quality score 二代测序
gatk参数
gatk参数GATK（Genome Analysis Toolkit）是一个广泛使用的软件包，用于分析和整合高通量测序数据，特别是针对人类基因组和其他模型生物的基因组项目。
GATK提供了多种工具和参数选项，用于对测序数据进行质量控制、比对、变异检测和注释等操作。
在这里，我们将对GATK的常用参数进行简要介绍，其主要分为三个部分：数据前处理、变异检测和注释。
1. 数据前处理参数基于不同的测序数据类型，包括WGS、WES和RNA-seq等，GATK提供了不同的数据前处理工具和参数选项。
- BQSR (Base Quality Score Recalibration)：BQSR可以校正Illumina质量分数的偏移和遗漏，以提高变异检测的准确性。
参数选项包括-UALLOW_SEQ_DICT_INCOMPATIBILITY-REFERENCE_SEQUENCE-INPUT_ALIGNMENT_FILE-INPUT_R EADS_FILE-DBSNP-VAR_TI_TV-OUTPUT-INTERVALS-INTERVAL_SET_RULE-DO_NOT_WRITE_SUMM ARY_TO_DISK等。
2. 变异检测参数变异检测是GATK的一个主要功能，其变异检测工具和参数选项如下。
- CombineGVCFs：CombineGVCFs可以合并多个GVCF文件以生成一个单一的VCF文件。
参数选项包括-R_REF--INPUT--INTERVALS-TMP_DIR--JOINT_CALLING--MIN_BASE_QUAL_SCORE等。
3. 注释参数注释是确定变异的功能和影响的关键步骤，GATK提供了多种注释工具和参数选项。
- SnpEff：SnpEff是一种用于注释VCF文件的工具，可以将SNP和INDEL变异与外部数据库进行比对，并将其分为高影响、中影响和低影响。
参数选项包括-vcf--config--ud 等。
Multiqc（转录组分析之质量评估）
Multiqc（转录组分析之质量评估）fastqc是⼀款基于java的软件，能够对测序数据的质量进⾏评估。
⼀个样本⽣成⼀个报告，当样本量过多时，逐⼀查看样本质量就稍显不⽅便，multiqc是⼀个基于Python的模块, ⽤于整合其它软件的报告的软件，能将fastqc⽣成的多个报告整合成⼀个报告的软件，这样能⽅便的查看所有测序数据的质量。
⽬前⽀持以下软件结果的整合：Pre-alignment toolsAlignment toolsPost-alignment toolsmultiqc的安装：在已经安装Anaconda的情况下，安装MultiQC⾮常简单，直接在shell命令⾯板中输⼊以下命令：conda install -c biocondamultiqcmultiqc的使⽤和常⽤参数：Usage: multiqc[OPTIONS] <analysis directory>Options:-f, --force 重写已存在的报告-s, --fullnames 保留样本名称-o, --outdir TEXT 报告输出路径-l, --file-list 提供包含搜索路径列表的⽂档（每⾏⼀个）-z, --zip-data-dir 压缩数据⽬录-p, --export 将报告中的图导出为静态图-fp, --flat 只使⽤平⾯图（静态图）-ip, --interactive 只使⽤动图(HighCharts Javascript)--pdf 输出PDF格式的报告（需要安装Pandoc）现在⽤最简单的命令整合fastqc的报告：(multiqc+fastqc结果报告存放路径+multiqc报告输出路径）> multiqc /data/home/chj/fastqc_result -o/data/home/chj/multiqc_result命令执⾏完毕会⽣成1个html报告，直接⽹页打开就可以查看和⼀个multiqc_data的⽂件夹，其中包含⼀些数据基本的统计信息和⽇志⽂档。
Fastq格式详解
Fastq格式详解所谓格式，是对信息描述的统一规范。
FASTQ是基于文本的，保存生物序列（通常是核酸序列）和其测序质量信息的标准格式，其实质是一种数据储存格式。
