装置，凝胶成像仪。
三、试剂1、ISSR引物：购买成品或根据加拿大British Columbia大学设计的ISSR引物序列（见附录）自己合成。
2、Taq酶3、10xPCR 缓冲液4、MgCl2：25mmol/L。
5、dNTP：2.5mmol/L。
四、操作步骤：1. 在25ul反应体系中，加入模板DNA 1ul (30-50ng)ISSR引物1ul (约5pmol)10xPCR Buffer 2.5ulMgCl22uldNTP 2ulTaq酶1单位（U）加ddH2O 至25ul混匀稍离心, 加一滴（约20 ul）矿物油。
分子标记技术原理方法及应用
分子标记技术原理方法及应用分子标记技术是一种用于检测和定位特定分子的方法。
其原理是通过将一种特殊的化学物质（标记物）与目标分子结合，然后利用标记物的性质来对目标分子进行分析和检测。
分子标记技术被广泛应用于生物医学研究、生物学检测和药物研发等领域。
常用的分子标记技术有荧光标记、酶标记和放射性标记等。
荧光标记是一种将目标分子与荧光染料结合的技术。
荧光标记的原理是通过荧光染料的特性，使得目标分子在荧光显微镜下显示出特定的荧光信号，从而对其进行定位和分析。
荧光标记可以在细胞、组织和体内进行，具有灵敏度高、分辨率高和实时监测的优点。
常见的荧光标记方法有间接免疫荧光标记、原位杂交荧光标记和荧光蛋白标记等。
荧光标记技术广泛应用于细胞定位、蛋白质相互作用研究、细胞分析和分子诊断等领域。
酶标记是一种利用酶与底物反应的方法进行分子标记。
通常，酶标记将目标分子与特定的酶（如辣根过氧化酶、碱性磷酸酶等）结合，然后通过对底物的催化作用产生显色或荧光信号。
酶标记在生物学检测中得到广泛应用，特别是在酶联免疫吸附试验（ELISA）中。
酶标记具有灵敏度高、稳定性好的特点，可以用于检测蛋白质、核酸和小分子等生物分子。
放射性标记是利用放射性同位素与目标分子结合的技术。
放射性同位素具有高灵敏度和长时间半衰期的特点，可以用于追踪和测定目标分子的存在和分布。
放射性标记技术广泛应用于细胞和分子影像学、放射性定位和药物代谢等领域。
分子标记技术在生物医学研究、生物学检测和药物研发等领域有着广泛的应用。
在生物医学研究中，分子标记技术可以用于研究细胞和分子的结构和功能，探索疾病的发生机制和药物的作用机理。
在生物学检测中，分子标记技术可以用于检测和定位特定的生物分子，如蛋白质、核酸和小分子等，从而实现对生物过程的观察和分析。
在药物研发中，分子标记技术可以用于筛选和评价药物的活性和毒性，以及研究药物的代谢和药理学特性。
总之，分子标记技术的发展和应用为生物医学研究和生物学检测提供了强大的工具，有助于我们深入理解生命的奥秘和开发有效的治疗手段。
分子标记――AFLP原理和操作步骤
分子标记――AFLP原理和操作步骤一、原理AFLP也是通过限制性内切酶片段的不同长度检测DNA多态性的一种DNA 分子标记技术。
但AFLP是通过PCR反应先把酶切片段扩增,然后把扩增的酶切片段在高分辨率的顺序分析胶上进行电泳,多态性即以扩增片段的长度不同被检测出来。
实验中酶切片段首先与含有与其共同粘末端的人工接头连接,连接后的粘末端顺序和接头顺序就作为以后PCR反应的引物结合位点。
实验中,根据需要通过选择在末端上分别填加了1～3个选择性核苷的不同引物,可以达到选择性扩增的目的。
这些选择性核苷酸使得引物能选择性地识别具有特异配对顺序的内切酶片段,进行结合,导致特异性扩增。
二、实验试剂Taq酶 EcoRI/ MseIEcoRI/ MseI接头 E+A引物M+C引物T4DNALigaseE和M引物琼脂过硫酸胺丙烯酰胺尿素硝酸银甲酰胺 dNTPs 二甲苯青冰醋酸玻璃硅烷50bpMark三、操作步骤（一）基因组DNA提取和纯化A 、参考实验一的大量提取DNA实验方法，B、DNA的纯化：用0.8%琼脂糖凝胶（含EB0.5µg/ml）电泳检测片段大小，取出其中的1/3已提取的基因组DNA进行纯化,首先用TE缓冲液补满至总体积50ul，再等体积苯酚/氯仿/异戊醇（25：24：1）、氯仿/异戊醇（24∶1）各抽提一次, 离心吸上清液于Eppendorf管中，加入1/1 0体积的NaAC和二倍体积预冷的无水乙醇,－20℃放置2h以上，10000g 离心10min，用70%的乙醇漂洗DNA沉淀2次 ,风干后溶于30μlTE缓冲液中，UV-2401PC(岛津)紫外分光光度计检测A260、A280值并定量，再用0.8%琼脂糖凝胶（含EB0.5µg/ml）电泳检测片段大小。
