《分子生物学》实验指导(2015-2016)
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《分子生物学》实验指导
实验1 总DNA提取
生物总DNA的提取是分子生物学实验的一个重要内容。由于不同的生物材料细胞壁的结构和组成不同,而细胞壁结构的破坏是提取总DNA的关键步骤。同时细胞内的物质也根据生物种类的不同而有差异,因此不同生物采用的提取方法也不同,一般要根据具体的情况来设计实验方法。本实验介绍采用CTAB法提取植物总DNA的技术。
[实验目的]
学习和掌握学习CTAB法提取植物总DNA的基本原理和实验技术。学习和掌握紫外光吸收法鉴定DNA的纯度和浓度。
[实验原理]
植物叶片经液氮研磨,可使细胞壁破裂,加入去污剂(如CTAB),可使核蛋白体解析,然后使蛋白和多糖杂质沉淀,DNA进入水相,再用酚、氯仿抽提纯化。本实验采用CTAB法,其主要作用是破膜。CTAB 是一种非离子去污剂,能溶解膜蛋白与脂肪,也可解聚核蛋白。植物材料在CTAB的处理下,结合65℃水浴使细胞裂解、蛋白质变性、DNA 被释放出来。CTAB与核酸形成复合物,此复合物在高盐(>0.7mM)浓度下可溶,并稳定存在,但在低盐浓度(0.1-0.5mM NaCl)下CTAB-核酸复合物就因溶解度降低而沉淀,而大部分的蛋白质及多糖等仍溶解于溶液中。经过氯仿/ 异戊醇(24:1) 抽提去除蛋白质、多糖、色素等来纯化DNA,最后经异丙醇或乙醇等沉淀剂将DNA沉淀分离出来。
由于核酸、蛋白质、多糖在特定的紫外波长都有特征吸收。核酸及其衍生物的紫外吸收高峰在260nm。纯的DNA样品A260/280≈1.8,纯的RNA样品A260/280≈2.0,并且1μg/ml DNA 溶液A260=0.020。
[实验器材]
1、高压灭菌锅
2、冰箱
3、恒温水浴锅
4、高速冷冻离心机
5、紫外分光光度计
6、剪刀
7、陶瓷研钵和杵子
8、磨口锥形瓶(50ml)
9、滴管10、细玻棒11、小烧杯(50ml)12、离心管(50ml)13、植物材料
[实验试剂]
1、3×CTAB buffer(pH8.0)
100mM Tris
25mM EDTA
1.5M NaCl
3% CTAB
2% β-巯基乙醇
2、TE缓冲液(pH8.0)
10mmol/L Tris·HCl
1mmol/L EDTA
3、氯仿-异戊醇混合液(24:1,V/V)
4、95%乙醇
5、液氮
[实验步骤]
1、称取2g新鲜的植物叶片,用蒸馏水冲洗叶面,滤纸吸干水分。
2、将叶片剪成1cm长,置预冷的研钵中,倒入液氮,尽快研磨成粉末。
3、待液氮蒸发完后,加入15mL预热(60℃)的CTAB提取缓冲液,转入一磨口锥形瓶中,
置于65℃水浴保温0.5h,不时地轻轻摇动混匀。
4、加等体积的氯仿/异戊醇,盖上瓶塞,温和摇动,使成乳状液。
5、将锥形瓶中的液体倒入50ml离心管中,在4℃下8000rpm离心10min。
6、离心管中出现3层,用滴管小心地将上层清液吸入另一干净的离心管中,弃去中间层的细胞碎片和变性蛋白以及下层的氯仿。(根据需要,上清液可用氯仿/异戊醇反复提取多次。)
7、收集上层清液,并将其倒入小烧杯。沿烧杯壁慢慢加入2倍体积预冷的95%乙醇。边加边用细玻棒沿同一方向搅动,可看到纤维状的沉淀(主要为DNA)迅速缠绕在玻棒上。
8、小心取下这些纤维状沉淀,加1~2 mL 70%乙醇冲洗沉淀,轻摇几分钟,除去乙醇,即为DNA粗制品。
9、将粗制品溶于TE缓冲液。
10、在分光光度计上测定该溶液在260nm/280nm紫外光波长下的光密度值。
[注意事项]
1、液氮研磨时,小心操作,以免冻伤。
2、所有操作均需温和,避免剧烈震荡。
[思考题]
CTAB、EDTA、巯基乙醇的作用分别是什么?