其序列以及质量信息都是使用一个ASCII字符标示，最初由Sanger开发，目的是将FASTA序列与质量数据放到一起，目前已经成为高通量测序结果的事实标准。
（FASTQ 格式以测序读段为单位存储，每条读段占4 行，其中第1 行和第3行由文件识别标志和读段名(ID)组成(第1 行以“@”开头而第3 行以“+”开头；第3 行中ID 可以省略，但“+”不能省略)，第2 行为碱基序列，第4行为对应的测序质量分数）格式说明FASTQ文件中每个序列通常有四行：1.第一行以‘@’开头，后边是序列标识以及相关的描述信息，；2.第二行是序列3.第三行以‘+’开头，后面是序列标示符、描述信息，或者什么也不加4.第四行，是质量信息，对于每一条序列，其每一个碱基都有一个对应的测序质量值，和第二行的序列相对应，根据评分体系的不同，每个字符的含义表示的数字也不相同。
例如：@SEQ_ID GATTTGGGGTTCAAAGCAGTATCGATCAAATAGTAAATCCATTTGTTCAACTCACAGTTT+!''*((((***+))%%%++)(%%%%).1***-+*''))**55CCF>>>>>>CCCCCCC65ILLUM IN A S E Q UE N CE ID E N T IF IER S@HWUSI-EAS100R:6:73:941:1973#0/1开头。
一个研究课题致力于一有特定的研究类型( 如全基因组测序，run的检索号)。
关于质量编码格式8条Lane，得到800G数据，即800G/RUN。
两种换算标准的比较：Relationship between Q and p using the Sanger (red) and Solexa (black) equations (described above). The vertical对于每个碱基的质量编码标示，不同的软件采用不同的方案，目前有5种方案： ▪ Sanger ，Phred quality score ，值的范围从0到92，对应的ASCII 码从33到126，但是对于测序数据（raw read data ）质量得分通常小于60，序列拼接或者mapping 可能用到更大的分数。
NGS数据质量评估方法与标准说明
NGS数据质量评估方法与标准说明一、引言在当前快速发展的基因组学研究中，下一代测序（Next Generation Sequencing，NGS）技术已成为重要的工具。
然而，随着数据量的增加，保证NGS数据质量的准确性和可靠性对于研究结果的解释和应用至关重要。
因此，本文将从NGS数据质量评估的方法和标准两个方面进行探讨与说明。
二、NGS数据质量评估方法NGS数据质量评估的目的是通过分析测序数据中的错误和偏差，确定数据的准确性和可靠性。
下面介绍几种常用的NGS数据质量评估方法。
1. 物理测序质量评估物理测序质量评估是通过分析测序reads中的错误类型和频率来评估测序数据的质量。
常用的质量评估工具包括FastQC、PRINSEQ等。
这些工具可以分析碱基质量、碱基序列分布、测序错误率等指标，并将结果以图表的形式展示出来。
研究人员可以通过这些指标来评估测序的准确性和可靠性，并选择合适的后续分析策略。
2. 比对质量评估比对质量评估是针对已经比对到参考序列的测序数据进行质量评估。
常用的比对质量评估工具包括SAMtools、Picard 等。
这些工具可以根据比对的结果，分析比对率、比对质量、插入和删除错误率等指标。
研究人员可以通过这些指标来评估测序数据的比对质量，进一步确定其准确性和可靠性。
3. 变异质量评估变异质量评估是针对检测到的 DNA 变异进行质量评估。
常用的变异质量评估工具包括GATK、VarScan等。
这些工具可以分析变异的类型、频率、覆盖度等指标，并通过统计学方法来评估变异的可靠性和真实性。
研究人员可以根据这些指标来判断变异是否具有生物学意义和研究价值。
三、NGS数据质量评估标准NGS数据质量评估标准是用于衡量测序数据质量的参考指标，旨在提供统一的标准和规范。
以下是常见的NGS数据质量评估标准。
1. 碱基质量阈值碱基质量阈值是评估DNA测序数据质量的重要指标之一。
常见的衡量方法是通过phred评分系统，通常设置阈值为Q20或Q30。
名词专题RNA-seq常见名词解释