注：0.1-0.2g组织可用100ul溶液E溶，0.5g组织，溶液E可增加至300u l，此时DNA浓度大约为100ng/ul。
（二）限制性酶切及连接在0.2ml离心管中加入：模板量约为250ng,2.5μl 10×酶切缓冲液, 2. 5μl 10×T4DNA连接酶切缓冲液，5U EcoRⅠ, 5U MseⅠ,2U T4连接酶，50pmol MseⅠ接头（序列见表2），双蒸水补至25μl。
5.分子标记091110
Fluorescence Staining of DNA
• EB、SYBR Green、DAPE等
Fluorescence Staining of DNA
Isotope Labeling
Introduction of Molecular markers
现有数十种分子标记技术，万变不离其宗： 现有数十种分子标记技术，万变不离其宗： 分子杂交、PCR扩增 序列分析。 扩增、 分子杂交、PCR扩增、序列分析。 第一类：分子杂交为核心 第一类： 代表：RFLP、DNA指纹 代表：RFLP、DNA指纹 第二类：PCR为核心 第二类：PCR为核心 代表：RAPD、SSR、 代表：RAPD、SSR、AFLP 第三类：DNA序列为核心 第三类：DNA序列为核心 代表：ITS测序分析 代表：ITS测序分析
• 遗传标记（Genetic markers)：是能明确反映 遗传标记（ markers)： 遗传多态性的生物特征。 遗传多态性的生物特征。 • 遗传多态性(Genetic polymorphisms)：经典遗 遗传多态性(Genetic polymorphisms)： 传学中指等位基因的变异； 传学中指等位基因的变异；现代遗传学中指的 是基因组中任何位点上的相对差异。 是基因组中任何位点上的相对差异。
Principle of RAPD
• 原理：以 PCR 为基础 , 利用人工合成的约10 b的随机 原理： 利用人工合成的约10 b的随机 序列寡核苷酸作引物 , 以生物的基因组 DNA 为模板 , 进行 PCR 扩增 , 产生不连续的 DNA 产物 , 通过琼脂 序列的多态性。 反应的每 糖凝胶电泳来检测 DNA 序列的多态性。 RAPD 反应的每 95℃的高温下变性 次循环中 , 双链 DNA 在 95℃的高温下变性 , 解开双 螺旋成为单链模板 , 然后在低温 (36 ℃) 条件下与随 多聚酶的作用下， 机引物结合 , 在 DNA 多聚酶的作用下，按碱基互补原 的方向把核苷酸链延长， 复制。 则沿 5‘至3’的方向把核苷酸链延长，完成 DNA 复制。
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AFLP分子标记实验扩增片段长度多态性 Amplified fragment length polymorphism（AFLP 是在随机扩增多态性（RAPD和限制性片段长度多态性（RFLP技术上发展起来的DNA多态性检测技术,具有RFLP技术高重复性和RAPD技术简便快捷的特点,不需象RFLP 分析一样必须制备探针，且与RAPD标记一样对基因组多态性的检测不需要知道其基因组的序列特征，同时弥补了 RAPD技术重复性差的缺陷。
同其他以PCR为基础的标记技术相比，AFLP技术能同时检测到大量的位点和多态性标记。
此技术已经成功地用于遗传多样性研究，种质资源鉴定方面的研究，构建遗传图谱等。
其基本原理是：以PCR（聚合酶链式反应为基础,结合了 RFLP、RAPD的分子标记技术。
把DNA进行限制性内切酶酶切，然后选择特定的片段进行PCR扩增（在所有的限制性片段两端加上带有特定序列的’接头”用与接头互补的但3-端有几个随机选择的核苷酸的引物进行特异PCR扩增,只有那些与3-端严格配对的片段才能得到扩增，再在有高分辨力的测序胶上分开这些扩增产物，用放射性法、荧光法或银染染色法均可检测之。