液氮研磨的原理是什么?
实验二质粒DNA的提取
质粒DNA是分子生物学实验中广泛应用的载体分子。质粒是细菌独立于染色体外的遗传物质,是环状的双链DNA分子。由于质粒比较小,并且能进行独立的自我复制,常常被改造为克隆和表达的载体分子。
[实验目的]
通过本实验掌握碱裂解法提取质粒的基本原理,掌握碱裂解小量提取质粒的实验技术。[实验原理]
碱裂解法提取质粒是根据共价闭合环状质粒DNA与线性染色体DNA在拓扑学上的差异来分离它们。在pH值介于12.0~12.5这个狭窄的范围内,线性的DNA双螺旋结构解开而被变性,尽管在这样的条件下,共价闭合环状质粒DNA的氢键会被断裂,但两条互补链彼此相互盘绕,仍会紧密地结合在一起。当加入pH4.8的乙酸钾高盐缓冲液恢复pH至中性时,共价闭合环状的质粒DNA的两条互补链仍保持在一起,因此复性迅速而准确,而线性的染色体DNA的两条互补链彼此已完全分开,复性就不会那么迅速而准确,它们缠绕形成网状结构,通过离心,染色体DNA与不稳定的大分子RNA,蛋白质-SDS复合物等一起沉淀下来而被除去。
[实验器材]
1、恒温培养箱
2、恒温摇床
3、台式离心机
4、高压灭菌锅
5、Tip头、Eppendorg管
6、含有目的质粒的E.coli菌株
[实验试剂]
1、溶液I
50mmol/L 葡萄糖
5 mmol/L 三羟甲基氨基甲烷(Tris)Tris·HCl
10mmol/L 乙二胺四乙酸(EDTA)(pH8.0)
2、溶液II
0.4mol/L NaOH , 2% SDS ,用前等体积混合
3、溶液III
5mol/L乙酸钾60mL
冰乙酸11.5mL
水28.5mL
4、TE缓冲液
10mmol/L Tris·HCl
1mmol/L EDTA(pH8.0)
5、70%乙醇(放-20℃冰箱中,用后即放回)
6、EcoRI 及其缓冲液
7、HindIII及其缓冲液
[实验步骤]
1、将含有目的质粒的E.coli菌株接种于LB液体培养基中,37℃振荡培养过夜。
2、取1ml培养物倒入Eppendorf管中,12000r/min离心30sec。
3、吸去培养液,使细胞沉淀尽可能干燥。
4、将细菌沉淀悬浮于100μL冰预冷的溶液I中,剧烈振荡。
5、加200μL溶液II(新鲜配制),盖紧管皿,快速颠倒5次,混匀内容物,将Eppendorf 管放在冰上。
6、加入150μL溶液III(冰上预冷),盖紧管口,颠倒数次使混匀,冰上放置5min。
7、12000r/min,离心5min,将上清液转至另一Eppendorf管中。
8、向上清液加入等体积的饱和酚,混匀。
9、12000r/min,离心5min,将上清液转至另一Eppendorf管中。
10、向上清液加入2倍体积乙醇,混匀后,室温放置5~10min。12000r/min离心5min。倒去上清液,把Eppendorf管倒扣在吸水纸上,吸干液体。
11、1ml 70%乙醇洗涤质粒DNA沉淀,振荡并离心,倒去上清液,真空抽干或空气中干燥。
12、20μL TE缓冲液,使DNA完全溶解,-20℃保存。
[注意事项]
操作时,避免剧烈震荡。
[思考题]
1、实验操作中,饱和酚的作用是什么?
2、SDS和NaOH的作用是什么?
[参考文献]
《精编分子生物学实验指南》(第四版)
[美] F M奥斯伯,R E 金斯顿等主编科学出版社2005
实验三总RNA提取
【目的和要求】
1.掌握样品中总RNA的提取的原理和方法。