名词专题RNA-seq常见名词解释前言各位亲们，文献中的很多名字是否困惑过？别怕！我们会用一个专题来解释相关的名词，以期给各位带来一些帮助。
RNA-seq：基于二代测序技术，研究特定细胞在某一功能状态下所有RNA 的功能，主要包括 mRNA 和非编码RNA。
能够全面快速地获得某一物种特定组织或器官在某一状态下的几乎所有转录本序列信息，已广泛应用于基础研究、临床诊断和药物研发等领域。
Q20,Q30：二代测序中，每测一个碱基会给出一个相应的质量值，这个质量值是衡量测序准确度的。
碱基的质量值20的错误率为1%，30的错误率为0.1%。
Q20与Q30表示质量值≧20或30的碱基所占百分比，如碱基质量值为20则表示该碱基的错误率为10^（20/(-10)）=0.01=1%（根据Q=-10lgP计算，P为错误率）intron：内含子，是真核生物细胞DNA 中的间插序列。
这些序列被转录在前体RNA 中，经过剪接被去除，最终不存在于成熟RNA 分子中。
术语内含子也指编码相应RNA 内含子的DNA 中的区域。
exon：外显子，是真核生物基因的一部分，它在剪接(Splicing)后仍会被保存下来，并可在蛋白质生物合成过程中被表达为蛋白质。
外显子是最后出现在成熟RNA 中的基因序列，又称表达序列。
既存在于最初的转录产物中，也存在于成熟的RNA 分子中的核苷酸序列。
术语外显子也指编码相应RNA 外显子的DNA 中的区域。
intergenic：基因间区，指基因与基因之间的间隔序列，不属于基因结构，不直接决定氨基酸，可能通过转录后调控影响性状的区域。
UTR：Untranslated Regions, 非翻译区域。
是信使RNA （mRNA）分子两端的非编码片段。
5'-UTR 从mRNA 起点的甲基化鸟嘌呤核苷酸帽延伸至AUG 起始密码子，3'-UTR 从编码区末端的终止密码子延伸至多聚A 尾巴（Poly-A）的前端。
转录组RNAseq术语解释
转录组RNAseq术语解释RNA-Seq名词解释1.inde某2.碱基质量值（QualityScore或Q-core）是碱基识别（BaeCalling）出错的概率的整数映射。
碱基质量值越高表明碱基识别越可靠，碱基测错的可能性越小。
3.Q30碱基质量值为Q30代表碱基的精确度在99.9%。
4.FPKM （FragmentPerKilobaeoftrancriptperMillionfragmentmapped）每1百万个map上的read中map到外显子的每1K个碱基上的fragment个数。
计算公式为公式中，cDNAFragment表示比对到某一转录本上的片段数目，即双端Read数目；MappedRead(Million)表示MappedRead总数，以10为单位；TrancriptLength(kb)：转录本长度，以kb个碱基为单位。
5.FC（FoldChange）即差异表达倍数。
6.FDR（FaleDicoveryRate）即错误发现率，定义为在多重假设检验过程中，错误拒绝(拒绝真的原(零)假设)的个数占所有被拒绝的原假设个数的比例的期望值。
通过控制FDR来决定P值的阈值。
7.P值（P-value）即概率，反映某一事件发生的可能性大小。
统计学根据显著性检验方法所得到的P值，一般以P<0.05为显著，P<0.01为非常显著，其含义是样本间的差异由抽样误差所致的概率小于0.05或0.01。
8.可变剪接（Alternativeplicing）有些基因的一个mRNA前体通过不同的剪接方式（选择不同的剪接位点）产生不同的mRNA剪接异构体，这一过程称为可变剪接(或选择性剪接，alternativeplicing)。
可变剪接是调节基因表达和产生蛋白质组多样性的重要机制，是导致真核生物基因和蛋白质数量较大差异的重要原因。
在生物体内，主要存在7种可变剪接类型：A）E某onkipping；B）Intronretention；C)Alternative5'pliceite；D)Alternative3'pliceite；E)Alternativefirte某on；F)Alternativelate某on；G)Mutuallye某cluivee某on。
基因测序的质量控制与评估