一、实验材料采用青稞叶片提取总DNA实验设备1. 美国贝克曼库尔特CEQ8000毛细管电泳系统,2. 美国贝克曼库尔特台式冷冻离心机，3. 美国MJ公司PCR仪,4. 安玛西亚电泳仪等。
三、实验试剂1. 试剂:请使用高质量产品，推荐日本东洋坊TOYOBO公司的相关产品DNA提取试剂盒；EcoRI酶,Msel酶,T4连接酶试剂盒；Taq 酶,dNTP, PCR reactio n buffer;琼脂糖电泳试剂：琼脂糖，无毒GeneFinder核酸染料替代传统EB染料;超纯水（18.2M ? • cm2. 其他实验需要物品微量移液枪（一套及相应尺寸Tip头,PCR管，冰浴等。
四、实验流程1、总DNA提取使用DNA提取试剂盒提取植物基因组DNA,通过紫外分光光度计检测或用标准品跑胶检测。
一般来说，100ng的基因组DNA作为反应模板是足够的。
2、EcoR1酶消化（20ul体系/样品EcoR1 1ul10 buffer 2ul 37 C 65 C 30min 终止反应 sample(总 DNA 5ul ddH 2O 12ul3、 Mse1 酶消化 (20ul 体系 /样品Mse1 2ul (1U/ul10>Buffer 2ulsample(EcoR1 酶切产物 80C 30min 终止反应 ddH 20 1ul4、 T4 DNA Ligase(20ul 体系 /样品T4 DNA Ligase 2ul(1U/ul10>Buffer 2ulsample双酶切产物10ulMse1 Adaptor 1ul 2265C 10min 终止反应 EcoR1 Adaptor 1ul ddH 20 4ul5、预扩增 (20ul 体系 /样品sample 4ulPrimer(Mse1/EcoR1 1ulAFLP Core Mix 15ul* AFLP Core Mix 配方：ddH 20 13.8ulMgCl 2 1.6uldNTPs（2.5mM 1.6ulTaq 酶（1U/ul 1ul10>Buffer 2ul预扩增程序：94°C 2min94 C56 C72 C 2min60 C 30mi n&选择性扩增（20ul体系/样品sample 4ul（预扩增产物稀释 20 倍 Primer（Mse1-XXX/EcoR1-XXX 1ul AFLP Core Mix 15ul选择性扩增程序：94°C 2min94 C 20s66C 30s每循环降1C，共10个循环72C 2min94 C 20s56 C 30s 20个循环72 C 2min60 C 30mi n7、产物电泳检测上样液：Loading Buffer 20ulSize sta ndard-600 0.2ulSample 3ul（稀释 10 倍四、实验结果与分析本实验使用贝克曼库尔特（BeckmanCoulter公司CEQ8000遗传分析系统,运用先进的荧光标记技术和毛细管电泳分离技术进行实验，扩增产物在高分辨率毛细管中电泳分离,采用激光激发荧光采集数据，灵敏度极高，电泳结果通过软件自动统计分析并转换成“0 T矩阵,便于对结果进一步深入分析研究，整个电泳、数据采集和数据分析过程由软件来控制完成，最大程度避免了人工操作造成的误差，提高了数据的可靠性。
产物电泳数据采集在CEQ8000遗传分析系统上进行（图1，得到的数据（图2用第三方软件再进一步统计分析。
图1 AFLP分子指纹图谱*h R«nr hiwM WMoai iimi •笙曲中打订M P KHIIUAW I I加 w^AuriBft dHa r '3* 皆 律it 沪―诗W jp %品■甌■后■何・| VHi ，、F 击心2浮IV 岬*HROH] Fmpwl [4U |SF|«p## UH ||(W*| R M IC A «N | fi«11*丨 F»MI | W ・L HU T ・| WUtu Iv 1 DM J?