最新分子生物学实验指导
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分子生物学实验指导
分子生物学实验指导
(补充讲义)
南方医科大学生物化学与分子生物学实验教学中心
二OO九年十二月
目录
实验总RNA的提取、定量与RT-PCR………………………………………………
1
实验质粒DNA的提取、定量与酶切鉴定 (7)
实验蛋白质聚丙烯酰胺凝胶电泳 (13)
附录Ⅰ相关试剂盒说明书 (19)
附录Ⅱ相关仪器使用说明书 (19)
实验九总RNA的提取、定量与RT-PCR
一、总RNA的提取与定量
目的:
从细胞中分离RNA是分子生物学实验经常进行的操作之一,所提取RNA的质量是进行其它实验的基础,如Northern杂交,目的基因cDNA的克隆,荧光定量,文库构建等。
原理:
在哺乳动物中,平均每个细胞内大约含有10-5μg RNA,其中rRNA占总量的80%-85%,tRNA和核内小分子RNA占10-15%,而mRNA只占1-5%。rRNA由28S、18S、5S等几类组成,这些RNA分子根据密度和分子大小,通过密度梯度离心、凝胶电泳、离子交换层析进行分离。mRNA分子种类繁多,分子量大小不均一,在细胞中含量少,绝大多数mRNA分子(除血红蛋白、有些组蛋白mRNA以外),在3’端存在20-250个多聚腺苷酸(polyA)。利用此特点,用
oligo(dT)亲和层析柱分离mRNA。
RNA分离的方法有:异硫氰酸胍氯化铯超速离心法,盐酸胍-有机溶剂法,氯化锂-尿素法,蛋白酶K-细胞质RNA提取法等、异硫氰酸胍-酚-氯仿一步法等。目前常用的是Trizol法。
Trizol试剂适用于从细胞和组织中快速分离RNA。TRIzol的主要成分是异硫氰酸胍和酚。异硫氰酸胍属于解偶剂,是一类强力的蛋白质变性剂,可溶解蛋白质主要作用是裂解细胞,使细胞中的蛋白,核酸物质解聚得到释放。酚虽可有效的变性蛋白质,但是它不能完全抑制RNA酶活性,因此Trizol中还加入了8-羟基喹啉、β-巯基乙醇等来抑制内源和外源RNase。在加入氯仿离心后,溶液分为水相和有机相,RNA选择性地进入无DNA和蛋白质的水相中。取出水相用异丙醇沉淀可回收RNA;用乙醇沉淀中间层可回收DNA;用异丙醇沉淀有机相可回收蛋白质。
Trizol试剂可用于小量样品(50~100mg组织、5×106细胞)也适用于大量样品(≥1g组织、>107细胞)。对人,动物,植物组织,细菌均适用,整个提取过程在一小时内即可完成。分离的总RNA无蛋白质和DNA污染,可用于Northern blot,dot blot,ployA筛选,体外翻译,RNase保护分析和分子克隆。在用于RT-
PCR时如果两条引物存在于一个单一外显子内,建议用无RNase的DNaseⅠ处理RNA样品,避免出现假阳性。共纯化的DNA可用作标准,比较不同样品RNA的得率,也可用于PCR和酶切。蛋白质可用于western blotting。
核酸的最大吸收波长为260nm,蛋白质为280nm,在波长260nm时,1OD值相当于双链DNA浓度为50μg/ml,单链DNA和RNA浓度为40μg/ml,单链寡核苷酸的含量为33μg/ml,可以据此来计算核酸样品的浓度,还可通过测定在260nm和280nm的OD值的比值(OD260/OD280),估计核酸的纯度。纯净DNA的比值为1.8, RNA为2.0。若样品中含有酚和蛋白质将导致比值降低。270nm存在高吸收表明有酚的干扰。紫外分光光度法只能用于测定浓度大于0.25μg/ml的核酸溶液,
对浓度更小的样品,可采用荧光分光光度法。
仪器和主要试剂:
1. 紫外分光光度计、微量加样枪、灭菌超薄PCR反应管
2. Trizol试剂
3. 氯仿
4. 异丙醇
5. 75℅乙醇
6. 无RNase的水或0.5℅SDS (溶液均需用DEPC处理过的水配制)
实验方法:[本次实验采用TaKaRa 公司的RNAiso Plus试剂]
(一)RNA提取
1. 匀浆处理:
a.组织将组织在液氮中磨碎,每50-100mg组织加入1ml Trizol,用匀浆仪进行匀浆处理。样品体积不应超过Trizol体积10℅。
b.单层培养细胞直接在培养板中加入Trizol裂解细胞,每10cm2面积加1ml,用移液器吸打几次。Trizol的用量应根据培养板面积而定,不取决于细胞数。Trizol加量不足可能导致提取的RNA有DNA污染。
c.细胞悬液离心收集细胞,每5-10×106动物、植物、酵母细胞或1×107细菌细胞加入1ml Trizol,反复吸打。加Trizol之前不要洗涤细胞以免mRNA降解。一些酵母和细菌细胞需用匀浆仪处理。
(注意:匀浆一定要彻底,是提取高质量RNA的前提;细胞数量与Trizol的比例,细胞的数量不能过多。)
2. 将匀浆样品在室温(15-30℃)放置5 min,使核酸蛋白复合物完全分离。
3. 可选步骤:如样品中含有较多蛋白质,脂肪,多糖或胞外物质(肌肉,植物结节部分等)可于2-8 ℃10000×g离心10 min,取上清。离心得到的沉淀中包括细胞外膜,多糖,高分子量DNA,上清中含有RNA。处理脂肪组织时,上层有大量油脂应去除。取澄清的匀浆液进行下一步操作。
4. 每使用1ml Trizol加入0.2ml氯仿,剧烈振荡15s,室温放置3 min。
(注意:此步振荡非常重要,建议在旋涡振荡器上进行。)
5. 2-8℃10000×g离心15 min。样品分为三层:底层为黄色(红或绿)有机相,上层为无色水相和一个中间层。RNA主要在水相中,水相体积约为所用Trizol试剂的60℅。
6. 把水相转移到新管中(如要分离DNA和蛋白质可保留有机相),用异丙醇沉淀水相中的RNA。每使用1ml Trizol加入0.5ml异丙醇,室温放置10 min。
7. 2-8℃10000g离心10 min,离心前看不出RNA沉淀,离心后在管侧和管底出现胶状沉淀。移去上清。
8. 用75℅乙醇洗涤RNA沉淀。每使用1ml Trizol至少加1ml 75℅乙醇。2-8℃不超过7500g离心5 min,弃上清。