基因测序的质量控制与评估近年来，随着高通量测序技术的不断发展及应用，基因测序已经成为基因组学、生物学、医学等领域内不可或缺的重要工具。
然而，在进行基因测序时，数据的质量控制与评估是不可缺少的一环，对保障测序数据的准确性和可靠性具有重要意义。
那么，在进行基因测序时，我们该如何进行质量控制和评估呢？一、数据质量控制数据质量控制是基因测序过程中非常重要的一环，主要目的是在获取样本数据的同时，避免测序产生错误和杂质，保证所得数据的可靠性和准确性。
数据质量控制主要包括以下方面的内容。
1.读长读长是指测序数据中DNA荧光信号的稳定程度，也是判断数据可靠性的一个重要指标。
过短的读长可能导致序列相似度差，过长的读长有可能导致数据无法对齐或引起测序器特定的偏差。
因此，需要对测序数据的读长进行对比和筛选，来保证数据质量。
质量分数是衡量测序品质的指标之一，可用于检测数据中预测错误和杂质。
在测序中产生的碱基质量分数，可以反映出测序片段的准确度。
一般而言，基质量分数越高，代表此测序片段的准确性越高，数据质量也越高。
因此，需要对质量分数进行筛选，以确保测序数据尽可能质量优良。
3.测序深度测序深度是指测序过程中，DNA序列被覆盖的深度统计量，即每个碱基被重复测序的次数。
一般来说，测序深度越高，数据的可靠性就越高。
因此，对于测序过程中的测序深度随时监测、计算和调整，也非常有必要。
二、数据质量评估数据质量评估是对测序数据质量进行综合评估，以确定其可靠性和应用的可行性。
数据质量评估主要从以下方面进行。
质量分析是对样本进行基础统计分析，目的是评估数据质量是否良好。
在质量分析中，我们可以评估样本中数据的均衡性、分析GC流分布等相关指标，以评估数据的可靠性。
2.序列一致性序列一致性是评估片段是否与测序所得标准序列一致的指标。
在测序过程中，替代碱基的出现可能导致序列之间的变异。
因此，对于基因测序数据均需要进行序列比对，以评估序列一致性和错误率等信息。
转录组RNAseq术语解释
RNA-Seq名词解释1.index测序的标签，用于测定混合样本，通过每个样本添加的不同标签进行数据区分，鉴别测序样品。
2.碱基质量值（Quality Score或Q-score）是碱基识别（Base Calling）出错的概率的整数映射。
碱基质量值越高表明碱基识别越可靠，碱基测错的可能性越小。
3.Q30碱基质量值为Q30代表碱基的精确度在99.9%。
4.FPKM（Fragments Per Kilobase of transcript per Million fragments mapped）每1百万个map上的reads中map到外显子的每1K个碱基上的fragment个数。
计算公式为公式中，cDNA Fragments 表示比对到某一转录本上的片段数目，即双端Reads数目；Mapped Reads(Millions)表示Mapped Reads总数，以10为单位；Transcript Length(kb)：转录本长度，以kb个碱基为单位。
5.FC（Fold Change）即差异表达倍数。
6.FDR（False Discovery Rate）即错误发现率，定义为在多重假设检验过程中，错误拒绝(拒绝真的原(零)假设)的个数占所有被拒绝的原假设个数的比例的期望值。
通过控制FDR来决定P值的阈值。
7.P值（P-value）即概率，反映某一事件发生的可能性大小。
统计学根据显著性检验方法所得到的P 值，一般以P<0.05为显著，P<0.01为非常显著，其含义是样本间的差异由抽样误差所致的概率小于0.05或0.01。
8.可变剪接（Alternative splicing）有些基因的一个mRNA前体通过不同的剪接方式（选择不同的剪接位点）产生不同的mRNA剪接异构体，这一过程称为可变剪接(或选择性剪接，alternative splicing)。
可变剪接是调节基因表达与产生蛋白质组多样性的重要机制，是导致真核生物基因与蛋白质数量较大差异的重要原因。
转录组分析学习笔记（持续补充）
转录组分析学习笔记（持续补充）转录组分析流程(有参和⽆参de novo)1. 获得测序数据，Fastq格式，称之为Raw data。
2. 质量检测3. ⽐对Mapping4. Quantification|Quantitation5. 差异表达分析补充：开始项⽬之前，先确⽴合理的⽂件⽬录结构。