图2 AFLP “ 0 1”矩阵图AFLP 操作流程图:酶切Msel 酶切 需&辺€口亍——优化数据分析附录1:常用的8对AFLP选择性扩增引物：E-AGG: 5-GACTGCGTACCAATTCAGG -3E-ACG: 5-GACTGCGTACCAATTCACG -3E-AAC: 5-GACTGCGTACCAATTCAAC -3E-ACA: 5-GACTGCGTACCAATTCACA -3E-AGC: 5-GACTGCGTACCAATTCAGC -3E-ACT: 5-GACTGCGTACCAATTCACT -3E-AAG: 5-GACTGCGTACCAATTCAAG -3Tel: +86 532 80998002 Fax: +86 532 80998005网站：地址:山东省崂山区山东头路58号盛和大厦2-1706E-ACC: 5-GACTGCGTACCAATTCACC -3M-CAA: 5-GAT GAG TCC TGA GTA A CAA -3 M-CAC: 5-GAT GAG TCC TGA GTA A CAC -3 M-CAG: 5-GAT GAG TCC TGA GTA A CAG -3 M-CTA: 5- GAT GAG TCC TGA GTA A CTA -3 M-CAT: 5-GAT GAG TCC TGA GTA A CAT -3 M-CTC: 5-GAT GAG TCC TGA GTA A CTC -3 M-CTG: 5-GAT GAG TCC TGA GTA A CTG -3 M-CTT: 5-GAT GAG TCC TGA GTA A CTT -3附录2:AFLP 传统垂直板电泳（银染法检测 介绍:原理与方法同前，区别:1.选择性扩增引物不带荧光标记；2.电泳方法不同，采用 测序胶垂直板电泳；3.电泳结果采用银染法，比较直观,但条带的统计与分析全人工 化,工作量大,银染法灵敏度比荧光标记法要低。
示例:下图为玉米（maizeDNA 的AFLP 图谱。
Pan el A: AFLP fin gerpri nts of control maize DNA usi ng EcoRI primer E-AGG with eight Mse1 primers: M-CAA (1, M-CAC (2, M-CAG (3, M-CAT (4, M-CTA (5, M-CTC (6, M-CTG (7, and M-CTT (8.Panel B: AFLP fingerprints of control maize DNA using Mse1 primer M-CAG with eight EcoR1 primers: E-AAC (a, E-AAG (b, E-ACA (c, E-ACT (d, E-ACC (e, E-ACG (f, E-AGC (g, and E-AGG (h.Tel: +86 532 80998002 Fax: +86 532 80998005网站: -地址:山东省崂山区山东头路58号盛和大厦2-1706Tel: +86 532 80998002 Fax: +86 532 80998005网站:地址:山东省崂山区山东头路58号盛和大厦2-1706二ISSR分子标记的实验原理及操作流程ISSR(inter-simple sequenee repeal标记是一种类似 RAPD,但利用包含重复序列并在3'或5'锚定的单寡聚核酸引物对基因组进行扩增的标记系统，即用SSR引物来扩增重复序列之间的区域。
其原理具体是，ISSR标记根据生物广泛存在SSR的特点，利用在生物基因组常出现的SSR本身设计引物，无需预先克隆和测序。
用于扩增的引物一般为16-18个碱基序列，由1-4个碱基组成的串联重复和几个非重复的锚定碱基组成,从而保证了引物与基因组DNA中SSR的5'或3'末端结合，导致位于反向排列、间隔不太大的重复序列间的基因组节段进行PCR扩增。
一、实验材料不同来源的DNA(30-50ng/ul。
二、实验设备PCR仪,PCR管或硅化的0.5ml eppendof管，电泳装置,凝胶成像仪。
三、试剂1、ISSR引物:购买成品或根据加拿大 British Columbia大学设计的ISSR引物序列(见附录自己合成。
2、Taq酶3、10xPCR缓冲液4、MgCI 2:25mmol/L。
5、dNTP :2.5mmol/L。