【1】Raw Data 处理理论知识⾼通量测序之所以能够能够达到如此⾼的通量的原因就是他把原来⼏⼗M，⼏百M，甚⾄⼏个G的基因组通过物理或化学的⽅式打算成⼏百bp的短序列，然后同时测序。
在测序过程中，机器会对每次读取的结果赋予⼀个值，⽤于表明它有多⼤把握结果是对的。
从理论上都是前⾯质量好，后⾯质量差。
并且在某些GC⽐例⾼的区域，测序质量会⼤幅度降低。
因此，我们在正式的数据分析之前需要对分析结果进⾏质控。
Fastq ⽂件测序给的“原始数据”，称之为Raw Data。
FASTQ是基于⽂本的，保存⽣物序列（通常是核酸序列）和其测序质量信息的标准格式。
其序列以及质量信息都是使⽤⼀个ASCII字符标⽰，最初由Sanger开发，⽬的是将FASTA序列与质量数据放到⼀起，⽬前已经成为⾼通量测序结果的事实标准。
FASTQ⽂件中以四⾏最为⼀个基本单元，并对应⼀条序列的测序信息，各⾏记录信息如下：第⼀⾏记录序列标识以及相关的描述信息，以‘@’开头，为了保证后续分析软件能够区分每条序列，单个序列的标识必须具有唯⼀性；第⼆⾏为碱基序列；第三⾏以‘+’开头，后⾯是序列标⽰符、描述信息，或者什么也不加；第四⾏，是质量信息，长度和第⼆⾏的序列相对应，每⼀个序列都有⼀个质量评分，根据评分体系的不同，每个字符的含义表⽰的数字也不相同。
碱基质量得分与错误率的换算关系： Q = -10log10p（p表⽰测序的错误率，Q表⽰碱基质量分数）ASCII值与碱基质量得分之间的关系：Phred64 Q=ASCII转换后的数值-64Phred33 Q=ASCII转换后的数值-33⽬前illumina使⽤的碱基质量格式为phred+33, 和Sanger的质量基本⼀致（⽼数据建议查看清楚再进⾏后续处理）。
Illumina测序原理
测序工作流程概览
Lion 生成DNA簇
Sequencing 测序
Data Analysis 数据分析
测序过程概览 Sequencing Overview
3’ 5’
DNA (0.1-1.0 ug)
Library preparation
仪器运转；收集信号 实时图片分析；碱基识别；质量评估 离线图片分析
片段组装，序列比较， SNP识别，indel识别，mRNA/miRNA定量
数据的直观展示
ASCII Character Q-score
Sequence
NGS Sequencing Data
PF (0,1)
Read # Index # Y-coord X-coord
Adapter-Modified Ends
Size Select on Gel
300 - 600 bp Fragments
PCR
Amplified DNA with Adapters
QC Library
Genomic DNA Library
生成DNA簇 Cluster Generation
测序芯片 (Flow cell)
diol diol
2nd cycle denaturation
第二次变性
n=25/28 total
循环25~28次
diol
diol diol
2nd cycle extension
第二次延伸
diol
diol diol
2nd cycle annealing
第二次退炎
Lin_Blocking_PrimerHyb
Cluster Generation
Template Hyb Bridge Amplification Lin_Block_Hyb
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Quality Score 二代测序
1. 什么是Quality Score？
Quality Score（质量分数）是在二代测序中用来评估测序数据质量的指标。
在二
代测序中，DNA或RNA样本会被分解成短片段，并通过高通量测序技术进行测序。
每个片段都会被测序仪读取多次，形成一个序列数据集。
Quality Score是对每个测序片段的测序质量进行评估的数值。
它反映了测序片段
的可靠性和准确性，对于后续的生物信息学分析和数据解读至关重要。
2. Quality Score的计算方法
Quality Score是通过测序仪读取测序片段时，对每个碱基进行质量评估得出的。
在二代测序中，常用的Quality Score计算方法有两种：Phred Score和Solexa Score。
2.1 Phred Score
Phred Score是最常用的Quality Score计算方法之一。
它是基于碱基的测序错误
概率计算得出的质量分数。
Phred Score的计算公式如下：
Q = -10 * log10(P)
其中，Q表示Quality Score，P表示碱基的测序错误概率。
Phred Score的取值范围是0到40，数值越高表示测序质量越高，错误概率越低。
2.2 Solexa Score
Solexa Score是Illumina公司独有的Quality Score计算方法。
它也是基于碱基
的测序错误概率计算得出的质量分数。
Solexa Score的计算公式如下：
Q = -10 * log10(P / (1 - P))
其中，Q表示Quality Score，P表示碱基的测序错误概率。
Solexa Score的取值范围是-5到62，数值越高表示测序质量越高，错误概率越低。
与Phred Score相比，Solexa Score在测序质量较低时能够提供更高的分辨率。
3. Quality Score的应用
Quality Score是二代测序中非常重要的指标，它在以下几个方面都有重要的应用：
3.1 数据筛选
Quality Score可以用于筛选测序数据，去除质量较低的片段。
通常会设定一个阈值，只保留Quality Score高于该阈值的片段。
这样可以提高测序数据的可靠性和准确性，减少后续分析的误差。
3.2 错误校正
Quality Score可以用于对测序数据进行错误校正。
通过分析Quality Score，可
以识别并更正测序片段中的测序错误。
这对于后续的基因组组装、变异检测等分析非常重要。
3.3 变异检测
Quality Score可以用于变异检测。
在比对测序数据到参考基因组时，可以利用Quality Score来评估碱基的可靠性。
这有助于准确地识别样本中的变异位点。
3.4 数据解读
Quality Score可以用于帮助解读测序数据。
在进行生物信息学分析时，可以根据Quality Score对测序片段进行质量加权，从而影响后续的数据解读和结果分析。
4. Quality Score的评估标准
Quality Score的评估标准和阈值可以根据具体的实验设计和测序平台进行调整。
通常，较高的Quality Score表示较高的测序质量。
在一般情况下，以下是一些常见的Quality Score评估标准：
•Q20：Quality Score大于等于20，表示测序质量较高，错误概率小于等于1%。
•Q30：Quality Score大于等于30，表示测序质量很高，错误概率小于等于
0.1%。
•Q40：Quality Score大于等于40，表示测序质量非常高，错误概率小于等于0.01%。
根据实际需求，可以根据Quality Score的分布情况和质量要求，制定相应的评估标准和阈值。
5. 总结
Quality Score是二代测序中用于评估测序数据质量的重要指标。
它通过对测序片
段的测序错误概率进行计算，反映了片段的可靠性和准确性。
Quality Score在数
据筛选、错误校正、变异检测和数据解读等方面具有重要的应用。
了解Quality Score的计算方法和评估标准，可以帮助我们更好地理解和分析二代测序数据。
参考文献： 1. Ewing B, Green P. Base-calling of automated sequencer traces using phred. II. Error probabilities[J]. Genome research, 1998, 8(3): 186-194. 2. Heng L. et al. SolexaQA: At-a-glance quality assessment of Illumina second-generation sequencing data[B]. Poster at Plant and Animal Genome XV Conference, San Diego, CA, USA, 2007.。