四、操作步骤：1.在25ul反应体系中，加入模板DNA 1ul （30-5Ong ISSR引物1ul （约5pmol 10xPCR Buffer2.5ulMgCl 2 2uldNTP 2ulTaq酶1单位（U 加 ddH20 至 25ul混匀稍离心，加一滴（约20 ul矿物油。
2. 在PCR仪中预变性94C 2分钟,然后循环：94C 1分钟,45C -68C 40秒,72 T 1-2分钟，共40轮循环。
3. 循环结束后,72C 10分钟,4C保存。
4. 取PCR产物15ul加3ul上样缓冲液（6x于1.6%或1.8%琼脂糖胶上电泳,稳压50-100 V（电压低带型整齐，分辨率高。
5. 电泳结束，溴化乙锭染色20分钟。
6.用凝胶成像仪观察、拍照操作流程简图：地址:山东省崂山区山东头路58号盛和大厦2-1706Tel: +86 532 80998002 Fax: +86 532 80998005网站：地址:山东省崂山区山东头路58号盛和大厦2-1706注:样品可以采用新鲜样品，硅胶干燥样品，标本等DNA提取可采用CTAB或SDS法DNA质量检测可用紫外分光光度计法和电泳法附录 UBC Primer Set #9 (Microsatellite引物名称序列引物名称序列801 ATA TAT ATA TAT ATA TT851 GTG TGT GTG TGT GTG TYG 802 ATA TAT ATA TAT ATA TG852 TCT CTC TCT CTC TCT CRA 803 ATA TAT ATA TAT ATA TC853 TCT CTC TCT CTC TCT CRT 804 TAT ATA TAT ATA TAT AA854 TCT CTC TCT CTC TCT CRG 805 TAT ATA TAT ATA TAT AC855 ACA CAC ACA CAC ACA CYT 806 TAT ATA TAT ATA TAT AG856 ACA CAC ACA CAC ACA CYA 807 AGA GAG AGA GAG AGA GT857 ACA CAC ACA CAC ACA CYG 808 AGA GAG AGA GAG AGA GC858 TGT GTG TGT GTG TGT GRT 809 AGA GAG AGA GAG AGA GG859 TGT GTG TGT GTG TGT GRC 810 GAG AGA GAG AGA GAG AT860 TGT GTG TGT GTG TGT GRA 811 GAG AGA GAG AGA GAG AC861 ACC ACC ACC ACC ACC ACC 812 GAG AGA GAG AGA GAG AA862 AGC AGC AGC AGC AGC AGC 813 CTC TCT CTC TCT CTC TT863AGT AGT AGT AGT AGT AGTTel: +86 532 80998002 Fax: +86 532 80998005网站：地址:山东省崂山区山东头路58号盛和大厦2-1706814 CTC TCT CTC TCT CTC TA864 ATG ATG ATG ATG ATG ATG815 CTC TCT CTC TCT CTC TG865 CCG CCG CCG CCG CCG CCG 816 CACACA CAC ACA CAC AT866 CTC CTC CTC CTC CTC CTC 817 CAC ACA CACACA CAC AA867 GGC GGC GGC GGC GGC GGC 818 CAC ACA CAC ACA CACAG868 GAA GAA GAA GAA GAA GAA 819 GTG TGT GTG TGT GTG TA869 GTTGTT GTT GTT GTT GTT 820 GTG TGT GTG TGT GTG TC870 TGC TGC TGC TGCTGC TGC 821 GTG TGT GTG TGT GTG TT871 TAT TAT TAT TAT TAT TAT 822TCT CTC TCT CTC TCT CA872 GAT AGA TAG ATA GAT A 823 TCT CTC TCTCTC TCT CC873 GAC AGA CAG ACA GAC A 824 TCT CTC TCT CTC TCT CG874CCC TCC CTC CCT CCC T 825 ACA CAC ACA CAC ACA CT875 CTA GCT AGCTAG CTA G 826 ACA CAC ACA CAC ACA CC876 GAT AGA TAG ACA GAC A827 ACA CAC ACA CAC ACA CG877 TGC ATG CAT GCA TGC A 828 TGT GTGTGT GTG TGT GA878 GGA TGG ATG GAT GGA T 829 TGT GTG TGT GTG TGTGC879 CTT CAC TTC ACT TCA 830 TGT GTG TGT GTG TGT GG880 GGA GAGGAG AGG AGA 831 ATA TAT ATA TAT ATA TYA 881 GGG TGG GGT GGG GTG832 ATA TAT ATA TAT ATA TYC 882 VBV ATA TAT ATA TAT AT 833 ATA TAT ATA TAT ATA TYG 883 BVB TAT ATA TAT ATA TA 834 AGA GAG AGA GAG AGA GYT 884 HBH AGA GAG AGA GAG AG 835 AGA GAG AGA GAG AGA GYC 885 BHB GAG AGA GAG AGA GA 836 AGA GAG AGA GAG AGA GYA 886 VDV CTC TCT CTC TCT CT 837 TAT ATA TAT ATA TAT ART 887 DVD TCT CTC TCT CTC TC 838 TAT ATA TAT ATA TAT ARC 888 BDB CAC ACA CAC ACA CA 839 TAT ATA TAT ATA TAT ARG 889 DBD ACA CAC ACA CAC AC 840 GAG AGA GAG AGA GAG AYT 890 VHV GTG TGT GTG TGT GT 841 GAG AGA GAG AGA GAG AYC891HVH TGT GTG TGT GTG TGTel: +86 532 80998002 Fax: +86 532 80998005网站：地址:山东省崂山区山东头路58号盛和大厦2-1706842 GAG AGA GAG AGA GAG AYG892TAG ATC TGA TAT CTG AAT TCCC843 CTC TCT CTC TCT CTC TRA 893 NNN NNN NNN NNN NNN 844 CTC TCT CTC TCT CTC TRC 894 TGG TAG CTC TTG ATC ANN NNN845 CTC TCT CTC TCT CTC TRG895AGA GTT GGT AGC TCT TGA TC846 CAC ACA CAC ACA CAC ART 896 AGG TCG CGG CCG CNN NNN NATG847 CAC ACA CAC ACA CAC ARC 897 CCG ACT CGA GNN NNN NAT GTGG848 CAC ACA CAC ACA CAC ARG 898 GAT CAA GCT TNN NNN NAT GTGG849 GTG TGT GTG TGT GTG TYA 899 CAT GGT GTT GGT CAT TGT TCCA850 GTG TGT GTG TGT GTG TYC900ACT TCC CCA CAG GTT AAC ACATel: +86 532 80998002 Fax: +86 532 80998005网站 :地址:山东省崂山区山东头路 58 号盛和大厦 2-1706三 RAPD 分子标记的实验原理及操作流程RAPD 技术的全称是随机扩增多态性 DNA(Random Amplified PolymorphicDNA,此技术建立于PCR基础之上，使用一系列具有10个左右碱基的单链随机引物对基因组的 DNA 全部进行 PCR 扩增, 以检测多态性。